肠球菌抗原的制作方法

专利名称：肠球菌抗原的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码肠球菌，例如粪肠球菌(Enterococci faecalis)抗原的分离的核酸分子，所述分子适合用于预防和治疗肠球菌引起的细菌感染的药物药剂的制备。
肠球菌是革兰氏阳性细菌，其为人和动物消化道中正常的聚居者。一个世纪以来其业已被认为是传染性心内膜炎的原因{Murray，B.，1990}，且由于作为医源性感染以及手术部位感染的最常见病原体在过去二十年来受到高度重视{Richards，M.等人，2000}。肠球菌作为医源性病原体的日益重要部分归因于其固有的和获得性的抗生素抗性{Murray，B.，1990}；{Rice，L.，2001}。多药抗性肠球菌的治疗对临床医生提出了有力地挑战。{Cetinkaya，Y.等人，2000}；{Gold，H.，2001}，且这类生物作为抗生素抗性基因的潜在储藏库尤其令人关注{French，G.，1998}；{Noble，W.等人，1992}；{Poyart，C.等人，1997}。
肠球菌作为D组链球菌的分类追述到1930年代早期。1984年，在数项研究证实与链球菌的远缘关系后被给出了正式的种属名称分类。肠球菌通常被认为是多种生物(包括人)胃肠道中的共生体。尽管有多于14种的不同肠球菌，粪肠球菌(E.faecalis)和屎肠球菌(E.faecium)是人类中最常见的种类。肠球菌数种固有特征使得所述种属的成员存活更长的时间，造成其存留和医源性传播。肠球菌在去污剂存在下的适应和存留的能力允许其在不充分的清洁方案中存活，造成其在医院的存留。肠球菌固有的粗放性也赋予其对包括氨基糖苷类、β-内酰胺类和喹诺酮类的数种抗生素的不同寻常的耐受水平。例如，肠球菌对氨基糖苷类的耐受源自肠球菌对药物在细胞壁处摄入的阻断。尽管高水平抗性的机制被确定为双功能酶的结果，{Ferretti，J.等人，1986}，肠球菌对低水平氨基糖苷类的内在抗性机制仍待确定。
在肠球菌中，屎肠球菌是独特的，因为其通常用于制备发酵食品，且用作益生菌。近年来，屎肠球菌作为食品发酵微生物不甚被接受，因为担心该细菌可作为向参与人类感染的细菌传递抗生素抗性的中间体宿主。尽管存在上述担心，屎肠球菌仍是乳酸菌发酵的食品中最常见的细菌。已证实许多屎肠球菌的分离物产生杀细菌素(抗微生物肽)，其能够杀死或抑制病原体(如李斯特菌属，梭菌属，杆菌属和葡萄球菌)的生长。这类杀菌素有助于食品发酵的保藏作用，且是所述菌株作为发酵食品生产的出发培养物的一个原因。近来，肠球菌已被成功地用于牛乳腺炎的治疗。
除了食品生产、作为益生菌以及在动物疾病治疗中的应用，最重要的，肠球菌是新出现的人条件病原体。这是由于其固有的病原性潜能，甚至是因为其快速获得抗生素抗性基因的能力。屎肠球菌和粪肠球菌是高百分比的医院获得性感染(包括超级感染)的原因。
肠球菌通常聚集在人类胃肠道中。在人类粪便中较丰富。在肠球菌及其宿主中很可能存在密切相关，否则由于正常的肠道运动所述微生物将消失。许多感染来源的肠球菌分离株为克隆性的，显示医源性传播。此外，许多研究表明在住院后出现患者群居，显示多种抗性菌株的群居是继发感染的易感因子。
医源性肠球菌感染的不易解释之谜之一是在相同种属成员业已占据的生态环境中的容易群居。如前述，缺乏实质上抗肠球菌活性的抗生素(即，对土著肠球菌不具有毒害作用的抗生素)是感染的重要易感因子。所述感染常常由多种抗性肠球菌分离株引起，所述分离株已被外源性获得，且在没有定向选择的情况下显示优于土著肠球菌。
外源性、多重抗性、医源性传播的肠球菌有效群居在胃肠道的事实提示其可能不是直接竞争土著菌株的同一小生态环境。
由肠球菌属引起的感染包括a)菌血症，b)尿道感染，c)眼内炎，d)心内膜炎，以及创伤和腹内感染。大约3/4的感染由粪肠球菌引起，其余由屎肠球菌引起。
a)菌血症
1986年10月-1997年4月间医院监护数据将肠球菌列为第三位最常见的医源性菌血症的病因，占所有分离株的12.8％。肠球菌跨越肠上皮细胞屏障的转位被认为导致了许多无可鉴别来源的菌血症。与肠球菌菌血症的死亡率相关的风险因子包括疾病的严重程度，患者年龄以及广谱抗生素的使用，如第三代头孢类抗生素或甲硝唑。这些研究表明，高水平氨基糖苷类抗性不影响临床结果，但是，粪肠球菌溶细胞素(溶血素)的存在可增强感染的严重程度。
b)尿道感染据估计肠球菌每年在美国造成110,000例尿道感染(UTI)。一些研究业已致力于了解肠球菌与尿路上皮组织的相互作用。已证实质粒编码的聚集性物质在肠球菌与肾上皮细胞吸附中的潜在作用。携带外激素应答性质粒pAD1或其同源基因衍生物的粪肠球菌比不含质粒的细胞能够更好的结合于培养的猪肾小管细胞系LLC-PK。他们的研究结果显示含有纤连蛋白基序Arg-Gly-Asp-Ser的合成肽能够抑制结合。所述结构性基序介导纤连蛋白与整合素家族真核表面受体的相互作用。
c)眼内炎宿主组织的聚居在眼内炎的发病中起重要作用。肠球菌作为最具有破坏性因子之一引起白内障手术的手术后并发症。设计用于确定是否靶定粪肠球菌的物质改变眼内解剖结构的实验表明，肠球菌附着于玻璃体的膜结构，但是所述吸附不依赖于聚集物质是否存在。
d)心内膜炎在肠球菌引起的多种感染中，传染性心内膜炎(IE)是最具有治疗挑战性的之一。肠球菌是传染性心内膜炎的第三位致病因素，占天然瓣膜IE病例中的5-20％，人工瓣膜心内膜炎的6-7％。外激素应答性质粒pAD1的存在增强了肠球菌性心内膜炎的“植被类型”(vegetationformation)。来自带有粪肠球菌的心内膜炎患者的血清用于鉴别在血清中选择性表达而不在培养基中表达的抗原{Lowe，A.等人，1995}。所述蛋白质抗原称为EfaA，具有与数种肠球菌粘附相似的广泛序列，且可能作为重要的心内膜炎吸附素。
氨苄青霉素是肠球菌感染的治疗选择。对于严重肠球菌感染，特别是心内膜炎，氨基糖苷类作为与青霉素或氨苄青霉素组合治疗的一部分非常重要。尽管肠球菌固有的耐受低水平的氨基糖苷类抗生素，针对氨基糖苷类的细胞壁抑制剂的添加导致通过两种抗生素协同作用增加的杀伤。随着对氨基糖苷类和青霉素类高水平抗性的增加，万古霉素成为可用于肠球菌感染的唯一选择。随后，1988年在肠球菌临床分离株中报道了万古霉素抗性，随后是由万古霉素抗性肠球菌(VRE)引起的爆发。在美国医院中，医源性肠球菌对万古霉素抗性的百分比从1989年的0.3％增加到1993年的7.9％。在重症监护室中患有医源性感染的患者中，增加更为明显从1989年的0.4％至1993年的13.6％，在四年期间增加了34倍。
除了较高的死亡率之外，万古霉素抗性肠球菌感染造成平均约$25,000的额外治疗费用，同时延长了一倍的患者住院时间。
尤其是在粪肠球菌分离株中万古霉素抗性的急剧增加，表明感染在未来提出越来越多的挑战。一直显见的治疗替代方案是接种疫苗，旨在诱导防止或减轻感染的保护性免疫反应。
由于缺乏关于针对肠球菌感染的保护性免疫元件的足够知识，疫苗的开发受到阻碍。有报道称中性粒细胞介导的肠球菌杀伤是对抗体的主要补充，所述抗体起到不甚关键但是潜在的重要作用，尽管最近报道了关于抗肠球菌抗体通过调理吞噬杀伤在促进清除中的重要性之额外证据{Gaglani，M.等人，1997}。
针对肠球菌的人免疫中表面蛋白的重要性也已知晓。似乎所有的临床分离株表达具有与宿主免疫防御相关的活性之表面蛋白。肠球菌表面蛋白(Esp){Shankar，V.等人，1999}，明胶酶，溶细胞素{Haas，W.等人，2002}和聚集物质(AS)表面蛋白{Sussmuth，S.等人，2000}已被生物化学和遗传学充分表征，显示为免疫原性的{Xu，Y.等人，1997}。在传染性心内膜炎的动物模型中，针对聚集物质的特定抗体仍不是保护性的{McCormick，J.等人，2001}。
因此，仍旧需要预防和缓解肠球菌感染的有效治疗。能够显示针对引起人类感染的主要肠球菌菌株的交叉保护作用之疫苗可用于防止或缓解由所有其他肠球菌种属，即粪肠球菌和屎肠球菌引起的感染。
疫苗能含有全部的各种不同的抗原。抗原的实例是完全杀死的或减毒的生物体、这些生物体/组织的亚组分、蛋白质或者它们最简单的形式肽。抗原也能以糖基化蛋白质或肽的形式被免疫系统识别，也可以是或含有多糖或脂质。能使用短肽，因为例如细胞毒性T细胞(CTL)识别连接于主要组织相容性抗原(MHC)的通常8-11个氨基酸长的短肽形式的抗原。B细胞能识别短到4-5个氨基酸的线性表位以及三维结构(构象表位)。为了获得持续的抗原特异性免疫反应，佐剂需要激发包括免疫系统所有细胞的免疫级联。起初，佐剂起作用，但是不限于它们对所谓抗原递呈细胞(APC)的作用的模式。这些细胞通常最先遇到抗原，之后是加工的或未修饰的抗原呈递给免疫效应细胞。也可以涉及中间细胞类型。只有有适当特异性的效应细胞在生产免疫反应中被激活。佐剂也可以局部保留抗原和共注射的其他因子。另外，佐剂可以起其它免疫细胞的化学趋化剂的作用，或者可以在局部和/或全身起免疫系统刺激剂的作用。
目前，针对肠球菌的疫苗仅处于开发的研究阶段。研究不仅致力于荚膜多糖(CPS)作为免疫原(Hueber，J.等人，2000)，也致力于毒力因子和膜/表面蛋白。
蛋白质偶联疫苗的开发无疑是抗肠球菌疾病战斗增加的一个伟大的新武器，但是疫苗仅含有有限数量的肠球菌蛋白质，给与足够的生态学压力，致病源变化及非疫苗临床分离株的质粒仍然是真正的威胁。此外用于活性免疫的多糖抗原在人类中不提供免疫记忆。CPS与非肠球菌相关免疫原性蛋白质载体结合(例如，破伤风类毒素、霍乱毒素B亚单位等等)已经显示在诱导疫苗接种者更高的抗体浓度是有利的，但是它不提供在真正的感染过程中招募记忆B和T细胞以支持最有效宿主反应的病原体特异性B细胞和T细胞表位。为了能够用符合这些标准的蛋白质补充肠球菌疫苗，鉴别保守免疫原性肠球菌特异性表面蛋白质是必须的。
基于被动抗体的治疗有很大的潜力。为了预防已经尝试使用人类静脉内免疫球蛋白(IVIG)的制备物。单克隆抗体生产技术的最新进展提供了产生人类抗体试剂和再引入抗体治疗的方法，而避免与血清治疗相关的毒性。免疫球蛋白是极端多样类型的抗微生物蛋白质，能用于预防和治疗出现的感染疾病。抗体治疗抵抗各种不同的微生物是有效的({Burnie，J.等人，1998}的综述)。抗肠球菌的单克隆抗体能治疗性地给予每一个由于器官移植、癌症、HIV感染和其他原因的免疫抑制患者。
展示在显著造成疾病发生的革兰氏阳性生物体表面上的某些蛋白质或酶参与了这些病原体引起的疾病过程。通常，这些蛋白质参与了与宿主组织直接的相互作用或隐藏细菌表面以逃脱宿主防御机制{Navarre，W.等人，1999}。粪肠球菌在这点上并不例外。一些表面蛋白质作为对肠球菌致病性重要的毒力因子已被鉴别，综述见{Jett，B.等人，1994}。如果抗这些蛋白质的抗体对人类能提供比多糖更好的保护，它们能提供新型基于蛋白质的肠球菌疫苗的来源以联合或替代更加传统的荚膜多糖疫苗而使用。一些作为可能疫苗的抗原以及许多额外候选的上面描述的蛋白质的用途主要由基于鉴别的容易或可获得的机会的挑选产生。以更加全面的方式鉴别粪肠球菌相关抗原是有需求的。
本发明者已经开发了从特异性病原体尤其是从金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)鉴别、分离和生产超免疫血清反应性抗原的方法(WO02/059148)。然而，考虑到生物特性、致病功能和遗传背景的不同，粪肠球菌与葡萄球菌株截然不同。为了鉴别相关血清来源，从健康成人以及从患有肠球菌感染的患者和幼稚个体(5月龄-10月龄之间的年幼儿童，在其丧失母体抗体之后，作为阴性对照)中收集三种主要类型的人血清。将高百分比的个体暴露于能够在宿主中诱导抗体之环境中的肠球菌。主要在医院中发生的疾病可能与低水平的针对肠球菌的特异性抗体相关，因此不甚有效被吞噬细胞性消除。为了能够挑选合适的筛选剂，用细菌裂解物和培养上清蛋白质进行了测量抗粪肠球菌IgG抗体水平的一系列ELISA和免疫斑点实验。来自高滴度个体的血清包括在基于基因组的抗原鉴别。
两个细菌种-粪肠球菌和金黄色葡萄球菌的基因组本身显示了许多重要的不同。粪肠球菌的基因组含有大约3.22Mb，而金黄色葡萄球菌有2.85Mb。它们分别具有37.5％和33％的平均GC含量，两个病原体之间大约1/3的编码基因不同。另外，对于增殖两个细菌种类需要不同的生长条件和培养基。两个病原体造成的最重要疾病的列表显示如下。金黄色葡萄球菌主要引起医院的机会性感染脓疱病、毛囊炎、脓肿、疖子、感染的伤口、心内膜炎、脑膜炎、脓毒性关节炎、肺炎、骨髓炎、皮肤烫伤综合症(SSS)、毒性休克综合症。粪肠球菌主要引起根据多数测量认为不是高度毒性、高度侵入性或高度传染性的感染。尽管如此，其仍引起相当多的人类疾病，如菌血症、尿路感染、心内膜炎和腹腔内感染。
粪肠球菌V583(万古霉素抗性临床分离株)的完整基因组序列通过随机鸟枪法测序方法测定(GenBank关于染色体和质粒的登录号如下AE016830(染色体)，AE016833(pTEF1)，AE016831(pTEF2)，AE016832(pTEF3))；见www.tigr.org/tigrscripts/CMR2/CMRHomePage.spl).{Paulsen，I.等人，2003}。
测定了带有预期基因组大小为2.8Mbp的粪肠球菌菌株DO(ATCC BAA-472，TEX16，TX0016)的完整基因组序列。该基因组目前在Baylor College of Medicine′s人类基因组测序中心和University ofTexas Center病原体出现与再出现研究组(CSERP)进行计算机处理和标注；见www.hgsc.bcm.tmc.edu/microbial/Efaecium/。
本发明潜在的难题是提供开发例如抗粪肠球菌感染疫苗的药剂的方法。更加特别地，所述难题需提供能用于生产所述药剂的一套有效、相关和全面的来自粪肠球菌的核酸分子或超免疫血清反应性抗原。
所以，本发明提供了编码高免疫反应血清反应抗原或其片段的分离的核酸分子，包含如下核酸序列，选自a)与选自Seq ID No 1-2，4-8，10，12-18，20-23，25-26，29-43，45-62，64-74，76-77，79-83，85-89，91-92，94-114，117-126，128-146，148-170，373，375，379-381，387，392，394，397-399，407-408，410-411和415-424的核酸分子至少具有70％序列相同性的核酸分子，b)互补于a)的核酸分子的核酸分子，c)包含a)或b)的核酸分子至少15个连续碱基的核酸分子d)在严格杂交条件下退火于a)、b)或c)的核酸分子的核酸分子e)由于遗传密码的简并性，否则将杂交于a)、b)、c)或d)中定义的核酸分子的核酸分子。
根据本发明的优选实施方案，序列相同性是至少80％，优选地至少95％，尤其是100％。
此外，本发明提供了编码超免疫血清反应性抗原或其片段的的分离的核酸分子，包含如下核酸序列，选自a)与选自Seq ID No 3，9，11，24，27，44，63，75，84，115-116，127，374，376-378，382-386，388-391，393，395-396，400-406，409和412-414，的核酸分子至少具有96％或高于96％，优选地至少98％，尤其是100％序列相同性的核酸分子，b)互补于a)的核酸分子的核酸分子，c)包含a)或b)的核酸分子至少15个连续碱基的核酸分子d)在严格杂交条件下退火于a)、b)或c)的核酸分子的核酸分子e)由于遗传密码的简并性，否则将杂交于a)、b)、c)或d)中定义的核酸分子的核酸分子。
根据另一个方面，本发明提供了编码超免疫血清反应性抗原或其片段的分离的核酸分子，包含如下核酸序列，选自a)选自Seq ID No 90，147的核酸分子，b)互补于a)的核酸的核酸分子，c)由于遗传密码的简并性，否则将杂交于a)、b)、c)或d)中定义的核酸分子的核酸分子优选地，核酸分子是DNA或RNA。
根据本发明优选的实施方案，核酸分子从尤其是粪肠球菌基因组DNA的基因组DNA分离。
根据本发明，提供了包含根据本发明的任一核酸分子的载体。
在优选实施方案中，载体经改造以适于根据本发明的核酸分子编码的超免疫血清反应性抗原或其片段的重组表达。
本发明也提供了包含根据本发明的载体的宿主细胞。
根据另一方面本发明进一步提供了包含根据本发明的核酸分子编码的氨基酸序列的超免疫血清反应性抗原。
优选的实施方案中，氨基酸序列(多肽)选自Seq ID No 171-172，174-178，180，182-188，190-193，195-196，199-213，215-232，234-244，246-247，249-253，255-259，261-262，264-284，287-296，298-316，318-340，425，427，431-433，439，444，446，449-451，459-460，462-463和467-476。
另一优选实施方案中氨基酸序列(多肽)选自Seq ID No 173，179，181，194，197，214，233，245，254，285-286，297，426，428-430，434-438，440-443，445，447-448，452-458，461和464-466。
进一步优选的实施方案中，氨基酸序列(多肽)选自Seq ID No260，317。
根据另一方面，本发明提供了选自包含表1a和表1c“推定的免疫原性氨基酸”和“鉴别的免疫原性区域位置”纵栏的氨基酸序列的超免疫血清反应性抗原之片段，表2的血清反应性表位，尤其是包含选自如下氨基酸的肽4-10，14-21，30-36，59-68，77-82，87-93，96-105，112-121，125-133，135-141，150-162，164-183，192-203，207-213，215-226，228-234，241-247，250-285，302-308和135-148位的Seq ID No 171；15-57，60-73，77-101，108-134，136-177，185-201，203-217，226-240，244-254，272-277，283-288，292-343，354-370，380-398，406-437,439-453，473-490，532-538，584-590，595-601，606-612，664-677，679-704，715-724，731-753，759-772，786-794，814-862和657-684位的Seq ID No 172；4-9，15-36，41-47，54-60，75-81，114-120，131-146，152-158，174-182，194-202，208-215，218-226，255-271，276-285，290-295，302-311，318-328，330-344，352-359，365-377，388-395，398-405，426-432，439-449，455-500，505-513，531-537，542-552，554-561，587-595，606-612，718-734，763-771，775-782，792-801，805-812，822-828，830-843，849-863，876-894，905-911，919-926，935-947，949-958，968-979，1009-1016，1029-1045，1047-1056，1076-1081，1092-1106，1123-1133，1179-1200，1202-1211，1215-1223，1287-1299，1301-1306，398-431和1224-1237位的Seq ID No 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180；14-43，70-76，83-89，111-117，122-128，136-145，163-170，175-182，210-219，246-251，266-279，325-331，338-346，348-354，356-363，368-379，422-428，431-441，450-456，466-473，509-515，532-542，549-556，576-586，605-612，617-623，636-653，660-667，674-686，698-719，726-731，738-745，762-783，818-828，836-843，856-862，871-881，903-910，917-922，935-941，956-968，976-986，1013-1024，1026-1038，1059-1069，1071-1081，1102-1115，1118-1126，1131-1145，1164-1176，1187-1200，1202-1208，1221-1227，1236-1245，1248-1267，1273-1292，252-287和805-844位的Seq ID No 181；4-18，21-28，37-43，56-70，101-113，131-140，142-150，162-170，172-184，193-204，209-227，233-238，246-264和93-168位的Seq ID No 182；14-20，44-50，61-70，77-96，99-106，129-142，168-181，187-196，205-221，225-241，277-296和257-281位的Seq ID No 183；18-29，43-54，64-76，78-84，88-103，125-149，159-176，198-218，230-242，256-271，279-285，287-293，300-306，325-331，344-351，357-364，371-397，400-414，419-464，485-515，517-526，529-537，548-553，573-580，584-590，603-620，639-661，676-681，687-700，716-761，772-780，785-790，795-803，823-836，848-853和106-134位的Seq ID No 184；7-13，19-42，44-51，55-75，87-97，99-110，112-118，129-135，141-156，158-178，213-220，230-286，294-308，323-338，345-352，355-365，370-392，394-419，437-446，454-460，474-497，515-526，528-546，569-575和128-141位的Seq ID No 185；12-20，24-33，45-70，73-84，86-94，103-116，118-124，135-142，163-170，176-200，202-224，226-234，237-248，250-262，265-287，296-307，334-341，347-356，361-369，382-396，405-415，418-427，431-439，443-449，452-461，467-474和113-146位的Seq ID No 186；13-38，44-50，52-59，66-72，83-94，103-110，116-124，131-137，158-180，199-204，218-233，241-264，269-317，326-342，350-356和70-86位的Seq ID No 187；29-35，49-59，63-84，86-97，103-111，113-126，130-144，150-158，174-198，221-231，250-264，266-273，291-298，310-318和70-90位的Seq ID No 188；19-25，28-52，60-66，71-76，131-142，149-155，157-178，181-213，218-223，237-242，250-257，260-266，272-279，282-290，321-330，373-385，393-407，441-453，461-475，509-521，529-542，577-589，597-610，643-655，663-677，703-718，729-734，358-464，495-570和604-685位的Seq ID No 189；4-29，51-76，116-136，158-173，179-193，207-215和86-111位的Seq ID No 190；5-23，45-70，79-90，93-107，114-122，142-151和18-36位的Seq ID No 191；9-51，68-120，133-149，158-180，186-206，211-220，222-237，248-293，296-310，317-339和248-260位的Seq ID No 192；14-24，44-63，69-98，108-119，123-136，155-161，164-176，180-193，203-208，215-223，239-247，274-281，283-289，296-304，306-313，315-327，331-341，343-353，357-386，392-405和205-246位的Seq ID No 193；5-13，16-23，36-42，53-63，70-83，96-102和14-34位的Seq ID No 194；4-13，19-35，49-56，59-76，83-107，121-134，144-153，157-164，166-186，194-202，209-216，231-253，257-264和98-134位的Seq ID No 195；16-32，38-47，58-68，78-89，98-114，117-123，132-141，146-156，164-170，179-188，196-212，219-230，232-237，244-263，265-274，278-293，297-303，306-326，339-349，352-359，362-367，373-379，384-394，396-406，423-443，451-461，465-484，490-497，504-511，523-533，537-547，550-556，558-566，573-579，586-593，598-609，615-642，647-665，671-686，693-713，723-728和332-378位的Seq ID No 196；6-21，34-44，58-64，66-74，79-87，114-127，129-143，154-162，174-189，205-214，241-262，266-273，278-297，319-324，328-338，342-351，390-398，409-415，422-435，458-464，471-477，481-486，506-531，534-540，542-550和315-389位的Seq ID No 197；4-28，39-45，52-58，69-82，93-115，122-128，135-140，146-163，177-192，209-215，221-232，271-284，331-337，341-352，360-378，383-390，392-401，409-422，428-435，462-470，474-480，482-496，531-539，541-549，551-560，562-569，576-582，598-618和98-127位的Seq ID No 198；14-27，33-47，61-79，94-104，119-133和36-60位的Seq ID No 199；11-22，29-40，48-62，68-73，96-106，108-118，125-149和102-126位的Seq ID No 200；4-11，45-55，76-83，86-102，105-112，138-144，147-153和20-48位的Seq ID No 201；12-20，28-56，62-68，72-82，93-99，101-107，120-133，135-145，178-186，208-232，279-292和36-64位的Seq ID No 202；6-14，23-48，65-82，92-134，140-181，188-219，228-238，244-253，255-261和124-145位的Seq ID No203；11-25，31-38，53-59，62-71，89-99，125-133，151-157，182-190，195-203，208-215，219-229，249-262，267-275，287-295，298-316，318-325，328-334，344-353，357-363，371-377，385-391，396-415，425-436，438-457，471-485，538-552，554-561，606-625，630-636，646-653，669-679，695-704，706-715，722-747，763-773和714-738位的Seq ID No 204；10-29，33-45，50-60，70-79，83-95，118-124，136-157，176-184，192-205，207-216，223-234，240-246，258-268，275-283和37-56位的Seq ID No 205；4-24，27-38，46-54，66-72，81-97，112-119，128-137，152-157，173-179，185-214，219-225，227-248，262-284，286-295，301-307和117-134位的Seq ID No 206；26-43，49-56，60-71，74-82，87-98，110-116，131-146，154-164，169-178，183-189，205-214，241-246，255-268，275-292，305-314，316-323，326-340，346-363，397-402，419-429，440-446，452-461，467-475和29-66位的Seq ID No 207；7-16，21-39，48-58，61-78，82-89，109-136，138-150，152-176，182-247，255-261，267-332，336-345，347-358，362-368，371-392，394-404，407-472，490-498，505-513，527-544，554-582，603-611，614-620，632-638和500-523位的Seq ID No 208；24-46，77-83，90-97，99-118，123-166，168-177，204-212，229-239，248-262，273-282，287-293，300-319，321-337，340-352，357-366，391-402，411-428，442-450，464-471，479-489和19-40位的Seq ID No 209；9-23，25-34，53-58，70-86，90-97，99-116，118-128，131-141，185-191，228-233，237-253，255-261，264-271，273-280，302-312，319-349，351-359，362-369，376-383，387-394，398-406，419-434和20-31位的Seq ID No 210；15-22，37-43，71-87，105-115，121-127，135-142，152-158和32-52位的Seq ID No 211；6-12，18-29，37-47，50-58，65-83，85-91，94-99，108-123，142-150，156-163，183-193，215-222，242-249，252-258，261-270，285-308，318-326和1-95位的Seq ID No 212；9-61，65-133，144-155，166-173，175-221，233-276，278-313，329-368和210-233位的Seq ID No 213；11-29，33-39，46-51，65-93，107-113，134-143，147-154，166-177，181-188，214-220，233-243，263-269和112-128位的Seq ID No 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221；8-18，44-76，102-109和49-57位的Seq ID No 222；5-14，28-40，42-51，54-60，77-83，89-100，117-124，146-172，176-204，216-231，237-244，267-278，324-334，342-348，396-401，427-433，438-450，452-457，465-471，473-481，491-500，509-515，523-544，550-556，558-569，589-595，606-618，625-632，640-649，665-671，678-688，691-698，717-723，728-734，781-789，800-805，812-821，833-868，873-879，889-905，929-939，988-998，1046-1061，1073-1079，1089-1096，1115-1124，1132-1140，1172-1196，1220-1226，1231-1249，1269-1277，1287-1301，1307-1330，1350-1361，1369-1378，1387-1412，1414-1420，1422-1439，1484-1491，1513-1529，1552-1561，1576-1583，1606-1613，1617-1640，1647-1654，1665-1679，1686-1698，1709-1727，1736-1743，1750-1757，1771-1790，1801-1807，1817-1823，1831-1842，1859-1868，1870-1882，1884-1891，1900-1906，1909-1914，1929-1935，1952-1960，1974-1988，2002-2011，2032-2063，2071-2081，2116-2124，2139-2147，2149-2159，2163-2190，2209-2215，2245-2253，2282-2287，2331-2342，2360-2370，2379-2393，2402-2408，2414-2421，2423-2430，2433-2439，2442-2450，2472-2478，2485-2493，2495-2503，2506-2512，2547-2554，2558-2564，2615-2625，2637-2652，2692-2698，2700-2706，2711-2723，2731-2740，2748-2753，2756-2762，2765-2772，2781-2798，2810-2824，2844-2852，2885-2899，2912-2922，2937-2944，2947-2970，2988-2998，3016-3025，3032-3037，3062-3071，3129-3148，3156-3161和530-607位的Seq ID No 223；31-36，57-62，79-85，90-96，99-112，120-146，162-185，193-203，208-217，219-226，239-253，283-290，298-304，306-321，340-349，351-361，365-372，386-395，407-438，473-486，537-551，558-568，576-594，598-604和75-95位的Seq ID No 224；14-19，24-30，34-42，45-52，54-64，66-82，95-105，107-118，126-163，171-177，184-201，210-215，260-269，273-279，288-304，321-327，358-364，370-375，380-387，394-404，407-413，421-431，436-451，465-474，504-511，531-552，578-587，614-626，629-636，638-671，691-715，719-729，733-745，752-759，768-777，785-792，794-802，805-824，844-854，867-880，885-891，893-902，907-924，939-948，955-964，966-975，987-1000，1012-1017，1023-1028，1050-1071，1083-1098，1102-1115，1133-1146，1170-1183，1204-1211，1213-1223，1262-1311，1313-1319，1346-1355，1366-1371，1383-1405，1409-1414和776-819位的Seq ID No 225；12-27，30-38，54-61，64-74，82-96，103-110，117-125，134-140，147-158，185-201，218-225，232-253，265-280，319-325，350-362，366-372，376-386，464-483，485-490，511-521，531-537，542-559，564-574，593-609，613-619，637-642，668-677和195-214位的Seq ID No 226；4-21，59-67，73-79，84-91，141-151，186-197，203-214，222-227，237-245，255-260，281-292，294-311，336-344，346-355，422-437，459-466，484-491和77-109位的SeqID No 227；10-45，52-61，63-70，74-102，112-122，124-132，164-178，181-205，212-240，246-256和226-247位的Seq ID No 228；38-50，53-63，78-87，89-111，126-152，169-176，179-186，193-228，254-267，275-282，288-304，309-318，325-341，346-353，358-367，384-395，404-427，429-435，456-465，467-501，510-521，523-536，541-548，552-560，563-584，589-595，597-620，625-637，639-645，661-666，712-729，734-741，743-750，775-806，809-816，818-840，842-850和693-714位的Seq ID No 229；5-17，30-37，52-75，77-86，88-107，112-135，151-160，178-222，226-246，263-270，279-294，306-314，327-342，345-352，374-381，389-416，422-429，435-449，453-467，473-500，512-522，524-531，542-549，552-560，565-571，575-586，594-600，613-619，625-633，635-641，647-653，667-674，680-699，711-729，735-741，764-775，781-786，792-798，805-813，817-825，833-842，850-855，860-866，869-910，917-930，949-990和533-562位的Seq ID No 230；7-14，39-46，61-74，83-89，93-99，110-121，136-150，172-180，182-200，207-216，223-236，238-251，265-271，280-288，294-309，320-336，339-354，362-377，383-389，401-407，435-441，446-453，460-465，472-487，499-511，518-528，533-540，557-570，572-587，631-637，643-658，663-669，672-678，681-687，695-706，714-728和118-139位的Seq ID No231；5-19，24-30，56-64，69-79，93-100，102-111，117-123，125-133，174-182，185-199，205-224，268-275，311-336和102-125位的Seq ID No232；6-35，39-45，57-62，80-85，92-106，117-122，126-171，214-223，253-260，268-273，285-291，295-306，315-320，325-336，361-366和172-202位的Seq ID No 233；4-13，24-37，45-51，58-66，84-92，112-121，132-141，151-171，175-195，204-212，222-240，262-268，276-295，305-336，338-348，354-362和160-183位的Seq ID No 234；10-16，24-35，41-73，78-104，111-121，124-139，141-148，150-164，196-215，224-241，249-282，299-307，315-357，368-378，393-401和345-367位的Seq ID No235；4-32，48-53，61-67，84-104，112-118和106-130位的Seq ID No 236；21-28，31-36，65-81，98-105，115-121，123-131，136-142，155-161，177-190和201-232位的Seq ID No 237；4-15，21-27，33-39，42-56，58-64，68-82，84-90，92-98，113-122，146-162，168-175，177-189，191-203，249-268，279-285，287-304，328-342，349-358，371-378，387-393，404-413，419-425，467-479，487-498，513-524，528-539，541-565，572-579，595-606，626-635，637-642和612-626位的Seq ID No 238；7-13，52-70，76-82，97-106，110-117和13-45位的Seq ID No 239；5-10，12-48，59-64，87-102，107-128，131-140，154-161，165-171，173-215和54-74位的Seq ID No 240；4-11，19-28，34-40，74-81，87-98，126-147，163-171，184-193，205-213和49-124位的Seq ID No 241；7-14，23-29，35-40，61-67，99-106，111-122，124-133，135-161，187-206，216-229，236-245，262-268，271-280和256-273位的Seq ID No 242；4-13，17-37，47-54，85-99，105-113，120-132，147-166，180-186，192-199，204-216和127-144位的Seq ID No 243；14-27，29-37，52-62，68-76，89-96，117-123，125-131，137-145，166-195，205-212，214-222，228-235，258-264，271-281，288-296，308-324，332-339，355-361，365-371和268-293of Seq ID 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431；23-36，42-52，133-140，151-157，242-247，267-277，295-301，320-328，333-339，345-352，365-371，397-403，415-428，456-465，481-487，489-495，508-516，518-527，585-592，606-614，631-637，643-658，665-670，723-728，737-744，752-759，787-793，835-841，873-885，918-928，938-945，951-966，978-988，1015-1020，1030-1036，1044-1052，1058-1069，1071-1079，1081-1088，1113-1119，1125-1138，1141-1147，1164-1170，1172-1177，1190-1200，1214-1220，1230-1236，1239-1245，1262-1268，1270-1275，1288-1298，1312-1318，1328-1334，1337-1343，1360-1366，1368-1373，1386-1396，1410-1416，1426-1432，1435-1441，1458-1464，1466-1471，1484-1494，1508-1514，1524-1530，1533-1539，1556-1562和307-340位的Seq ID No 432；19-25，35-41，44-50，66-72，74-79，92-102，116-122，132-138，141-147，164-170，172-177，190-200，214-220，230-236，239-245，262-268，270-275，288-298，312-318，328-334，337-343，360-366，368-373，386-396，410-416，426-432，435-441，458-464，466-478，504-524，79-148，177-246，275-344和373-442位的Seq ID No 433；7-14，16-23，33-39，46-53，72-79，92-115，123-130，156-175，179-187，214-220，239-246，266-274，302-325，338-354，360-370，375-390，392-401，421-428，430-463和29-58位的SeqID No 434；4-9，22-39，58-65，72-82，87-92，99-104，107-119，143-166，171-177，194-202，205-213，220-228，231-240，247-263，309-315，317-323，336-343和294-320位的Seq ID No 435；4-10，12-18，24-29，34-43，50-65，70-76，111-117，129-138，152-159，166-171，184-195，200-210，224-236，241-251，274-283，285-296，313-319，332-341，348-355，378-386，410-416，433-445，475-482，523-529，531-540，584-596，626-633，674-680，682-688，738-750，780-787，828-834，836-842，853-862，882-887，893-912和604-676位的Seq ID No 436；15-38，49-57，60-99，103-119，124-194，200-206，215-249，251-291，307-313，315-347，369-378，383-390，393-400，405-411，423-435，440-447，454-460，470-486，490-503，532-539，542-549，551-567，579-592和509-583位的Seq ID No 437；38-44，47-88，95-103，157-172，235-240，250-260，263-276，294-300，312-317，331-337，369-391，412-419，442-448，453-463，490-529，537-555，571-580，600-617，619-627，642-648，682-687，693-700，716-722，738-748，756-763，779-789，796-802，820-828，833-840，846-853，862-872，880-887，894-899，924-937，957-963，1006-1012，1043-1049，1063-1069，1076-1097和124-147位的Seq ID No 438；4-28，31-49，60-71，75-102，104-114，134-144，160-184，250-257，277-285，287-294，330-338，345-351，367-374，381-388，393-399，402-407，420-426，443-448，458-464，411-436和454-488位的Seq ID No 439；20-27，45-55，57-64，66-77，98-106，130-137，155-165，167-174，176-187，194-203，208-223，227-238，245-251，257-270，273-278，287-299，330-345，352-358，363-385，392-399，410-417，437-443，467-484，486-492，495-500，504-516，526-536和219-270位的Seq ID No 440；11-22，24-31，46-63，65-71，73-88，95-109，174-181，183-201，204-212，216-222，228-233，241-247和142-221位的Seq ID No 441；8-28，51-59，67-84，93-98，140-152，154-162，183-188和91-125位的Seq ID No 442；10-22，27-61和69-100位的Seq ID No 443；7-15，18-26，94-100，126-131，152-165，219-228，254-263，274-292，297-308，333-340，342-352，354-371，373-379，403-410，420-438，450-456，463-470，489-495，503-512和97-173位的Seq ID No 444；4-21，37-43，49-65，67-74，76-90，113-119，131-141，155-173，175-189，192-199，207-221，247-254，266-276，317-322，337-343，387-393，408-428，439-448，451-460，469-479，482-487，493-501，517-523，533-542和480-503位的Seq ID No 445；11-26，40-46，78-86，93-103，121-126，132-138，166-177，183-196，203-212，214-221，228-263，304-311，323-338，345-351，357-363，379-393，420-434，442-448，518-527，547-553，581-591，602-609，637-645，665-674，687-692，701-708，730-739，796-802，844-857，882-888，903-914，944-950，976-983，1027-1033，1049-1057，1066-1072，1085-1092，1120-1127，1137-1144，1153-1158，1165-1176，1181-1187，1221-1230，1238-1244，1269-1274和605-632位的Seq ID No 446；6-47，57-65，83-95，109-121，138-147，154-164，167-177，194-200，202-212，227-234，240-253，260-267，283-291，320-329，340-347，356-364，412-422，430-436，441-459，465-475，478-486，498-507和59-84位的SeqID No 447；10-21，58-83，88-97，120-126和21-51位的Seq ID No 448；5-39，56-62，76-88，90-114，138-162，170-195，202-221，228-250，264-270，304-355，374-387，391-416，462-471，526-546，554-561，574-579，639-645，651-660，674-682，689-694和666-697位的Seq ID No 449；6-30，36-42，143-157，176-197，202-209，216-233，241-246，275-287，292-299，315-325，343-350，375-380，397-403，411-420，422-434，441-448，467-474，477-499，555-568，591-597，601-609，623-644，667-688，692-698，703-718，736-747，757-766，782-791，795-801，832-840，859-865和226-269位的Seq ID No 450；6-23，43-51，61-67，73-82，91-97，123-130，149-158，164-175，228-234，240-246，248-255，262-272，326-332，340-347，365-371，377-388，409-419，425-431，438-445，449-457，464-470，496-507，559-568，575-581，603-608，617-623，633-639，648-654，659-670，695-701，734-752，806-814，816-829，861-868，891-899，904-909，937-945，947-960，978-983，992-999，1022-1031，1068-1076，1078-1091，1109-1114，1123-1130，1153-1162，1199-1207，1209-1222，1254-1261，1284-1293，1330-1338，1340-1353，1371-1376，1385-1392，1415-1421，1433-1438，1460-1465，1470-1492和1422-1458位的Seq ID No 451；82-94，111-118，125-131，206-212，261-266，310-320，328-338，345-351，353-360，414-420，424-434，440-447，451-500，506-516，548-561，566-572，584-591，601-622，630-636，650-659，661-667，674-699，703-711，717-729，736-744，752-759，765-771，813-822，826-842，852-868，870-877，881-895，897-906，913-922和602-671位的Seq ID No 452；12-18，20-25，43-54，56-65，73-79，82-88，99-111，136-142，153-169，171-183，195-223，229-248，255-260，272-277，281-292，298-319，322-329，332-351，363-379，381-389和275-304位的Seq ID No 453；4-9，34-48，65-77，101-106，111-131，138-153，186-191，230-250和148-219位的Seq ID No454；4-23，30-35，42-53，67-76，82-87，101-108，112-130，132-138，147-152，161-183，187-208，218-225，265-283，295-303，306-317，322-334，338-357，360-368，370-383，387-398，400-419，421-430，104-182和240-304位的Seq ID No 455；4-12，63-69，94-102，146-164，166-173，175-181，193-207，263-281，286-295，301-306，330-343，369-378，382-388，414-420，422-430，438-454，456-462，472-531，543-560，581-591，596-605，614-623，626-635，656-662，669-676，683-690，693-698，705-711，728-736，752-764和69-102位的Seq ID No456；6-12，43-53，141-147，164-179，185-195，197-206，227-235，237-271，288-305，308-317，335-341，351-357，365-376，386-395，397-416，422-447和11-35位的Seq ID No 457；16-24，50-65，73-84，88-99，114-124，130-146，181-187，193-203，214-220，236-247，250-258，287-297和50-113位的Seq ID No 458；4-25，50-55，76-82，117-123，131-137，139-148，157-166，239-245，253-258，266-275，277-292，300-306，51-83和93-161位的Seq ID No 459；6-22，34-43，51-86，93-100，110-116，150-161，164-171，180-187，197-218和168-237位的Seq ID No 460；4-27，55-60，74-82和10-46位的Seq ID No 461；6-19，25-31，43-49，60-79，88-100，105-129，148-161，164-171，187-193，243-263，316-322，334-340，369-378，381-391，398-404，460-466，474-483，502-509，511-517，525-530，558-567，579-596，622-627，631-638，641-651，653-659，674-680，687-693，710-716，720-727，743-753，760-775，788-795，806-813，821-828，836-842，847-860，865-880和258-377位的Seq ID No462；4-11，25-64，71-79，88-94，107-120，123-132，167-188，231-237，240-246，261-267，306-311，330-342，351-358，389-395，406-418，429-434，439-448，483-501，511-520和71-143位的Seq ID No 463；4-18，22-27，53-64，94-100，121-127，133-139，155-164，177-182，187-196，206-218，224-242，248-253，258-277和184-253位的Seq ID No 464；10-17，56-67，72-82，94-99，106-113，166-173，229-235，243-283，295-301，313-321，326-331，342-348，396-414，423-435，446-452，454-462，496-502，511-534，543-556，563-570，586-593，616-626，638-645，653-662，679-696，731-737，766-774，776-782，790-796，810-817，825-835，837-846和540-615位的Seq ID No 465；13-24，30-36，73-81，89-95，109-115，117-143，161-173，179-189，226-244，251-261，275-281，298-305，307-315，323-328，364-374，69-186和264-354位的Seq ID No466；19-25和6-22位的Seq ID No 467；6-39，59-68和43-62位的Seq IDNo 468；6-14，22-32和1-27位的Seq ID No 469；4-41和28-40位的Seq IDNo 470；8-14和4-19位的Seq ID No 471；4-10，12-22，30-35和6-33位的Seq ID No 472；4-16，24-33和37-54位的Seq ID No 473；2-23位的SeqID No 474；4-21，27-33，36-41和14-34位的Seq ID No 475；4-14，24-30，37-42，57-78，83-89，94-103，113-131和100-122位的Seq ID No 476。
本发明也提供了生产根据本发明的粪肠球菌超免疫血清反应性抗原或其片段的方法，包括在合适的表达系统中表达根据本发明的一个或多个核酸分子。
此外，本发明提供了生产表达根据本发明的粪肠球菌超免疫血清反应性抗原或其片段的细胞的方法，包括用根据本发明的载体转化或转染合适的宿主细胞。
根据本发明提供了尤其是疫苗的药物组合物，其包含如本发明定义的超免疫血清反应性抗原或其片段或如本发明定义的核酸分子。
优选实施方案中，药物组合物进一步包含了免疫刺激物质，优选地选自尤其是聚阳离子肽的聚阳离子聚合物、免疫刺激脱氧核苷酸(ODN)、含有尤其是KLKL5KLK的至少两个LysLeuLys基团的肽、尤其是人生长激素的神经活性化合物、明矾(alumn)、弗氏完全或不完全佐剂或它们的组合。
更加优选的实施方案中，免疫刺激物质是聚阳离子聚合物和免疫刺激脱氧核苷酸或含有至少两个LysLeuLys基团的肽和免疫刺激脱氧核苷酸的组合。
还更优选的实施方案中，聚阳离子聚合物是聚阳离子肽，尤其是聚精氨酸。
根据本发明，提供了根据本发明的核酸或根据本发明的超免疫血清反应性抗原或其片段用于药物制备物的生产的用途，尤其是用于抗肠球菌感染的疫苗的生产。
同此，也提供了至少结合于根据本发明的超免疫血清反应性抗原或其片段的选择性部分的抗体或其至少有效部分。
优选的实施方案中抗体是单克隆抗体。
另一优选的实施方案中抗体的有效部分包含Fab片段。
进一步优选的实施方案中抗体是嵌合抗体。
还优选的实施方案中抗体是人源化抗体。
本发明也提供了产生根据本发明的抗体的杂交瘤细胞系。
此外，本发明提供了产生根据本发明的抗体的方法，特征在于如下的步骤·通过给予非人的动物如本发明中定义的超免疫血清反应性抗原或其片段引发所述动物的免疫反应，·从所述动物移出含抗体的体液，以及·通过进一步纯化步骤处理含所述抗体的体液产生抗体。
相应地，本发明也提供了一种产生根据本发明的抗体的方法，特征在于如下的步骤·通过给予非人的动物如本发明中定义的超免疫血清反应性抗原或其片段引发所述动物的免疫反应，·从所述动物移出脾或脾细胞，·生产所述脾或脾细胞的杂交瘤细胞·挑选和克隆特异于所述超免疫血清反应性抗原或其片段的杂交瘤细胞，·通过所述克隆的杂交瘤细胞的培养和可选的进一步纯化步骤产生抗体。
根据上面方法提供或生产的抗体可以用于治疗或预防肠球菌感染的药剂的制备。
根据另一方面，本发明提供了结合根据本发明的超免疫血清反应性抗原或其片段的拮抗剂。
所述能够结合根据本发明的超免疫血清反应性抗原或其片段的拮抗剂可以通过包含如下步骤的方法鉴别a)将分离的或固定化的根据本发明的超免疫血清反应性抗原或其片段在允许候选拮抗剂和所述超免疫血清反应性抗原或其片段结合的条件下，在能够提供应答于候选拮抗剂和所述超免疫血清反应性抗原或其片段结合的可检测信号的组分的存在下，与所述候选拮抗剂接触；以及b)检测应答于拮抗剂与超免疫血清反应性抗原或其片段结合的信号的存在或不存在。
能够降低或抑制根据本发明的超免疫血清反应性抗原或其片段与其相互反应伴侣的相互反应活性的拮抗剂可以通过包含如下步骤的方法鉴别a)提供了根据本发明的超免疫血清反应性抗原或其超免疫片段，b)向所述超免疫血清反应性抗原或其片段，提供相互反应伴侣，尤其是根据本发明的抗体，c)允许所述超免疫血清反应性抗原或其片段与所述相互反应伴侣的相互反应以形成相互反应复合物，d)提供候选拮抗剂，e)允许候选拮抗剂和相互反应复合物之间发生竞争反应，f)测定候选拮抗剂是否抑制或降低超免疫血清反应性抗原或其片段与相互反应伴侣的相互反应活性。
根据本发明的超免疫血清反应性抗原或其片段可用于所述超免疫血清反应性抗原或其片段的相互反应伴侣的分离和/或纯化和/或鉴别。
本发明也提供了体外诊断与根据本发明的超免疫血清反应性抗原或其片段的表达相关的疾病的方法，包括测定根据本发明编码所述超免疫血清反应性抗原或其片段的核酸序列的存在，或根据本发明的超免疫血清反应性抗原或其片段的存在。
本发明也提供了尤其是肠球菌感染的细菌感染体外诊断的方法，包括分析根据本发明编码所述超免疫血清反应性抗原或其片段的核酸序列的存在或根据本发明的超免疫血清反应性抗原或其片段的存在。
此外，本发明提供了根据本发明的超免疫血清反应性抗原或其片段的用途其用以产生结合于所述超免疫血清反应性抗原或其片段的肽，其中所述肽是抗促成素(anticaline)。
本发明也提供了根据本发明的超免疫血清反应性抗原或其片段的用途，其用以生产功能性核酸，其中所述功能性核酸选自适体(aptamer)和镜面体(spiegelmers)。
根据本发明的核酸分子也可用于功能性核糖核酸的生产，其中所述功能性核糖核酸选自核酶、反义核酸和siRNA。
本发明有利地提供了使用来自多个人血浆合并物的抗体制备物和来源于粪肠球菌基因组的表面表达文库，从粪肠球菌鉴别出来的一套有效的、相关的和全面的分离的核酸分子和它们编码的超免疫血清反应性抗原或其片段。因而，本发明满足了在制备抗体和鉴别有效对抗肠球菌感染的化合物的过程中有用的粪肠球菌抗原、疫苗、诊断和产品的广泛需要。
有效疫苗应当由所有株表达的并能诱导抗粪肠球菌细胞表面组分的高亲和力、丰富抗体的蛋白质或多肽组成。对于调理作用，抗体应当是IgG1和/或IgG3，对于粘附和毒素作用的中和，是任何IgG亚型和IgA。化学限定的疫苗必须是明确地比全细胞疫苗(减毒或灭活的)优良，因为与人类组织交叉反应或抑制调理作用的粪肠球菌的组分能被去除(Whitnack，E.等人，1985)，并且诱导保护抗体和/或保护免疫反应的个体蛋白质能被挑选出来。
本发明采用的方法是基于肠球菌蛋白质或肽与人血清中存在的抗体的相互作用。人免疫系统产生的并且在人血清中存在的抗粪肠球菌抗体是抗原蛋白质的体内表达和它们的免疫原性的指征。另外，在用个体选择或产生的血清进行的第二和第三轮筛选中处理抗原蛋白质，所述抗原蛋白质是使用预选血清的合并物通过细菌表面展示表达文库鉴别的。因而，本发明提供了作为药物组合物尤其是预防粪肠球菌感染的疫苗的一套有效、相关、全面的肠球菌抗原。
在鉴别根据本发明的一全套抗原的抗原鉴别程序中，用一些血清合并物或血浆级分或其它合并的含有抗体的体液(抗体合并物)筛选了至少两个不同的细菌表面表达文库。抗体合并物来源于已经测试了抗粪肠球菌抗原化合物的血清收集物，例如全部细胞提取物和培养上清蛋白质。优选地，使用两个截然不同的血清收集物，1.带有非常稳定的抗体储备库正常成人，临床上健康的人群，其不是携带者且经历此前的接触或目前是粪肠球菌携带者但无急性疾病或症状，2.带有通过致病生物存在急性诱导的抗体具有不同表现的患有急性病症的患者(如粪肠球菌心内膜炎，尿道感染和菌血症)。为了考虑是超免疫的并因而在本发明采用的筛选方法中是相关的，血清必须与多个肠球菌特异性抗原反应。通过人免疫系统针对肠球菌产生的且存在于人血清中的抗体是抗原性蛋白质体内表达及其免疫原性的指征。
如本发明中使用的表达文库应当允许所有可能抗原，例如源自粪肠球菌所有表面蛋白质的表达。细菌表面展示文库由在细菌宿主膜的所选的外膜蛋白质(LamB，BtuB和FhuA)的呈示肠球菌一(总)套表达肽序列的细菌宿主的重组文库表示{Georgiou，G.，1997}；{Etz，H.等人，2001}。使用重组表达文库一个优点是鉴别的超免疫血清反应性抗原可以立即由筛选的和挑选的表达超免疫血清反应性抗原的克隆的编码序列的表达产生，没有进一步的重组DNA技术或必要的克隆步骤。
进一步用一或多个额外轮的筛选，分析通过根据本发明描述的程序鉴别的全套抗原。所以，使用了被鉴别有免疫原性的个体抗体制备物或产生的抗所选肽的抗体。根据优选实施方案，用于第二轮筛选的个体抗体制备物来源于患有肠球菌急性感染的患者，尤其是显示抗体滴度高于某些最低水平的患者，例如，抗体滴度高于80％，优选高于90％，尤其优选高于95％的所测试的人类(患者或健康个体)血清的抗体滴度。在第二轮筛选使用这样高滴度的个体抗体制备物允许超免疫血清反应性抗原和其片段从粪肠球菌的非常有选择性的鉴别。
全面筛选过程之后，通过一系列ELISA和Western斑点试验在第二轮筛选中测试了挑选的抗原蛋白质以评价它们对大量的人血清收集物(大于100未感染的和大于50个患者血清)的免疫原性，所述抗原蛋白质在原核表达系统中不能表达的情况下表达为重组蛋白质或体外翻译产物，或者鉴别的抗原性肽(合成产生)。
个体抗体制备物(其也可是挑选的血清)允许所有超免疫血清反应性抗原最有希望的候选物从第一轮的所有有希望的候选物中的选择性鉴别是重要的。所以，优选地至少10个个体抗体制备物(即来自至少10个已经遭受所选病原体感染的不同个体的抗体制备物(例如血清))应当用于在第二轮筛选中鉴别这些抗原。当然，也可使用少于10个个体制备物，然而，步骤的选择性与低数量的个体抗体制备物可能不是最佳的。另一方面，如果给定的超免疫血清反应性抗原(或其抗原片段)被至少10个个体抗体制备物，优选地至少30个，尤其是至少50个个体抗体制备物识别，那么超免疫血清反应性抗原的鉴别对正确鉴别也有足够的选择性。当然也可以与尽可能多的个体制备物(例如与多于100或甚至与多于1,000个)测试超免疫血清反应。
所以，根据本发明的方法之超免疫血清反应抗体制备物的相关部分应当优选地至少10个，更加优选地至少30个，尤其是至少50个个体抗体制备物。或者(或联合地)超免疫血清反应性抗原优选地也可用第二轮筛选中使用的至少20％，优选地至少30％，尤其是至少40％的所有个体抗体制备物进行鉴别。
根据本发明的优选实施方案，用于第二轮筛选个体抗体制备物从其制备的血清通过它们抗粪肠球菌的滴度(例如抗这个病原体的制备物，例如裂解物，细胞壁组分和重组蛋白质)进行挑选。优选地，当ELISA中全生物体(总裂解物或总细胞)用作抗原时，挑选有总IgG滴度高于10,000U尤其是高于12,000U(U＝单位，从在给定稀释度的OD405nm读数计算)的一些血清。
人免疫系统产生的针对肠球菌、并存在于人血清中的抗体是抗原蛋白质的体内表达和它们的免疫原性的指征。血清抗体识别的线性表位之识别能基于如4-5个氨基酸短的序列。当然，它不是一定意味着这些短肽能够体内诱导给定的抗体。为了那个原因，定义的表位、多肽和蛋白质进一步地在动物(主要是小鼠)中测试它们诱导抗体内挑选蛋白质的抗体的能力。
优选的抗原位于细胞表面或被分泌，并且因而可胞外接近。期望抗细胞壁蛋白质的抗体起两个作用抑制粘附、和促进噬菌作用。针对分泌蛋白质的抗体对它们作为毒素或毒力组分的功能的中和是有益的。细菌通过分泌蛋白质相互联系也是已知的。抗这些蛋白质之中和抗体将干扰肠球菌种属之间或肠球菌内的促进生长的联系(crosstalk)。生物信息分析(信号序列、细胞壁定位信号、跨膜结构域)证明对于评价细胞表面定位或分泌是非常有用的。实验方法包括有相应表位的抗体和蛋白质从人血清的分离，以及小鼠中抗细菌表面展示筛选挑选的(多)肽的免疫血清的产生。
为了所述目的，将细菌大肠杆菌菌落直接注射进小鼠，收集免疫血清并在相关体外试验中测试功能性调理或中和抗体。或者，可以使用肽或蛋白质作为底物从人或小鼠血清纯化特异性抗体。
针对粪肠球菌的宿主防御主要依赖调理噬菌性杀死机制。通过疫苗接种诱导高亲和力的调理和中和类型的抗体帮助先天免疫系统清除细菌和毒素。这个使得根据本发明的方法成为肠球菌抗原蛋白质鉴别的最佳工具。
皮肤和粘膜的膜是强大的抗肠球菌入侵的屏障。然而，一旦皮肤或粘附的膜被破坏，第一道非适应性细胞防疫通过补体和噬菌细胞尤其是多形核白细胞(PMN)开始它的合作作用。这些细胞能被当作清除入侵细菌的基石。因为粪肠球菌是主要的细胞外病原体，主要的抗肠球菌适应性反应来自免疫系统的体液途径，并由三个主要机制介导调理作用的促进、毒素的中和和粘附的抑制。相信调理作用因为它对有效噬菌作用的要求是尤其重要的。对于有效的调理作用，为了PMN通过IgG分子Fc片段或激活的C3b的受体的识别，微生物表面必须用抗体和补体因子包被。调理作用之后，肠球菌被吞噬和杀死。结合于细菌细胞表面上的特异性抗原的抗体起附着于PMN的配体和促进噬菌作用的作用。期望结合于粘附素和其它细胞表面蛋白质的非常一样的抗体中和粘附以及阻止群集。本发明提供的抗原的选择因而非常适于鉴别将导致抗动物模型或人类中抗感染保护的那些抗原。
根据此处使用的抗原鉴别方法，本发明惊人地提供了尤其如下描述的一套全面的粪肠球菌新型核酸和新型超免疫血清反应性抗原和其片段。根据一个方面，本发明尤其涉及编码超免疫血清反应性抗原的核苷酸序列，所述序列列于序列列表中Seq ID No 1-170，373-424，以及代表超免疫血清反应性抗原的相应的编码氨基酸序列列于序列列表中Seq ID No 171-340和425-476。
本发明优选实施方案中，提供了其全长展示了与Seq ID No 1-2，4-8，10，12-18，20-23，25-26，29-43，45-62，64-74，76-77，79-83，85-89，91-92，94-114，117-126，128-146，148-170，373，375，379-381，387，392，394，397-399，407-408，410-411和415-424列出的核苷酸序列70％相同性的核酸分子。最优选的是包含其全长与Seq ID No 1-2，4-8，10，12-18，20-23，25-26，29-43，45-62，64-74，76-77，79-83，85-89，91-92，94-114，117-126，128-146，148-170，373，375，379-381，387，392，394，397-399，407-408，410-411和415-424列出的核酸分子至少80％或至少85％相同性的区域之核酸。在这点上，核酸分子就其全长与上述核酸分子至少90％、91％、92％、93％、94％、95％或96％相同是尤其优选的。此外，有至少97％相同性的那些是优选的，有至少98％和至少99％的那些是尤其高度优选的，有至少99％或99.5％是更加优选的，有100％相同性是尤其优选的。另外，这点上优选实施方案是编码基本上保留了与Seq ID No 1-2，4-8，10，12-18，20-23，25-26，29-43，45-62，64-74，76-77，79-83，85-89，91-92，94-114，117-126，128-146，148-170，373，375，379-381，387，392，394，397-399，407-408，410-411和415-424列出的所述核酸编码的成熟多肽相同生物功能或活性的超免疫血清反应性抗原或其片段的核酸。
如本领域已知并此处使用的相同性是通过比较序列测定的两个或两个以上多肽序列或两个或两个以上多核苷酸序列之间的关系。本领域中，相同性也指多肽或聚核苷酸序列之间序列相关的程度，就如在本情况下可以是这样的序列串(strings)之间的匹配测定的。能很容易地计算相同性。虽然有许多方法测量两个聚核苷酸或两个多肽序列之间的相同性，所述术语对于技术人员是众所周知的(例如分子生物学中的序列分析，von Heinje，G.，Academic Press，1987)。设计测定相同性的优选方法以给予测试的序列之间最大的匹配。在计算机程序中编码测定相同性的方法。测定两个序列之间相同性的优选计算机程序方法包括但不限于GCG程序包{Devereux，J.等人，1984}、BLASTP、BLASTN和FASTA{Altschul，S.等人，1990}。
根据本发明的另一方面，提供了展现与Seq ID No 3，9，11，24，27，44，63，75，84，115-116，127，374，376-378，382-386，388-391，393，395-396，400-406，409和412-414列出的核酸序列有96％或高于96％，尤其是100％序列相同性的核酸分子。
根据本发明的另一方面，提供了与核酸分子具有98％或高于98％，尤其是100％序列相同性的核酸分子，所述核酸分子与Seq ID No 90，147列出的核酸序列相同。
根据本发明的核酸分子作为第二备择方案也可是至少基本上互补于上述第一备择方案的核酸的核酸分子。如此处使用地，互补是指核酸链经由Watson-Crick碱基配对与第二个核酸链是碱基配对的。如此处使用地基本上互补的是指碱基配对不发生在各个链所有的碱基而留有一定数量或百分比的未配对或错配的碱基。正确配对碱基的百分比优选地是至少70％，更加优选地80％，甚至更加优选地90％以及最优选地高于90％的任何百分比。要注意70％配对碱基的百分比被认为有同源性，具有这个程度配对碱基对的杂交被认为是严格的。这种严格杂交的杂交条件可以从分子生物学现代试验方案(John Wiley和Sons，Inc.，1987)获得。更加特别地，杂交条件如下·例如在5x SSPE，5x Denhardt′s试剂，0.1％SDS，100g/mL剪切的DNA中在68℃进行的杂交·0.2xSSC，0.1％SDS中在42℃的中等严格清洗·0.1xSSC，0.1％SDS中在68℃的高严格清洗有50％GC含量的基因组DNA具有大约96℃的TM。对于1％的错配，TM降低大约1℃。
另外，此处描述的任何进一步的杂交条件原则上也可应用。
当然，编码与如本发明鉴别的那些相同的多肽分子之所有核酸序列分子包括任何公开的给定编码序列，因为遗传密码的简并性可直接应用以清楚地测定编码给定多肽分子的所有可能的核酸分子，即使这样简并的核酸分子的数量可以很高。这个也可应用于给定多肽的片段，只要在免疫接种这点上所述片段编码适合用作例如作为主动或被动疫苗的多肽。
根据本发明的核酸分子作为第三备择方案也能是包含了根据上面总结的根据本发明的核酸分子第一和第二备择方案的核酸分子至少15个碱基的延伸的核酸。优选地，碱基形成了碱基连续的延伸。然而，所述延伸由许多碱基分开的两个或两个以上的基团组成，也在本发明的范围内。
本核酸优选地由此处公开的序列至少20个，甚至更加优选地至少30个，尤其是至少50个连续碱基组成。由于所用的计划区域(例如作为(PCR)引物、探针、(例如在(DNA)芯片上的)捕获分子等等)，很容易地优化合适的长度。优选的核酸分子含有一个或多个表1和2中列出的推定的免疫原性氨基酸序列的至少连续15个碱基部分，尤其是表2的有高于10分，优选地高于20分，尤其是有高于25分的序列。尤其优选的是含有本应用的序列方案中任何序列的DNA序列连续部分的核酸，所述核酸与公开的粪肠球菌株V583基因组({Paulsen，I等人，2003}；GenBank登陆号AE016830(染色体)、AE016833(pTEF1)，AE016831(TE2)，AE016832(pTEF3))和/或任何其它公开的粪肠球菌基因组序列或其部分，显示了一或多个，优选地多于2个，尤其是多于5个不相同的核酸残基。尤其优选的不相同的核酸残基是导致不同氨基酸残基的残基。优选地，核酸序列编码与上面提到的公开的粪肠球菌对应物具有至少1个，优选地至少2个，优选地至少3个不同氨基酸残基的多肽。这样分离的多肽也是优选的，所述多肽是此处例如序列列表中提到的蛋白质(或全蛋白质)的片段，具有至少6、7或8个氨基酸残基并由这些核酸编码。
根据本发明的核酸分子作为第四备择方案也可是在严格杂交条件下退火于根据上面总结的第一、第二和第三备择方案的本发明任何核酸的核酸分子。严格杂交条件一般是此处描述的那些。
最后，根据本发明的核酸分子作为第五备择方案也可是由于遗传密码的简并性否则能杂交根据上面总结的第一、第二、第三和第四备择方案的根据本发明任何核酸分子的任何核酸分子之核酸分子。这种核酸分子指的是优选地根据本发明的核酸编码根据本发明的超免疫血清反应性抗原或其片段的事实。这种核酸对于根据本发明的核酸分子的检测，并因而对例如粪肠球菌的各个微生物的诊断以及与这种微生物有关的任何疾病或疾病状态尤其有用。优选地，杂交将在如上面描述的第四备择方案描述的严格条件下发生或进行。
如此处使用的核酸分子一般指的是任何核酸分子或脱氧核糖核酸分子，可以是非修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。因而，例如，如此处使用的核酸分子在其它之中指的是单和双链DNA，单和双链RNA的混合物的DNA，单和双链区域的混合物的RNA，包含可以是单链、或更加一般地双链、或三链、或单和双链区域混合物的DNA和RNA的杂交分子。另外，如此处使用的核酸分子指的是包含RNA、或者DNA、或者RNA和DNA的三链区域。这样区域的链可以来自相同的分子或来自不同分子。这些区域可以包括所有的一个或多个分子，但更一般地只涉及一些分子的区域。一个三螺旋区域的分子通常是寡核苷酸。如此处使用地，术语核酸分子包括如上面描述的含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA。因而，有为了稳定性或为了其它原因而修饰的骨架的DNA或RNA是此处术语所指的“核酸分子”。另外，包含例如次黄嘌呤核苷的异常碱基或例如三苯甲基化碱基的修饰碱基的DNA或RNA(只提及两个例子)是如此处使用的术语的核酸分子。将理解已经对有本领域技术人员已知的很多有用目的之DNA和RNA进行非常多种的修饰。如此处采用的术语核酸分子包含这样化学、酶或代谢修饰形式的核酸分子，以及病毒和其中包括简单和复杂细胞的细胞特征的化学形式的DNA和RNA。术语核酸分子也包含通常指的是寡核苷酸的短核酸分子。“多核苷酸”和“核酸”或“核酸分子”通常此处交替使用。
本发明提供的核酸分子也包括众多的独特的片段，比粪肠球菌编码区域的序列列表中列出的核酸分子序列更长和更短，能通过标准克隆方法产生。为了是独特的，片段必须有足够的大小使其能从其它已知的核酸序列中区分出来，最容易通过将任何挑选的粪肠球菌片段与例如GenBank的计算机数据库中的核苷酸序列比较而测定。
另外，能对本发明包含的核酸分子和多肽进行修饰。例如，能进行不影响核酸编码的多肽的核苷酸替代，因而编码超免疫血清反应性抗原或其片段编码的任何核酸分子也包含在本发明内。
此外，使用例如标准克隆技术的标准技术能将编码本发明提供的超免疫血清反应性抗原或其片段的任何核酸分子功能性地联接于任何期望的调节序列，不管是粪肠球菌调节序列或异源性调节序列、异源性先导序列、异源性标记序列或产生融合蛋白的异源性编码序列。
本发明的核酸分子可以是例如mRNA或cRNA的RNA形式，或者包括例如通过克隆得到的或化学合成技术产生的cDNA和基因组DNA或其组合的DNA形式。DNA可以是三链、双链或单链。单链DNA可以是编码链，也已知为正义链，或者它可以是非编码链，也指的是反义链。
本发明还涉及此处上面描述的核酸分子的变异体，所述变异体编码具有序列列表中列出的推算的粪肠球菌氨基酸序列的超免疫血清反应性抗原和其片段的片段、类似物和衍生物。核酸分子的变异体可以是天然发生的变异体，例如天然发生的等位基因变异体，或者它可以是不知道是天然发生的变异体。可以通过诱变技术制造核酸分子这样非天然发生的变异体，包括应用于核酸分子、细胞或生物体的那些。
在这点的变异体之中，变异体是不同于前面提到的核酸分子，差别在于有核苷酸替代、删除或增加的核酸。替代、删除或增加可包括一个或多个核苷酸。可在编码或非编码区或者这两个区域改变变异体。编码区的改变可产生保守或非保守氨基酸替代、删除或增加。优选的是编码变异体、类似物、衍生物或片段或者片段的变异体、类似物或衍生物的核酸分子，所述核酸分子具有如序列列表中列出的粪肠球菌序列，其中以任何的组合形式，数个、少数、5至10个、1至5个、1至3个、2个、1个或没有氨基酸被替代、删除或增加。这些之中尤其优选的是沉默替代、增加或删除，它们不改变序列列表中列出的粪肠球菌多肽的特性和活性。在这点也尤其优选的是保守替代。
根据本发明的肽和片段也包括修饰的表位，其中优选地根据例如{Tourdot，S.等人，2000}中公开的法则修饰或替代给定的表位的一个或两个氨基酸，以及编码这样修饰的表位的核酸序列。
很清楚根据本发明的表位涵盖了通过改进、保存或至少不显著阻碍表位的T细胞激活能力的氨基酸交换而衍生于本表位的表位。所以，本表位也涵盖了不含有源于粪肠球菌的原始序列但是激发相同或优选地改进的T细胞反应的表位。这些表位指的是“不规则变化的”；它们需要具有对MHC/HLA分子相似的或优选地对更大的亲和力，并且它们需要以相似或优选地更强的方式刺激指向原始表位的T细胞受体(TCR)的能力。
能通过合理设计获得不规则变化的表位，即考虑如例如{Rammensee，H.等人，1999}描述的单个残基对结合于MHC/HLA的作用，联合可能与TCR相互作用的残基的系统交换以及用指向原始表位的T细胞测试得到的序列。这样的设计对于的本领域技术人员是可能而无需过度的试验。
另一个可能性包括用针对原始表位的T细胞对肽库的筛选。优选的方式是合成肽库的位点扫描。这样的方法已经在例如{Hemmer，B.等人，1999}有详细描述并且此处给予参考。
作为本衍生氨基酸序列代表的表位或不规则变化的表位的备择方案，也能采用模仿这些表位的物质，例如“肽模仿物”或“回复-反-肽”(retro-inverso-peptides)。
改进的表位设计的另一方面，是带有增加其刺激T细胞的能力的物质之制剂或修饰。这些包括T辅助细胞表位、脂质或脂质体或如WO 01/78767中描述的优选的修饰。
增加表位T细胞刺激能力的另一方法是带有免疫刺激物质的制剂，例如象白细胞介素-2、-7、-12、-18、I和II型干扰素(IFN)的细胞因子或化学因子，尤其是IFN-γ、GM-CSF、TNF-α、flt3配体等。
另外如此处讨论地，关于本发明的核酸分子试验，例如如上面讨论的本发明的核酸分子可以用作RNA、cDNA和基因组DNA的杂交探针以分离编码本发明多肽的全长cDNA和基因组克隆，以及分离与本发明核酸分子具有很高的序列相似性的其它基因的cDNA和基因组克隆。这样的探针一般包含至少15个碱基。优选地，这样的探针将具有至少20个、至少25个或至少30个碱基，可以具有至少50个碱基。特别优选的探针将具有至少30个碱基，将具有50个或更少的碱基，例如30、35、40、45或50个碱基。
例如，使用已知的DNA序列通过筛选相关文库分离本发明的核酸分子的编码区域以合成寡核苷酸探针。具有互补于本发明基因序列的序列的标记寡核苷酸然后用于筛选cDNA、基因组DNA或mRNA文库以测定探针杂交于文库的哪些成员。
如此处进一步讨论地，关于核酸分子试验，本发明的核酸分子和多肽可以用作开发尤其是人类疾病的疾病的治疗和诊断的试剂和物质。
作为寡核苷酸的本发明的核酸分子能用于此处描述的方法中，但是优选地是PCR，以测定此处鉴别的粪肠球菌基因是否全部或部分存在于例如血液的感染组织和/或在其中转录。已经认识到这样的序列也将在病原体已经达到的感染阶段和感染类型的诊断有用途。为了这个和其它的目的，可以使用如此处描述的包含至少一个根据本发明的核酸的阵列。
根据本发明的核酸分子可以用于核酸分子和含有这些核酸的生物体或样品的检测。优选地这样的检测是为了诊断，更加优选地是为了与粪肠球菌的存在或丰度相关的或相联的疾病的诊断。
感染了粪肠球菌的特别是哺乳动物尤其是人的真核细胞(此处也是“个体”)是可以鉴别的，方法是通过各种技术在DNA水平检测的根据本发明的任何核酸分子的检测。能够获得为了从其它生物体区分粪肠球菌的优选的候选核酸分子。
本发明提供了诊断源自粪肠球菌感染的疾病的方法，包含从个体分离的或来源于个体的样品测定具有序列列表中列出的核酸分子序列的核酸分子表达水平的增加。能使用本领域中众所周知的核酸分子定量的方法测量核酸分子的表达，例如PCR、RT-PCR、RNase保护、Northern斑点、其它的杂交方法和此处描述的阵列。
如此处使用的分离的是指“通过人工”从其天然状态分离；即，如果它天然发生，它将被改变或从其原始环境去除，或两个都有可能。例如，天然存在于活的生物体的天然发生的核酸分子或肽在其天然状态是不“分离的”，但是从其天然状态的共存物质中分离的相同的核酸分子或多肽是“分离的”，如此处采用的术语。作为分离的部分或下面的分离，例如为了诱变形成融合蛋白质以及为了宿主中的增殖或表达，这样的核酸分子能连接于例如DNA的其它的核酸分子。分离的核酸分子单独或连于例如载体的其它核酸分子能被引入培养的或全生物体的宿主细胞。引入培养的或全部生物体的宿主细胞，这样的DNA仍然将是分离的，如此处使用的术语，因为它们将不是它们天然发生的形式或不在它们天然发生的环境中。相似地，核酸分子和多肽可以发生在组合物中，例如介质制剂、核酸分子或多肽引入例如细胞内的溶液、化学或酶反应的组合物或溶液，例如，它们不是天然发生的组合物，在此处采用的那个术语的意义之内，在那里仍然是分离的核酸分子或多肽。
根据本发明的核酸可以是化学合成的。或者，核酸能通过本领域的技术人员已知的方法从粪肠球菌中分离。
根据本发明的另一方面，通过使用此处描述的抗原鉴别方法提供了一套全面的新型超免疫血清反应性抗原和其片段。本发明优选的实施方案中，提供了包含此处描述的任何一个核酸分子编码的氨基酸序列的超免疫血清反应性抗原及其片段。本发明另一优选的实施方案中，提供了包含选自Seq ID No 171-172，174-178，180，182-188，190-193，195-196，199-213，215-232，234-244，246-247，249-253，255-259，261-262，264-284，287-296，298-316，318-340，425，427，431-433，439，444，446，449-451，459-460，462-463和467-476中表示的多肽序列之氨基酸序列的一套新型超免疫血清反应性抗原及其片段。本发明另一优选实施方案中，提供了包含选自Seq ID No 173，179，181，194，197，214，233，245，254，285-286，297，426，428-430，434-438，440-443，445，447-448，452-458，461和464-466中表示的多肽序列之氨基酸序列的一套新型超免疫血清反应性抗原及其片段。在本发明的又一实施方案中，提供了包含选自Seq ID No 260，317中表示的多肽的氨基酸序列之超免疫血清反应性抗原及其片段。
如本发明提供的超免疫血清反应性抗原及其片段包括序列列表中列出的任何多肽，以及如下的多肽具有与序列列表中列出的多肽至少70％相同性，优选地与序列列表中列出的多肽至少80％或85％相同性，更加优选地与序列列表中列出的多肽至少90％相似性(更加优选地至少90％相同性)以及仍然更加优选地与序列列表中列出的多肽至少95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相似性(仍然更加优选地至少95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同性)，也包括这样的多肽的部分，所述多肽一般有含有4个氨基酸，更加优选地至少8个，仍然更加优选地至少30个，仍然更加优选地至少50个氨基酸，例如4，8，10，20，30，35，40，45或50个氨基酸的这样的多肽部分。
本发明还涉及这些超免疫血清反应性抗原及其片段的片段、类似物和衍生物。术语“片段”、“衍生物”和“类似物”当指的是其氨基酸序列列于序列列表中的抗原时，是指基本上保留了与这样的超免疫血清反应性抗原及其片段相同的或相似的生物功能或活性的多肽。
超免疫血清反应性抗原及其片段的片段、衍生物或类似物可以是1)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选地保守的氨基酸残基)替代的一种，并且这样替代的氨基酸残基可以是或可以不是遗传密码编码的一个，或者2)其中一个或多个氨基酸残基包括取代基团的一种，或者3)其中成熟的超免疫血清反应性抗原及其片段与例如增加超免疫血清反应性抗原及其片段半衰期的化合物(例如，聚乙二醇)的另一种化合物融合的一种，或者4)其中额外的氨基酸融合于成熟的超免疫血清反应性抗原及其片段的一种，例如先导或分泌序列或用于成熟超免疫血清反应性抗原及其片段的纯化的序列或前蛋白质序列。这样的片段、衍生物和类似物认为在本领域技术人员此处教义的范围内。
本发明也涉及不同的粪肠球菌分离株的抗原。基于此处公开的核酸和氨基酸序列可以很容易地分离这样的同源物。对于每一个M血清型能相应地测定任何抗原的存在。另外，测定多种种血清型中特定抗原的变异性是可能的，如sic基因(Hoe，N.等人，2001)。多种血清型对不同肠球菌感染的作用在不同年龄组和地理区域是不同的。期望最有价值的保护性抗原在各种临床株之中是保守的是一个很重要的方面。
在这方面，序列列表中列出的超免疫血清反应性抗原及其变异体、类似物、衍生物和片段，以及片段的变异体、类似物和衍生物在本发明尤其优选的实施方案中。额外地，包含这样的超免疫血清反应性抗原及其变异体、类似物、衍生物和片段以及片段的变异体、类似物和衍生物的融合多肽也包含在本发明中。使用标准技术能很容易地制造这样的融合多肽和蛋白质以及编码它们的核酸分子，包括生产和表达编码融合蛋白质的重组多核酸的标准重组技术。
由于保守氨基酸替代而与参比不同的那些在优选变异体之中。这样的替代是多肽中给定氨基酸被另一个同样特性的氨基酸替代的那些。一般视为保守替代是脂肪性氨基酸Ala，Val，Leu和Ile中互相的取代；羟基残基Ser和Thr的交换，酸性残基Asp和Glu的交换，酰胺残基Asn和Gln之间的替代，碱性残基Lys和Arg的交换以及芳香基残基Phe和Tyr之间的取代。
在这点上进一步尤其优选的是具有序列列表中列出的任何多肽之氨基酸序列的变异体、类似物、衍生物和片段，以及片段的变异体、类似物、衍生物，其中几个、少数、5至10个、1至5个、1至3个、2个、1个或没有氨基酸残基以任何联合形式被替代、删除或增加。这些之中尤其优选的是不改变本发明多肽的特性和活性的沉默替代、增加和删除。在这点上也尤其优选的是保守替代。最高度优选的是具有序列列表中列出的没有替代的氨基酸序列的多肽。
优选地以分离的形式提供本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段，优选地是纯化为同质的。
包含具有序列列表中列出的氨基酸序列的多肽的片段以及序列列表中列出的多肽的变异体和衍生物的片段也在本发明优选实施方案中。
在这点上，片段是具有与前面提到的超免疫血清反应性抗原及其片段的部分但不是所有氨基酸序列完全相同的氨基酸序列的多肽及其变异体或衍生物、类似物、片段。这样的片段可以是“游离的”，即不是其它氨基酸或多肽的部分或者与其融合，或者它们也包含在它们形成的一部分或区域的更大的多肽内。本发明这个方面也优选的是特征在于本发明多肽的结构或功能属性的片段，即包含本发明多肽的α-螺旋和α-螺旋形成区域、β-折叠和β-折叠形成区域、折转和折转形成区域、卷曲和卷曲形成区域、亲水区域、疏水区域、α两性区域、β两性区域、可曲(flexible)区域、表面形成区域、底物结合区域和高抗原指示区域的片段以及这样的片段的联合。优选的区域是介导本发明超免疫血清反应性抗原及其片段的活性的那些。在这点上最高度优选的是具有本发明超免疫血清反应性抗原及其片段的化学、生物或其它活性的片段，包括有相似活性或改进活性或有降低的非期望活性的那些。尤其优选的是包含酶受体或结构域的片段，所述酶受体或结构域赋予粪肠球菌存活或造成人类疾病的能力所必须的功能。进一步优选的多肽片段是包含或含有尤其是人的动物中抗原或免疫原性决定簇的那些。
抗原片段定义为鉴别的抗原的片段，对于其本身它是抗原的或者当提供为半抗原时可以制成抗原的。所以，本发明实现了显示一个或(对于更长的片段)只有少数氨基酸交换的抗原或抗原片段，假设在交换时没有严重地破坏有氨基酸交换的这样的片段的抗原能力，即适于引发接受这个抗原免疫接种的个体的合适免疫反应以及用来自个体血清的个体抗体制备物鉴别。
超免疫反应抗原这样的片段的优选实例选自包含表1a和表1c的“推定的免疫原性氨基酸”栏和“鉴别的免疫原性区域的位置”的氨基酸序列的多肽，表2的血清反应性表位，尤其是包含如下氨基酸的多肽4-10，14-21，30-36，59-68，77-82，87-93，96-105，112-121，125-133，135-141，150-162，164-183，192-203，207-213，215-226，228-234，241-247，250-285，302-308和135-148位的Seq ID No 171；15-57，60-73，77-101，108-134，136-177，185-201，203-217，226-240，244-254，272-277，283-288，292-343，354-370，380-398，406-437，439-453，473-490，532-538，584-590，595-601，606-612，664-677，679-704，715-724，731-753，759-772，786-794，814-862和657-684位的Seq ID No 172；4-9，15-36，41-47，54-60，75-81，114-120，131-146，152-158，174-182，194-202，208-215，218-226，255-271，276-285，290-295，302-311，318-328，330-344，352-359，365-377，388-395，398-405，426-432，439-449，455-500，505-513，531-537，542-552，554-561，587-595，606-612，718-734，763-771，775-782，792-801，805-812，822-828，830-843，849-863，876-894，905-911，919-926，935-947，949-958，968-979，1009-1016，1029-1045，1047-1056，1076-1081，1092-1106，1123-1133，1179-1200，1202-1211，1215-1223，1287-1299，1301-1306，398-431和1224-1237位的Seq 1D No 173；17-47，74-80，90-97，126-133，137-148，167-173，179-185，214-223，250-255，270-283，329-338，342-350，352-358，360-367，372-383，398-404，411-421，426-432，435-446，452-462，472-479，515-521，582-592，611-618，623-629，642-659，666-673，678-689，704-725，732-737，744-757，768-789，824-834，842-849，862-868，877-887，904-916，923-928，941-947，962-974，982-992，1019-1030，1032-1044，1046-1052，1065-1075，1077-1087，1108-1121，1124-1132，1137-1151，1170-1182，1190-1206，1208-1214，1227-1233，1242-1251，1254-1273，1282-1298和792-825位的Seq ID No174；19-31，39-67，82-91，104-110，113-128，149-155，161-181和137-155位的Seq ID No 175；6-18，54-63，69-85，110-127，142-156，158-167，169-211，238-246，248-257，276-311，339-349，371-380，385-391，394-403，421-438，451-456，483-489和449-468位的Seq ID No 176；5-15，24-34，50-56，61-83，98-121，123-136，149-162，166-194，202-215，221-227，229-332，337-360，367-402，404-415，427-433，444-462，471-478，487-498，511-518，521-544，550-563，568-574，580-587，597-607，610-616，624-629和468-498位的Seq ID No 177；11-19，32-49，57-63，65-71，80-89，91-133，166-181，183-191，201-230，234-257，264-291，297-303，305-314，316-335，337-354，359-366，368-374，383-388，394-405，408-442，446-470，483-490，499-505，513-538，544-555，557-563，568-590，598-608，617-623，627-636，641-647，667-685，687-693，710-723，733-739，742-754，769-815和366-388位的Seq ID No 178；4-16，30-35，42-53，67-76，82-87，101-108，112-130，132-138，147-152，161-183，187-208，218-225，265-281，295-303，305-317，322-334，338-357，360-368，370-383，387-394，400-419，421-430和255-336位的Seq ID No 179；19-27，36-47，59-66，76-83，101-112，118-125，142-147，162-180，185-196，225-240，246-263，286-304，314-319，327-333，353-367和194-214位的Seq ID No 180；14-43，70-76，83-89，111-117，122-128，136-145，163-170，175-182，210-219，246-251，266-279，325-331，338-346，348-354，356-363，368-379，422-428，431-441，450-456，466-473，509-515，532-542，549-556，576-586，605-612，617-623，636-653，660-667，674-686，698-719，726-731，738-745，762-783，818-828，836-843，856-862，871-881，903-910，917-922，935-941，956-968，976-986，1013-1024，1026-1038，1059-1069，1071-1081，1102-1115，1118-1126，1131-1145，1164-1176，1187-1200，1202-1208，1221-1227，1236-1245，1248-1267，1273-1292，252-287和805-844位的Seq ID No 181；4-18，21-28，37-43，56-70，101-113，131-140，142-150，162-170，172-184，193-204，209-227，233-238，246-264和93-168位的Seq ID No 182；14-20，44-50，61-70，77-96，99-106，129-142，168-181，187-196，205-221，225-241，277-296和257-281位的Seq ID No 183；18-29，43-54，64-76，78-84，88-103，125-149，159-176，198-218，230-242，256-271，279-285，287-293，300-306，325-331，344-351，357-364，371-397，400-414，419-464，485-515，517-526，529-537，548-553，573-580，584-590，603-620，639-661，676-681，687-700，716-761，772-780，785-790，795-803，823-836，848-853和106-134位的Seq ID No 184；7-13，19-42，44-51，55-75，87-97，99-110，112-118，129-135，141-156，158-178，213-220，230-286，294-308，323-338，345-352，355-365，370-392，394-419，437-446，454-460，4741497，515-526，528-546，569-575和128-141位的Seq ID No 185；12-20，24-33，45-70，73-84，86-94，103-116，118-124，135-142，163-170，176-200，202-224，226-234，237-248，250-262，265-287，296-307，334-341，347-356，361-369，382-396，405-415，418-427，431-439，443-449，452-461，467-474和113-146位的Seq ID No186；13-38，44-50，52-59，66-72，83-94，103-110，116-124，131-137，158-180，199-204，218-233，241-264，269-317，326-342，350-356和70-86位的Seq ID No 187；29-35，49-59，63-84，86-97，103-111，113-126，130-144，150-158，174-198，221-231，250-264，266-273，291-298，310-318和70-90位的Seq ID No 188；19-25，28-52，60-66，71-76，131-142，149-155，157-178，181-213，218-223，237-242，250-257，260-266，272-279，282-290，321-330，373-385，393-407，441-453，461-475，509-521，529-542，577-589，597-610，643-655，663-677，703-718，729-734，358-464，495-570和604-685位的Seq ID No 189；4-29，51-76，116-136，158-173，179-193，207-215和86-111位的Seq IDNo 190；5-23，45-70，79-90，93-107，114-122，142-151和18-36位的SeqID No 191；9-51，68-120，133-149，158-180，186-206，211-220，222-237，248-293，296-310，317-339和248-260位的Seq ID No 192；14-24，44-63，69-98，108-119，123-136，155-161，164-176，180-193，203-208，215-223，239-247，274-281，283-289，296-304，306-313，315-327，331-341，343-353，357-386，392-405和205-246位的Seq ID No 193；5-13，16-23，36-42，53-63，70-83，96-102和14-34位的Seq ID No 194；4-13，19-35，49-56，59-76，83-107，121-134，144-153，157-164，166-186，194-202，209-216，231-253，257-264和98-134位的Seq ID No 195；16-32，38-47，58-68，78-89，98-114，117-123，132-141，146-156，164-170，179-188，196-212，219-230，232-237，244-263，265-274，278-293，297-303，306-326，339-349，352-359，362-367，373-379，384-394，396-406，423-443，451-461，465-484，490-497，504-511，523-533，537-547，550-556，558-566，573-579，586-593，598-609，615-642，647-665，671-686，693-713，723-728和332-378位的Seq ID No 196；6-21，34-44，58-64，66-74，79-87，114-127，129-143，154-162，174-189，205-214，241-262，266-273，278-297，319-324，328-338，342-351，390-398，409-415，422-435，458-464，471-477，481-486，506-531，534-540，542-550和315-389位的Seq ID No 197；4-28，39-45，52-58，69-82，93-115，122-128，135-140，146-163，177-192，209-215，221-232，271-284，331-337，341-352，360-378，383-390，392-401，409-422，428-435，462-470，474-480，482-496，531-539，541-549，551-560，562-569，576-582，598-618和98-127位的Seq ID No 198；14-27，33-47，61-79，94-104，119-133和36-60位的Seq ID No 199；11-22，29-40，48-62，68-73，96-106，108-118，125-149和102-126位的Seq ID No 200；4-11，45-55，76-83，86-102，105-112，138-144，147-153和20-48位的Seq ID No 201；12-20，28-56，62-68，72-82，93-99，101-107，120-133，135-145，178-186，208-232，279-292和36-64位的Seq ID No 202；6-14，23-48，65-82，92-134，140-181，188-219，228-238，244-253，255-261和124-145位的Seq ID No 203；11-25，31-38，53-59，62-71，89-99，125-133，151-157，182-190，195-203，208-215，219-229，249-262，267-275，287-295，298-316，318-325，328-334，344-353，357-363，371-377，385-391，396-415，425-436，438-457，471-485，538-552，554-561，606-625，630-636，646-653，669-679，695-704，706-715，722-747，763-773和714-738位的Seq ID No 204；10-29，33-45，50-60，70-79，83-95，118-124，136-157，176-184，192-205，207-216，223-234，240-246，258-268，275-283和37-56位的Seq ID No 205；4-24，27-38，46-54，66-72，81-97，112-119，128-137，152-157，173-179，185-214，219-225，227-248，262-284，286-295，301-307和117-134位的Seq ID No 206；26-43，49-56，60-71，74-82，87-98，110-116，131-146，154-164，169-178，183-189，205-214，241-246，255-268，275-292，305-314，316-323，326-340，346-363，397-402，419-429，440-446，452-461，467-475和29-66位的SeqID No 207；7-16，21-39，48-58，61-78，82-89，109-136，138-150，152-176，182-247，255-261，267-332，336-345，347-358，362-368，371-392，394-404，407-472，490-498，505-513，527-544，554-582，603-611，614-620，632-638和500-523位的Seq ID No 208；24-46，77-83，90-97，99-118，123-166，168-177，204-212，229-239，248-262，273-282，287-293，300-319，321-337，340-352，357-366，391-402，411-428，442-450，464-471，479-489和19-40位的Seq ID No 209；9-23，25-34，53-58，70-86，90-97，99-116，118-128，131-141，185-191，228-233，237-253，255-261，264-271，273-280，302-312，319-349，351-359，362-369，376-383，387-394，398-406，419-434和20-31位的Seq ID No 210；15-22，37-43，71-87，105-115，121-127，135-142，152-158和32-52位的Seq ID No 211；6-12，18-29，37-47，50-58，65-83，85-91，94-99，108-123，142-150，156-163，183-193，215-222，242-249，252-258，261-270，285-308，318-326和1-95位的Seq ID No 212；9-61，65-133，144-155，166-173，175-221，233-276，278-313，329-368和210-233位的Seq ID No 213；11-29，33-39，46-51，65-93，107-113，134-143，147-154，166-177，181-188，214-220，233-243，263-269和112-128位的Seq ID No 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221；8-18，44-76，102-109和49-57位的Seq ID No 222；5-14，28-40，42-51，54-60，77-83，89-100，117-124，146-172，176-204，216-231，237-244，267-278，324-334，342-348，396-401，427-433，438-450，452-457，465-471，473-481，491-500，509-515，523-544，550-556，558-569，589-595，606-618，625-632，640-649，665-671，678-688，691-698，717-723，728-734，781-789，800-805，812-821，833-868，873-879，889-905，929-939，988-998，1046-1061，1073-1079，1089-1096，1115-1124，1132-1140，1172-1196，1220-1226，1231-1249，1269-1277，1287-1301，1307-1330，1350-1361，1369-1378，1387-1412，1414-1420，1422-1439，1484-1491，1513-1529，1552-1561，1576-1583，1606-1613，1617-1640，1647-1654，1665-1679，1686-1698，1709-1727，1736-1743，1750-1757，1771-1790，1801-1807，1817-1823，1831-1842，1859-1868，1870-1882，1884-1891，1900-1906，1909-1914，1929-1935，1952-1960，1974-1988，2002-2011，2032-2063，2071-2081，2116-2124，2139-2147，2149-2159，2163-2190，2209-2215，2245-2253，2282-2287，2331-2342，2360-2370，2379-2393，2402-2408，2414-2421，2423-2430，2433-2439，2442-2450，2472-2478，2485-2493，2495-2503，2506-2512，2547-2554，2558-2564，2615-2625，2637-2652，2692-2698，2700-2706，2711-2723，2731-2740，2748-2753，2756-2762，2765-2772，2781-2798，2810-2824，2844-2852，2885-2899，2912-2922，2937-2944，2947-2970，2988-2998，3016-3025，3032-3037，3062-3071，3129-3148，3156-3161和530-607位的Seq ID No 223；31-36，57-62，79-85，90-96，99-112，120-146，162-185，193-203，208-217，219-226，239-253，283-290，298-304，306-321，340-349，351-361，365-372，386-395，407-438，473-486，537-551，558-568，576-594，598-604和75-95位的Seq ID No 224；14-19，24-30，34-42，45-52，54-64，66-82，95-105，107-118，126-163，171-177，184-201，210-215，260-269，273-279，288-304，321-327，358-364，370-375，380-387，394-404，407-413，421-431，436-451，465-474，504-511，531-552，578-587，614-626，629-636，638-671，691-715，719-729，733-745，752-759，768-777，785-792，794-802，805-824，844-854，867-880，885-891，893-902，907-924，939-948，955-964，966-975，987-1000，1012-1017，1023-1028，1050-1071，1083-1098，1102-1115，1133-1146，1170-1183，1204-1211，1213-1223，1262-1311，1313-1319，1346-1355，1366-1371，1383-1405，1409-1414和776-819位的Seq ID No 225；12-27，30-38，54-61，64-74，82-96，103-110，117-125，134-140，147-158，185-201，218-225，232-253，265-280，319-325，350-362，366-372，376-386，464-483，485-490，511-521，531-537，542-559，564-574，593-609，613-619，637-642，668-677和195-214位的Seq ID No 226；4-21，59-67，73-79，84-91，141-151，186-197，203-214，222-227，237-245，255-260，281-292，294-311，336-344，346-355，422-437，459-466，484-491和77-109位的Seq ID No 227；10-45，52-61，63-70，74-102，112-122，124-132，164-178，181-205，212-240，246-256和226-247位的Seq ID No228；38-50，53-63，78-87，89-111，126-152，169-176，179-186，193-228，254-267，275-282，288-304，309-318，325-341，346-353，358-367，384-395，404-427，429-435，456-465，467-501，510-521，523-536，541-548，552-560，563-584，589-595，597-620，625-637，639-645，661-666，712-729，734-741，743-750，775-806，809-816，818-840，842-850和693-714位的Seq ID No 229；5-17，30-37，52-75，77-86，88-107，112-135，151-160，178-222，226-246，263-270，279-294，306-314，327-342，345-352，374-381，389-416，422-429，435-449，453-467，473-500，512-522，524-531，542-549，552-560，565-571，575-586，594-600，613-619，625-633，635-641，647-653，667-674，680-699，711-729，735-741，764-775，781-786，792-798，805-813，817-825，833-842，850-855，860-866，869-910，917-930，949-990和533-562位的Seq ID No 230；7-14，39-46，61-74，83-89，93-99，110-121，136-150，172-180，182-200，207-216，223-236，238-251，265-271，280-288，294-309，320-336，339-354，362-377，383-389，401-407，435-441，446-453，460-465，472-487，499-511，518-528，533-540，557-570，572-587，631-637，643-658，663-669，672-678，681-687，695-706，714-728和118-139位的Seq ID No 231；5-19，24-30，56-64，69-79，93-100，102-111，117-123，125-133，174-182，185-199，205-224，268-275，311-336和102-125位的Seq ID No 232；6-35，39-45，57-62，80-85，92-106，117-122，126-171，214-223，253-260，268-273，285-291，295-306，315-320，325-336，361-366和172-202位的Seq ID No 233；4-13，24-37，45-51，58-66，84-92，112-121，132-141，151-171，175-195，204-212，222-240，262-268，276-295，305-336，338-348，354-362和160-183位的Seq ID No 234；10-16，24-35，41-73，78-104，111-121，124-139，141-148，150-164，196-215，224-241，249-282，299-307，315-357，368-378，393-401和345-367位的Seq ID No 235；4-32，48-53，61-67，84-104，112-118和106-130位的Seq ID No 236；21-28，31-36，65-81，98-105，115-121，123-131，136-142，155-161，177-190和201-232位的Seq ID No237；4-15，21-27，33-39，42-56，58-64，68-82，84-90，92-98，113-122，146-162，168-175，177-189，191-203，249-268，279-285，287-304，328-342，349-358，371-378，387-393，404-413，419-425，467-479，487-498，513-524，528-539，541-565，572-579，595-606，626-635，637-642和612-626位的Seq ID No 238；7-13，52-70，76-82，97-106，110-117和13-45位的Seq ID No 239；5-10，12-48，59-64，87-102，107-128，131-140，154-161，165-171，173-215和54-74位的Seq ID No240；4-11，19-28，34-40，74-81，87-98，126-147，163-171，184-193，205-213和49-124位的Seq ID No 241；7-14，23-29，35-40，61-67，99-106，111-122，124-133，135-161，187-206，216-229，236-245，262-268，271-280和256-273位的Seq ID No 242；4-13，17-37，47-54，85-99，105-113，120-132，147-166，180-186，192-199，204-216和127-144位的Seq ID No 243；14-27，29-37，52-62，68-76，89-96，117-123，125-131，137-145，166-195，205-212，214-222，228-235，258-264，271-281，288-296，308-324，332-339，355-361，365-371和268-293of Seq ID 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431；23-36，42-52，133-140，151-157，242-247，267-277，295-301，320-328，333-339，345-352，365-371，397-403，415-428，456-465，481-487，489-495，508-516，518-527，585-592，606-614，631-637，643-658，665-670，723-728，737-744，752-759，787-793，835-841，873-885，918-928，938-945，951-966，978-988，1015-1020，1030-1036，1044-1052，1058-1069，1071-1079，1081-1088，1113-1119，1125-1138，1141-1147，1164-1170，1172-1177，1190-1200，1214-1220，1230-1236，1239-1245，1262-1268，1270-1275，1288-1298，1312-1318，1328-1334，1337-1343，1360-1366，1368-1373，1386-1396，1410-1416，1426-1432，1435-1441，1458-1464，1466-1471，1484-1494，1508-1514，1524-1530，1533-1539，1556-1562和307-340位的Seq ID No 432；19-25，35-41，44-50，66-72，74-79，92-102，116-122，132-138，141-147，164-170，172-177，190-200，214-220，230-236，239-245，262-268，270-275，288-298，312-318，328-334，337-343，360-366，368-373，386-396，410-416，426-432，435-441，458-464，466-478，504-524，79-148，177-246，275-344和373-442位的Seq ID No 433；7-14，16-23，33-39，46-53，72-79，92-115，123-130，156-175，179-187，214-220，239-246，266-274，302-325，338-354，360-370，375-390，392-401，421-428，430-463和29-58位的SeqID No 434；4-9，22-39，58-65，72-82，87-92，99-104，107-119，143-166，171-177，194-202，205-213，220-228，231-240，247-263，309-315，317-323，336-343和294-320位的Seq ID No 435；4-10，12-18，24-29，34-43，50-65，70-76，111-117，129-138，152-159，166-171，184-195，200-210，224-236，241-251，274-283，285-296，313-319，332-341，348-355，378-386，410-416，433-445，475-482，523-529，531-540，584-596，626-633，674-680，682-688，738-750，780-787，828-834，836-842，853-862，882-887，893-912和604-676位的Seq ID No 436；15-38，49-57，60-99，103-119，124-194，200-206，215-249，251-291，307-313，315-347，369-378，383-390，393-400，405-411，423-435，440-447，454-460，470-486，490-503，532-539，542-549，551-567，579-592和509-583位的Seq ID No 437；38-44，47-88，95-103，157-172，235-240，250-260，263-276，294-300，312-317，331-337，369-391，412-419，442-448，453-463，490-529，537-555，571-580，600-617，619-627，642-648，682-687，693-700，716-722，738-748，756-763，779-789，796-802，820-828，833-840，846-853，862-872，880-887，894-899，924-937，957-963，1006-1012，1043-1049，1063-1069，1076-1097和124-147位的Seq ID No 438；4-28，31-49，60-71，75-102，104-114，134-144，160-184，250-257，277-285，287-294，330-338，345-351，367-374，381-388，393-399，402-407，420-426，443-448，458-464，411-436和454-488位的Seq ID No 439；20-27，45-55，57-64，66-77，98-106，130-137，155-165，167-174，176-187，194-203，208-223，227-238，245-251，257-270，273-278，287-299，330-345，352-358，363-385，392-399，410-417，437-443，467-484，486-492，495-500，504-516，526-536和219-270位的Seq ID No 440；11-22，24-31，46-63，65-71，73-88，95-109，174-181，183-201，204-212，216-222，228-233，241-247和142-221位的Seq ID No 441；8-28，51-59，67-84，93-98，140-152，154-162，183-188和91-125位的Seq ID No 442；10-22，27-61和69-100位的Seq ID No 443；7-15，18-26，94-100，126-131，152-165，219-228，254-263，274-292，297-308，333-340，342-352，354-371，373-379，403-410，420-438，450-456，463-470，489-495，503-512和97-173位的Seq ID No 444；4-21，37-43，49-65，67-74，76-90，113-119，131-141，155-173，175-189，192-199，207-221，247-254，266-276，317-322，337-343，387-393，408-428，439-448，451-460，469-479，482-487，493-501，517-523，533-542和480-503位的Seq ID N0445；11-26，40-46，78-86，93-103，121-126，132-138，166-177，183-196，203-212，214-221，228-263，304-311，323-338，345-351，357-363，379-393，420-434，442-448，518-527，547-553，581-591，602-609，637-645，665-674，687-692，701-708，730-739，796-802，844-857，882-888，903-914，944-950，976-983，1027-1033，1049-1057，1066-1072，1085-1092，1120-1127，1137-1144，1153-1158，1165-1176，1181-1187，1221-1230，1238-1244，1269-1274和605-632位的Seq ID No 446；6-47，57-65，83-95，109-121，138-147，154-164，167-177，194-200，202-212，227-234，240-253，260-267，283-291，320-329，340-347，356-364，412-422，430-436，441-459，465-475，478-486，498-507和59-84位的SeqID No 447；10-21，58-83，88-97，120-126和21-51位的Seq ID No 448；5-39，56-62，76-88，90-114，138-162，170-195，202-221，228-250，264-270，304-355，374-387，391-416，462-471，526-546，554-561，574-579，639-645，651-660，674-682，689-694和666-697位的Seq ID No 449；6-30，36-42，143-157，176-197，202-209，216-233，241-246，275-287，292-299，315-325，343-350，375-380，397-403，411-420，422-434，441-448，467-474，477-499，555-568，591-597，601-609，623-644，667-688，692-698，703-718，736-747，757-766，782-791，795-801，832-840，859-865和226-269位的Seq ID No 450；6-23，43-51，61-67，73-82，91-97，123-130，149-158，164-175，228-234，240-246，248-255，262-272，326-332，340-347，365-371，377-388，409-419，425-431，438-445，449-457，464-470，496-507，559-568，575-581，603-608，617-623，633-639，648-654，659-670，695-701，734-752，806-814，816-829，861-868，891-899，904-909，937-945，947-960，978-983，992-999，1022-1031，1068-1076，1078-1091，1109-1114，1123-1130，1153-1162，1199-1207，1209-1222，1254-1261，1284-1293，1330-1338，1340-1353，1371-1376，1385-1392，1415-1421，1433-1438，1460-1465，1470-1492和1422-1458位的Seq ID No 451；82-94，111-118，125-131，206-212，261-266，310-320，328-338，345-351，353-360，414-420，424-434，440-447，451-500，506-516，548-561，566-572，584-591，601-622，630-636，650-659，661-667，674-699，703-711，717-729，736-744，752-759，765-771，813-822，826-842，852-868，870-877，881-895，897-906，913-922和602-671位的Seq ID No 452；12-18，20-25，43-54，56-65，73-79，82-88，99-111，136-142，153-169，171-183，195-223，229-248，255-260，272-277，281-292，298-319，322-329，332-351，363-379，381-389和275-304位的Seq ID No 453；4-9，34-48，65-77，101-106，111-131，138-153，186-191，230-250和148-219位的Seq ID No454；4-23，30-35，42-53，67-76，82-87，101-108，112-130，132-138，147-152，161-183，187-208，218-225，265-283，295-303，306-317，322-334，338-357，360-368，370-383，387-398，400-419，421-430，104-182和240-304位的Seq ID No 455；4-12，63-69，94-102，146-164，166-173，175-181，193-207，263-281，286-295，301-306，330-343，369-378，382-388，414-420，422-430，438-454，456-462，472-531，543-560，581-591，596-605，614-623，626-635，656-662，669-676，683-690，693-698，705-711，728-736，752-764和69-102位的Seq ID No456；6-12，43-53，141-147，164-179，185-195，197-206，227-235，237-271，288-305，308-317，335-341，351-357，365-376，386-395，397-416，422-447和11-35位的Seq ID No 457；16-24，50-65，73-84，88-99，114-124，130-146，181-187，193-203，214-220，236-247，250-258，287-297和50-113位的Seq ID No 458；4-25，50-55，76-82，117-123，131-137，139-148，157-166，239-245，253-258，266-275，277-292，300-306，51-83和93-161位的Seq ID No 459；6-22，34-43，51-86，93-100，110-116，150-161，164-171，180-187，197-218和168-237位的Seq ID No460；4-27，55-60，74-82和10-46位的Seq ID No 461；6-19，25-31，43-49，60-79，88-100，105-129，148-161，164-171，187-193，243-263，316-322，334-340，369-378，381-391，398-404，460-466，474-483，502-509，511-517，525-530，558-567，579-596，622-627，631-638，641-651，653-659，674-680，687-693，710-716，720-727，743-753，760-775，788-795，806-813，821-828，836-842，847-860，865-880和258-377位的Seq ID No 462；4-11，25-64，71-79，88-94，107-120，123-132，167-188，231-237，240-246，261-267，306-311，330-342，351-358，389-395，406-418，429-434，439-448，483-501，511-520和71-143位的Seq ID No463；4-18，22-27，53-64，94-100，121-127，133-139，155-164，177-182，187-196，206-218，224-242，248-253，258-277和184-253位的Seq ID No464；10-17，56-67，72-82，94-99，106-113，166-173，229-235，243-283，295-301，313-321，326-331，342-348，396-414，423-435，446-452，454-462，496-502，511-534，543-556，563-570，586-593，616-626，638-645，653-662，679-696，731-737，766-774，776-782，790-796，810-817，825-835，837-846和540-615位的Seq ID No 465；13-24，30-36，73-81，89-95，109-115，117-143，161-173，179-189，226-244，251-261，275-281，298-305，307-315，323-328，364-374，69-186和264-354位的Seq 1D No 466；19-25和6-22位的Seq 1D No 467；6-39，59-68和43-62位的Seq ID No 468；6-14，22-32和1-27位的Seq ID No 469；4-41和28-40位的Seq ID No 470；8-14和4-19位的Seq ID No 471；4-10，12-22，30-35和6-33位的Seq ID No 472；4-16，24-33和37-54位的Seq ID No473；2-23位的Seq ID No 474；4-21，27-33，36-41和14-34位的Seq IDNo 475；4-14，24-30，37-42，57-78，83-89，94-103，113-131和100-122位的Seq ID No 476，以及包含所述序列至少6个优选地多于8个尤其多于10个氨基酸并且优选地不多于70、50、40、20、15或11个氨基酸的片段。所有这些片段单独地并且每一个独立地形成了本发明优选的挑选的方面。
通过一套长度至少10个氨基酸有1个氨基酸重叠的肽分析蛋白质抗原的全部序列可以鉴别特定抗原的所有线性超免疫血清反应片段。随后，通过使用表达的全长蛋白质或其结构域多肽的用超免疫血清分析蛋白质抗原可以鉴别非线性表位。假设蛋白质独特的结构域足够形成不依赖于天然蛋白质的3D结构，各个重组或合成产生的结构域多肽用超免疫血清的分析将允许在多结构域蛋白质各个结构域内的构象抗原结构域的鉴别。对于结构域拥有线性以及构象性表位的那些抗原，用相应于线性表位的肽的竞争试验可用于证实构象性表位的存在。
将理解本发明尤其也涉及编码前面提到的片段的核酸分子，杂交编码片段的核酸分子的核酸分子，特别是在严格条件下杂交的那些，以及用于扩增编码片段的核酸分子的例如PCR引物的核酸分子。在这些点上，优选的核酸分子是如上面讨论的相应于优选片段的那些。
本发明也涉及包含本发明的一个或多个核酸分子的载体、用本发明的载体进行基因工程的宿主细胞以及通过重组技术的超免疫血清反应性抗原及其片段的产生。
大量的表达载体能用于表达根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段。一般，适于维持、繁殖或表达核酸以在宿主中表达多肽的任何载体可以用于在这方面的表达。与本发明的这个方面一致，载体可以例如是质粒载体、单或双链噬菌体载体、单或双链RNA或DNA病毒载体。此处公开的起始质粒或者是市售可获得的、公开可获得的，或者通过众所周知的公开的程序的常规应用能从可获得的质粒构建。在某些方面，载体之中优选的是为了本发明的核酸分子和超免疫血清反应性抗原或其片段的表达的那些。宿主细胞中的核酸构建体能以传统方式用于产生重组序列编码的基因产物。或者，本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段能通过传统肽合成器合成产生。成熟的蛋白质能表达于哺乳细胞、酵母、细菌或其它在合适的启动子控制下的细胞。使用来源于本发明的DNA构建体的RNA，也能采用无细胞的翻译系统以产生这样的蛋白质。
能对宿主细胞进行基因工程化以整合核酸分子和表达本发明的核酸分子。合适宿主的代表性实例包括例如肠球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、链霉菌和枯草芽孢杆菌的细菌细胞；例如酵母细胞和曲霉属细胞的真菌细胞；例如果蝇S2和夜蛾Sf9细胞的昆虫细胞；例如CHO，COS，Hela，C127，3T3，BHK，293和Bowes黑素瘤细胞的动物细胞；以及植物细胞。
本发明也提供了产生粪肠球菌超免疫血清反应性抗原及其片段的方法，包括从宿主细胞表达本发明提供的核酸分子编码的超免疫血清反应性抗原或其片段。本发明还提供了产生表达粪肠球菌超免疫血清反应性抗原或其片段的细胞的方法，包括用根据本发明的载体转化或转染合适的宿主细胞使得转化的或转染的细胞表达载体中含有的核酸编码的多肽。
可以以例如融合蛋白质的修饰形式表达多肽，并且多肽可以不仅包括分泌信号还有额外的异源性功能区域。因而，例如，尤其是带电荷氨基酸的额外氨基酸区域可以加到多肽的N或C末端以改进在纯化过程中或随后的操作和储存过程中在宿主细胞中的稳定性和持续性。区域也可加到多肽以促进纯化。这样的区域可以在多肽的最后制备之前去除。多肽基团加到多肽以引起分泌或排泄、以改进稳定性或促进纯化在其它之中是本领域熟悉的和常规的技术。优选的融合蛋白质包含对于溶解或纯化多肽是有用的来自免疫球蛋白的异源性区域。例如，EP-A-O 464 533(加拿大相应申请2045869)公开了包含免疫球蛋白分子的恒定区不同部分和另一个蛋白质或其部分的融合蛋白质。在药物发现中，例如，为了鉴别拮抗剂的高通量筛选试验的目的蛋白质已经与抗体Fc部分融合。见例如{Bennett，D.等人，1995}和{Johanson，K.等人，1995}。
通过众所周知的方法能从重组细胞培养物中重新获得和纯化粪肠球菌超免疫血清反应性抗原或其片段，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱。
通过化学合成以及通过生物工程手段能生产根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段。后者包含了用含有根据本发明的核酸的载体转染或转化宿主细胞，以及在本领域技术人员已知的条件下培养转染或转化的宿主细胞。为了纯化或分离要生产的多肽的生产方法也可以包含纯化步骤。优选的实施方案中载体是根据本发明的载体。
根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段可用于含有这些生物体或其衍生的多肽的样品中一个或多个生物体的检测。优选的这样的检测是为了诊断，更加优选地为了疾病的诊断，最优选地为了与革兰氏阳性细菌的存在或丰度相关或相联的疾病的诊断，尤其是选自肠球菌、葡萄糖球菌和乳球菌的细菌。更加优选地，微生物选自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)和变形链球菌(Streptococcus mutans)，尤其微生物是粪肠球菌。
本发明也涉及诊断试验，例如用于检测细胞和组织中本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段的水平的定量和诊断试验，包括正常和异常水平的测定。所以，例如，根据本发明，为了检测与正常组织样品相比多肽的过度表达的诊断试验可以用于检测感染的存在，以及鉴别感染生物体。能用于测定源自宿主的样品中多肽水平的试验技术对于本领域技术人员是众所周知的。这样的试验方法包括放射免疫试验、竞争结合试验、Western斑点分析和ELISA试验。这些之中，ELISA常常是优选的。ELISA试验最初包含制备特异于多肽的抗体，尤其是单克隆抗体。另外，一般地制备了结合于单克隆抗体的报告抗体。报告抗体附着于检测试剂，例如放射活性的、荧光的或酶试剂，例如辣根过氧化物酶。
根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段可用于阵列的目的或与其相关。更加特别的，至少一个根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段可以固定于支持物上。所述支持物一般包含各种超免疫血清反应性抗原及其片段，由此可以使用一种或一些根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段和/或不同的超免疫血清反应性抗原及其片段产生多样性。这样的阵列以及任何阵列的特征性特性一般是独特的多肽固定于所述支持物或其表面上独特的或预先定义的区域或位置上。因为这个，阵列独特位置或区域上的任何活性与特异性多肽相关。不同超免疫血清反应性抗原及其片段固定于支持物的数量可以在从10个那么少到几千个不同超免疫血清反应性抗原及其片段的范围内。优选实施方案中每cm2超免疫血清反应性抗原及其片段的密度是从每cm210个肽/多肽那么少到每cm2至少400个不同肽/多肽，更加特别的每cm2至少1000个不同超免疫血清反应性抗原及其片段。
这种阵列的生产对于本领域的技术人员是已知的，例如，在美国专利5,744,309中有描述。阵列优选地包含具有至少第一个表面的平坦的、多孔或非多孔的固相支持物。如此出公开的超免疫血清反应性抗原及其片段固定于所述表面。其它之中优选的支持物材料是玻璃或纤维素。为了此处描述的任何诊断应用使用矩阵也在本发明内。除了根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段外，为了如上面描述的阵列的产生也可以使用根据本发明的核酸。这个也应用于抗体制成的阵列，优选地其它之中如此处描述的单克隆抗体。
另一方面本发明涉及指向任何根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段、其衍生物或片段的抗体。本发明包括例如单克隆和多克隆抗体、嵌合、单链和人源化抗体，以及Fab片段或Fab表达文库的产物。抗体可以是嵌合的也在本发明之内，即它们的不同部分源自不同种属或者至少各自的序列取自不同的种属。
通过将超免疫血清反应性抗原及其片段直接注射到动物或者通过给予优选非人类的动物超免疫血清反应性抗原及其片段，能够获得产生的抗相应于本发明的序列的超免疫血清反应性抗原及其片段的抗体。然后如此得到的抗体将结合超免疫血清反应性抗原及其片段本身。以这个方式，甚至仅仅编码超免疫血清反应性抗原及其片段的一个片段的序列能用于产生结合整个天然超免疫血清反应性抗原及其片段的抗体。然后这样的抗体能用于从表达那些超免疫血清反应性抗原及其片段的组织中分离超免疫血清反应性抗原及其片段。
为了单克隆抗体的制备，能够使用本领域已知的提供连续细胞系培养物产生的抗体的任何技术(如原先{Kohler，G.等人，1975}中描述地)。
能使为了单链抗体的产生描述的技术适应于产生抗根据本发明的免疫原性的超免疫血清反应性抗原及其片段的单链抗体。转基因小鼠或例如其它哺乳动物的其它生物体可以用于表达抗根据本发明的免疫原性超免疫血清反应性抗原及其片段的人源化抗体。
或者，噬菌体展示技术或核糖体展示能用于从筛选拥有各自靶抗原的人类淋巴细胞的PCR扩增v-基因文库或从幼稚文库挑选对超免疫血清反应性抗原及其片段有结合活性的抗体基因{McCafferty，J.等人，1990}；{Marks，J.等人，1992}。也能通过链改组(chain shuffling){Clackson，T.等人，1991}改进这些抗体的亲和力。
如果存在两个抗原结合结构域，每个结构域可以指向不同的表位-称为“双特异性”抗体。
上面描述的抗体可以应用于分离或鉴别表达超免疫血清反应性抗原及其片段的克隆或为了用亲和色谱的分离和/或纯化通过将抗体附着于固相支持物而纯化本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段。
因而，抗本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段的抗体尤其可以应用于抑制和/或治疗感染，特别是细菌感染，特别是来自粪肠球菌的感染。
超免疫血清反应性抗原及其片段包括抗原性、表位或免疫原性等同的衍生物，它形成了本发明的特定方面。如此处使用的术语“抗原性等同衍生物”包含某些抗体特异性识别的超免疫血清反应性抗原及其片段或其等同物，所述抗体当针对根据本发明的蛋白质或超免疫血清反应性抗原及其片段培养时，干扰病原体和哺乳动物宿主之间的相互作用。如此处使用的术语“免疫原性等同衍生物”包含肽或其等同物，当其用于合适的制剂以在脊柱动物中培养抗体时，抗体起干扰病原体和哺乳动物宿主之间相互作用的作用。
超免疫血清反应性抗原及其片段，例如抗原性或免疫原性等同衍生物或其融合蛋白能够用作抗原以免疫小鼠或例如大鼠或小鸡的其它动物。融合蛋白质可以给超免疫血清反应性抗原及其片段提供稳定性。抗原可以例如通过结合连接于例如牛血清白蛋白(BSA)或匙孔血蓝蛋白(KLH)的免疫原性载体蛋白质。或者，包含蛋白质或超免疫血清反应性抗原及其片段多个拷贝的抗原肽或抗原性、免疫原性等同的超免疫血清反应性抗原及其片段可以有足够的抗原性以改进免疫原性而避免载体的使用。
优选地，修饰抗体或其衍生物使其在个体有更少的免疫原性。例如，如果个体是人，抗体最优选地可以是“人源化的”，其中杂交瘤衍生的抗体的互补决定区域被接种到人单克隆抗体，例如如{Jones，P.等人，1986}或{Tempest，P.等人，1991}中描述地。
本发明的多核苷酸在基因免疫中的使用将优选地采用合适的递送方法，例如质粒DNA直接注射入肌肉，与特异性蛋白质载体复合的DNA的递送，用磷酸钙的DNA共沉淀，DNA包装在各种形式的脂质体中，粒子轰击{Tang，D.等人，1992}，{Eisenbraun，M.等人，1993}以及使用克隆的逆转录病毒载体的体内感染{Seeger，C.等人，1984}。
一方面本发明涉及结合于根据本发明的任何超免疫血清反应性抗原及其片段的肽，以及这样肽的生产方法，由此所述方法特征在于根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段的使用，并且基础步骤对于本领域的技术人员是已知的。
可以通过使用根据本领域技术的方法产生这样的肽，例如噬菌体展示或核糖体展示。在噬菌体展示的情况下，基本上产生了噬菌体形式的肽的文库，这种文库与靶分子接触，在这个情况下是根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段。随后从各自的反应中去除那些结合于靶分子的肽，优选地是与靶分子的复合物。结合的特性至少在某个程度依赖于例如盐浓度等等特定实行的实验设置是本领域技术人员已知的。结合于有更高的亲和力或更大力量的靶分子的那些肽从文库的非结合成员分离之后，并且可选地也在靶分子从靶分子与肽的复合物去除后，随后可以特征分析各自的肽。特征分析之前，可选地实行扩增步骤，例如通过增殖编码肽的噬菌体。特征分析优选地包含靶结合肽的测序。基本上，肽不限制它们的长度，然而优选地在各自的方法中优选地得到具有从大约8至20个氨基酸的长度的肽。文库的大小可以是大约102至1018，优选地108至1015个不同的肽，然而并不限于这些。
特定形式的靶点结合超免疫血清反应性抗原及其片段是所谓的“抗促成素”，在其它之中它们在德国专利申请DE 197 42 706中有描述。
在另一方面本发明涉及与任何的根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段相互作用的功能性核酸，以及这样功能性核酸的生产方法，由此所述方法特征在于根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段的用途，并且基础步骤对于本领域的技术人员是已知的。功能性核酸优选地是适体和镜面体。
适体是单链或双链的、并且特异性与靶分子相互作用的D-核酸。适体的生产或挑选在例如欧洲专利EP 0 533 838中有描述。基本上实行了下面的步骤。首先，提供了核酸的混合物，即潜在的适体，由此每个核酸一般包含一些优选地至少8个随后随机的核苷酸的片段。这个混合物随后与靶分子接触，由此例如基于与候选混合物对靶点增加的亲和力或对靶点更大的力量核酸与靶分子结合。随后从剩余的混合物中分离结合核酸。可选地，使用例如多聚酶链式反应扩增这样得到的核酸。这些步骤可以重复数次，只要最后混合物具有增加的特异性结合于靶点的核酸的比例，然后可选地从中挑选最终结合核酸。这些特异性结合的核酸指的是适体。很明显在适体的生产或鉴别方法的任何阶段，为了使用标准技术测定它的序列可以采集个体核酸混合物的样品。例如通过引入对产生适体的技术领域技术人员已知的定义的化学基团可以稳定适体在本发明之内。这样的修饰例如可以存在于氨基基团在核苷酸糖基团2’位置的引入。适体目前用作治疗剂。然而，这样挑选的或产生的适体可以用于靶点确认和/或用作优选基于小分子药剂的药剂开发的先导物质也在本发明之内。这个实际上通过竞争试验完成，由此候选药物抑制靶分子和适体之间特异性相互作用，由此在适体从靶点和适体的复合物取代时，可以假设各自的候选药物允许靶点和适体之间相互作用的特异性抑制，如果相互作用是特异性的，所述候选药物将至少在原则上适于阻断靶点并因而降低其在包含这样靶点的各自的系统中的生物利用度或活性。这样得到的小分子可以进行进一步的衍生化和修饰以优化其物理、化学、生物和/或医学特征，例如毒性、特异性、生物降解度和生物利用度。
镜面体和它们的产生或制造基于一个简单的原则。镜面体的制造在国际专利申请WO 98/08856中有描述。镜面体是L-核酸，这是指它们由L-核苷酸而不是象适体的D-核苷酸组成。镜面体特征在于它们在生物系统具有非常高的稳定性并且与适体相比特异性地与它们指向的靶分子相互作用这个事实。产生镜面体的方法中，产生了D-核酸的异源群，这个群与靶分子的光学对映体接触，在这个情况下例如与根据本发明超免疫血清反应性抗原及其片段的天然发生的L-对映体的D-对映体接触。随后，分离不与靶分子的光学对映体相互作用的那些D-核酸。但是分离、可选地鉴别和/或测序与靶分子的光学对映体相互作用的那些D-核酸，随后基于从D-核酸获得的核酸序列信息合成相应的L-核酸。就与靶分子的光学对映体相互作用的前面提到的D-核酸的序列而言相同的这些L-核酸将特异性地与天然发生的靶分子而不是它的光学对映体相互作用。与适体产生的方法相似，重复各种步骤几次并因而浓集特异性与靶分子的光学对映体相互作用的那些核酸是可能的。
在另一方面，本发明涉及与根据本发明的任何核酸分子相互作用的功能性核酸，以及这样功能性核酸的制造方法，由此所述方法特征在于根据本发明的核酸分子和它们各自序列的用途并且基础步骤对于本领域技术人员是已知的。功能性核酸优选地是核酶、反义寡核苷酸和siRNA。
核酶是催化活性的核酸，优选地由基本上包含两个基团的RNA组成。第一个基团显示了催化活性而第二基团负责与靶核酸的特异性相互作用，在这个情况下是编码根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段的核酸。靶核酸和核酶第二基团相互作用时，一般通过两个杂交链上基本上互补的碱基的延伸杂交和Watson-Crick碱基配对，催化活性基团可以变成有活性的，就是指它或者分子内或者分子间催化核酸分子，倘若核酶的催化活性是磷酸二酯酶活性。随后，可以有靶核酸进一步的降解，最后导致了靶核酸以及源自所述靶核酸的蛋白质的降解。核酶、它们的使用和设计原则对于本领域技术人员是已知的，例如{Doherty，E.等人，2001}和{Lewin，A.等人，2001}中有描述。
用于药剂的制造以及作为诊断试剂的反义寡核苷酸的活性和设计分别基于作用的相同模式。基本上，反义寡核苷酸基于碱基互补与靶RNA优选地与mRNA杂交，因而激活RNase H。RNase H被磷酸二酯和硫代磷酸酯偶联的DNA激活。然而除了硫代磷酸酯偶联的DNA以外，磷酸二酯偶联的DNA很快地被细胞内核酶降解。这些抗性的非天然发生DNA衍生物在与RNA杂交时不抑制RNase H。换而言之，反义聚核苷酸仅仅作为DNA RNA杂交复合物是有效的。这种反义寡核苷酸的实例在其它之中的美国专利US 5,849,902和US 5,989,912。换言之，基于靶分子的核酸序列，在这个情况下靶分子是根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段的核酸分子，可以基于碱基互补的原则，从原则上可从其推测的各自的核酸序列的靶蛋白质或者通过了解尤其是mRNA这样的核酸序列设计合适的反义寡核苷酸。
特别优选的是具有硫代磷酸酯DNA(3至9个碱基)的短的延伸的反义寡核苷酸。最少3个DNA碱基对于细菌RNase H的激活是必需的，最少5个碱基是哺乳动物RNase H激活必需的。在这些嵌合寡核苷酸中有形成RNase H底物的中心区域，它与由不形成RNase H底物的修饰的核苷酸组成的杂交“臂”侧面相接。可以例如通过2’-氧-甲基或2’-氟修饰嵌合寡核苷酸的杂交臂。替代的方法使用了所述臂中的甲基膦酸酯或氨基磷酸酯连接。本发明的实践中有用的反义寡核苷酸进一步实施方案是对甲氧基寡核苷酸，部分对甲氧基寡脱氧核糖核酸或对甲氧基寡核苷酸。
本发明尤其相关和有用的是如上面提到的两个美国专利更加特别描述的那些反义寡核苷酸。这些寡核苷酸不含有天然发生的5′→3′-连接的核苷酸。更合适的寡核苷酸具有两个类型的核苷酸激活RNase H的2’-脱氧硫代磷酸酯和不激活RNase H的2’修饰的核苷酸。2’-修饰的核苷酸之间的连接是磷酸二酯、硫代磷酸酯或对乙氧基磷酸二酯。通过连续的RNase H激活区域完成RNase H的激活，所述激活区域含有3和5个之间的2’脱氧硫代磷酸酯核苷酸以激活细菌RNase H以及5和10个之间的2’脱氧硫代磷酸酯核苷酸以激活真核特别是哺乳动物RNase H。通过使5’和3’末端碱基高度核酶抗性以及可选地通过取代3’末端阻断基团完成对于降解的保护。
更加特别地，反义寡核酸包含5’末端和3’末端；从位置11至595′→3′-连接的核苷酸独立地选自2’修饰的磷酸二酯核苷酸和2’修饰的对烷氧基磷酸三酯核苷酸；其中5’末端核苷酸附着于三和十个连续的硫代磷酸酯连接的脱氧核糖核酸之间的RNase H激活区域，其中所述核苷酸3’末端选自反转的脱氧核糖核酸、一至三个硫代磷酸酯2’修饰的核糖核酸的连续延伸、生物素基团和对烷氧基磷酸三酯核苷酸。
也可以使用反义寡核苷酸，其中不是5’末端核苷酸而是上面详述的3’末端核苷酸附着于RNase H激活区域。5’末端也选自特定的基团，而不是所述寡核苷酸的3’末端。
根据本发明的核酸以及超免疫血清反应性抗原及其片段可以用作或用于尤其是疫苗的药物组合物的制造。优选是疫苗的这样的药物组合物，优选地是为了粪肠球菌造成的、相关的或相联的疾病的预防和治疗。在这个范围内本发明的另一方面涉及诱导尤其是哺乳动物的个体的免疫反应的方法，包含用本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段或其片段或变异体接种个体，足够生产抗体以保护所述个体免受感染，特别是肠球菌感染并且最特别的肠球菌的感染。
仍然本发明的另一方面，涉及诱导个体免疫反应的方法，包含通过基因治疗或其它，递送核酸功能性编码超免疫血清反应性抗原及其片段或其片段或变异体以体内表达超免疫血清反应性抗原及其片段或其片段或变异体，目的是为了诱导产生抗体或细胞介导的T细胞反应的免疫反应以保护所述个体免受疾病，不管那个疾病是否已经在个体内确定，T细胞可以是产细胞因子的T细胞或细胞毒性T细胞。给予基因的一个方法是通过加速作为颗粒上的涂层或其它的基因进入期望的细胞内。
本发明的另一方面涉及免疫组合物，当被引入能够诱导宿主内免疫反应的宿主内时，它能诱导这样的宿主内的免疫反应，其中所述组合物包含编码和表达本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段的抗原的重组DNA。可以治疗性或预防性地使用免疫反应，可以采用抗体免疫或细胞免疫的形式，例如源自CTL或CD4+T细胞的细胞免疫。
本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段或其片段可以与本身可能不产生抗体但是能够稳定第一个蛋白质并产生将具有免疫性和保护特性的融合蛋白质的辅蛋白质(co-protein)融合。这个融合的重组蛋白质优选地进一步含有抗原性辅蛋白质，例如谷胱甘肽S转移酶(GST)或β-半乳糖苷酶，溶解蛋白质并促进其产生和纯化的相对大的辅蛋白质。另外，辅蛋白质在提供免疫系统全面刺激的意义上起佐剂的作用。辅蛋白质可以附着于第一个蛋白质的氨基端或羧基端。
本发明也提供的是在粪肠球菌感染的动物模型中在这样的基因免疫实验中使用所述核酸分子或者其特定片段的方法。这样的片段对于鉴别能引发预防性或治疗性免疫反应的蛋白质表位尤其有用。这个方法能允许随后从成功抵抗或清除感染的动物的必备器官制备有特别价值的单克隆抗体以开发尤其是人类的哺乳动物中肠球菌感染的预防试剂或治疗处理。
超免疫血清反应性抗原及其片段可以用作宿主免疫接种的抗原以产生抗细菌入侵的保护的特异性抗体，例如通过阻断细菌对损伤组织的粘附。组织损伤的实例包括例如机械、化学或者通过留置装置的植入造成的皮肤或结缔组织以及粘膜组织的伤口，或者例如口腔、乳腺、尿道或阴道的粘膜的伤口。
本发明也包括包含免疫原性重组蛋白质和合适载体的疫苗制剂。因为蛋白质可以在胃内降解，优选地它通过非胃肠道给予，包括例如皮下、肌肉内、静脉、皮内、鼻内或经皮的给予。适于非胃肠道给予的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，它可以含有赋予制剂与个体的优选是血液的体液等渗的抗氧化剂、缓冲剂、细菌抑制剂和溶质；水性和非水性的无菌悬浮液，它可以包括悬浮剂或增稠剂。制剂可以呈现在单位剂量或多个剂量的容器内，例如密封的安瓿和药瓶，可以储存于冷冻干燥条件下，只需要使用前立即加入无菌液体载体。疫苗制剂也可以包括增强制剂免疫原性的佐剂系统，例如水包油系统和本领域已知的其它系统。剂量将依赖于疫苗的特异性活性并能很容易地通过常规试验测定。
根据另一方面，本发明涉及包含如本发明为了粪肠球菌提供的这样的超免疫血清反应性抗原及其片段的药物组合物。这样的药物组合物可包含一个优选地至少两个或两个以上的抗粪肠球菌的超免疫血清反应性抗原及其片段。可选的，这样的粪肠球菌超免疫血清反应性抗原及其片段在联合药物组合物中也可与抗其它病原体的抗原联合。优选地，所述药物组合物是为了预防或治疗粪肠球菌和/或其它病原体造成的感染的疫苗，疫苗中包括了抗所述病原体的抗原。
根据另一方面，本发明涉及包含编码上面鉴别的对于粪肠球菌的超免疫血清反应性抗原或其片段的核酸分子的药物组合物。这样的药物组合物可以包含一个或多个编码抗粪肠球菌的超免疫血清反应性抗原或其片段的核酸分子。可选地，编码超免疫血清反应性抗原或其片段的这样的粪肠球菌核酸分子在联合药物组合物中也可以与编码抗其它病原体的抗原的核酸分子联合。优选地，所述药物组合物是为了预防或治疗粪肠球菌和/或其它病原体造成的感染的疫苗，疫苗中包括了抗上述病原体的抗原。
药物组合物可含有任何适合的辅助物质，例如缓冲物质、稳定剂或另外的活性成分，尤其是已知与药物组合物和/或疫苗生产有关的成分。
根据本发明的超免疫血清反应性抗原、片段或其编码核酸分子的优选的载体和/或赋形剂是为了进一步刺激对给定的超免疫血清反应性抗原、其片段或其编码核酸分子的免疫反应的免疫刺激化合物。优选地根据本发明的药物制备物中的免疫刺激化合物选自尤其是聚阳离子肽的聚阳离子物质、优选是免疫刺激脱氧核苷酸的免疫刺激核酸分子、明矾、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、尤其是人生长激素的神经活性化合物或其组合。
尤其是疫苗的药物组合物除根据本发明的超免疫血清反应性抗原、其片段和/或其编码核酸分子外还包含有生物或药物活性的其它化合物也在本发明的范围内。优选地，疫苗组合物包含至少一个聚阳离子肽。根据本发明使用的聚阳离子化合物可以是显示了根据WO97/30721的特征作用的任何聚阳离子化合物。优选的聚阳离子化合物选自碱性多肽、有机聚阳离子、碱性聚氨基酸或它们的混合物。这些聚氨基酸应当具有至少4个氨基酸残基的链长度(WO 97/30721)。尤其优选的是象聚赖氨酸、聚精氨酸和在多于8个尤其是多于20个氨基酸残基的范围内含有多于20％尤其多于50％的碱性氨基酸的多肽的物质或者它们的联合。其它优选的聚阳离子和它们的药物组合物在WO97/30721(例如聚乙烯亚胺)和WO 99/38528中有描述。优选地这些多肽含有20和500个之间的氨基酸残基，尤其是30和200个之间的残基。
这些聚阳离子化合物可以化学或重组产生或可以来源于天然的来源。
阳离子(多)肽也可以是抗微生物的，有如{Ganz，T.，1999}中综述的特性。这些(多)肽可以是原核的或动物或植物来源的或者可以化学或重组产生(WO 02/13857)。肽也可以属于防卫素类(WO02/13857)。这样的肽的序列例如能在下面网址的抗微生物序列数据库中找到http://www.bbcm.univ.trieste.it/～tossi/pag2.html这样的宿主防御肽或防御物质也是根据本发明的聚阳离子多聚体的优选形式。一般地，允许作为优选地由APC(包括树突细胞)介导的适应性免疫系统的终末产物激活(或下调)的化合物用作聚阳离子多聚体。
尤其优选用作本发明的聚阳离子物质是cathelicidin衍生的抗微生物肽或其衍生物(国际专利申请WO 02/13857，此处引用作为参考)，尤其是源于哺乳动物cathelicidin的抗微生物肽，优选地来自人、牛或小鼠。
源于天然来源的聚阳离子化合物包括HIV-REV或HIV-TAT(衍生的阳离子肽、触角足肽、壳聚糖或甲壳素其它的衍生物)或源于生化或重组产生的这些肽或蛋白质的其它肽。其它优选的聚阳离子化合物是cathelin或来自cathelin的相关或衍生的物质。例如，小鼠cathelin是具有氨基酸序列NH2-RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGOKIKNFFQKLVPQPE-COOH的肽。相关的或衍生的cathelin物质含有有至少15-20个氨基酸残基的cathelin序列的全部或部分。衍生化可以包括天然氨基酸被不在20个标准氨基酸中的氨基酸替代或修饰。另外，更多的阳离子残基可以引入这样的cathelin分子中。这些cathelin分子优选地与抗原联合。结果这些cathelin分子作为没有更多的佐剂加入的抗原的佐剂惊人地有效。所以这样的cathelin分子用作有或没有更多的免疫激活物质的疫苗制剂的有效佐剂是可能的。
根据本发明使用的另一个优选的聚阳离子物质是含有被3至7个疏水氨基酸的连接子分开的至少2个KLK基团的合成肽(国际专利申请WO 02/32451，此处引入作为参考)。
本发明的药物组合物可进一步包含免疫刺激核酸。免疫刺激核酸是例如含有中性或人工CpG的核酸，源自非脊柱动物或在某些碱基内容含有非甲基化的胞核嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的短寡核苷酸形式(ODN)(例如WO 96/02555中描述的)的核酸的短延伸。或者，基于如例如WO 01/93903中描述的次黄嘌呤核苷和胞啶的核酸或含有脱氧次黄嘌呤核苷和/或脱氧尿苷残基的脱氧核酸(WO 01/93905和PCT/EP 02/05448中描述的，此处引用作为参考)可优选地用作本发明的免疫刺激核酸。优选地，根据本发明也可以使用不同免疫刺激核酸的混合物。
任何上面提到的聚阳离子化合物与如前面提到的任何免疫刺激核酸联合也在本发明之内。优选地，这样的联合是根据WO 01/93905，WO02/32451，WO 01/54720，WO 01/93903，WO 02/13857和PCT/EP02/05448和奥地利专利申请A 1924/2001中描述的那些，此处引用作为参考。
另外或可替代地，这样的疫苗组合物除了根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段和其编码核酸外还可以包含神经活性化合物。优选地，神经活性化合物是如例如WO 01/24822中描述的人生长因子。也优选地，神经活性化合物联合于如前面提到的任何聚阳离子化合物和/或免疫刺激核酸。
在另一方面，本发明涉及药物组合物。例如这样的药物组合物是此处描述的疫苗。药物组合物也是包含任何下面的化合物或其联合的药物组合物根据本发明的核酸分子，根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段，根据本发明的载体，根据本发明的细胞，根据本发明的抗体，根据本发明的功能性核酸和根据本发明的例如抗促成素的结合肽，如此处描述的任何激动剂和拮抗剂。与此有关任何这些化合物可联合于非无菌或无菌载体或与细胞、组织或生物体一起使用的载体而应用，例如适于给予研究对象的药物载体。这样的组合物包含例如介质添加剂或治疗有效量的本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段以及药物可接受载体或赋形剂。这样的载体可以包括但不限于生理盐水、缓冲盐、葡萄糖、水、甘油、乙醇和它们的联合。制剂应当适合给药的模式。
药物组合物可以以任何有效的、方便的方式给予，包括例如通过其它之中局部、口腔、肛门、阴道、静脉内、腹腔内、肌肉内、皮下、鼻内、气管内或皮内途径的给予。
在治疗中或作为预防剂，活性试剂可以作为例如无菌水性分散物优选等渗的可注射组合物给予个体。
或者组合物可制成适于局部应用的例如软膏、乳膏、洗液、眼药膏、滴眼液、滴耳液、漱口水、浸透敷料和缝线和烟雾剂的形式，并且可以含有合适的传统添加剂，包括例如防腐剂、辅助药物穿透的溶剂以及药膏和乳膏中的软化剂。这样的局部制剂可以含有相容性传统载体，例如乳膏或软膏基质以及洗剂的乙醇或油醇。这样的载体可以构成大从约1％至大约98％的制剂重量；更加通常地它们将构成一共大约80％的制剂重量。
除了上面描述的治疗外，本发明的组合物一般可用作伤口治疗剂以阻止细菌粘附到受伤组织中暴露的基质蛋白质以及为了牙科治疗的预防用途用作抗生物预防的代替或与抗生物预防结合。
疫苗组合物很方便地是可注射的形式。可采用传统佐剂以增强免疫反应。疫苗接种合适的单位剂量是0.05-5μg抗原/每公斤体重，优选地给予这样的剂量1-3次，间歇1-3周。
在所示剂量范围，本发明的化合物应当没有观察到妨碍它们给予合适的个体副毒性作用。
进一步的实施方案中，本发明涉及诊断的和药物的包装和试剂盒，包含一个或多个充填了一个或多个本发明前面提到的成分的容器。成分能以有用的量、剂量、制剂或联合存在。与这样的容器有关的是管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通知，反映了人类给予的产品的制造、使用或销售的机构的批准。
与本发明相关，如此处公开的例如药物组合物或疫苗的用途相关的任何疾病尤其是肠球菌更加优选地类肠球菌相连或相联的疾病或疾病状态。与此相关，要注意粪肠球菌包含了包括此处公开的那些的一些菌株。与根据本发明要预防和/或治疗的细菌感染相关的、造成的或相联的疾病在人类包括，除了其它的，细菌性咽炎、猩红热、脓包性皮炎、风湿热、坏死性筋膜炎和脓毒症。
仍然进一步的实施方案中，本发明涉及使用任何根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段的筛选方法。这样的筛选方法对本领域的技术人员是已知的，能设计所述方法以筛选激动剂或拮抗剂。优选地筛选了在本情况下抑制或阻止根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段与相互作用伴侣结合的拮抗剂。这样的相互作用伴侣可以是天然发生的相互作用伴侣或非天然发生的相互作用伴侣。
本发明也提供了筛选化合物的方法以鉴别增强(激动剂)或阻断(拮抗剂)本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段或核酸分子的功能的那些化合物，例如其与结合分子的相互作用。筛选的方法可以包括高通量。
例如，为了筛选激动剂或拮抗剂，可以从表达结合于本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段的分子的细胞分别制备根据本发明的核酸分子的相互作用伴侣和核酸，可以是合成反应混合物、细胞腔室，例如膜、细胞被膜或细胞壁或者任何的它们的制备物。制备物在有或无可以是激动剂或拮抗剂的候选分子的存在下与标记的超免疫血清反应性抗原及其片段一起孵育。候选分子与结合分子结合的能力反映在标记配体结合的降低。无偿结合，即不引起超免疫血清反应性抗原及其片段功能性作用的分子最可能是好的拮抗剂。很好结合的并引起与超免疫血清反应性抗原及其片段相同的或密切相关的功能性作用的分子是好的激动剂。
可以例如通过在候选分子与细胞或合适的细胞制备物相互作用后测定报告系统的活性，以及与本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段或引发与超免疫血清反应性抗原及其片段相同作用的分子的作用比较测量可能的激动剂和拮抗剂的功能性作用。在这点上有用的报告系统包括但不限于比色标记底物转化为产物，对超免疫血清反应性抗原及其片段的功能性活性的改变有响应的报告基因，以及本领域已知的结合试验。
拮抗剂试验的另一个实例是竞争试验，在竞争抑制试验合适的条件下联合本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段和有膜结合的结合分子、重组结合分子、天然底物或配体、底物或配体模仿物的可能的拮抗剂。能例如用放射活性或比色化合物标记超免疫血清反应性抗原及其片段，如此能精确地测定结合于结合分子或转化为产物的超免疫血清反应性抗原及其片段以评价可能的拮抗剂的有效性。
可能的拮抗剂包括结合于本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段并因而抑制或取消其活性的的小有机分子、肽、多肽和抗体。可能的拮抗剂也可以是小有机分子、肽、多肽，例如结合于结合分子上相同位点但不引起本发明超免疫血清反应性抗原及其片段的功能活性的密切相关的蛋白质或抗体。
可能的拮抗剂包括小分子，它结合于并占据了超免疫血清反应性抗原及其片段的结合位点，由此阻止与细胞结合分子的结合，使得正常的生物活性被阻止。小分子的实例包括但不限于小有机分子、肽或肽样分子。
其它可能的拮抗剂包括反义分子(对于这些分子的描述，见{Okano，H.等人，1991}；寡核苷酸作为基因表达的反义抑制剂；CRCPress，Boca Ration，FL(1988))。
优选的可能的拮抗剂包括本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段的衍生物。
如此处使用的根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段的活性是其结合于任何其相互作用伴侣的能力或结合于其或任何相互作用伴侣这样的能力的程度。
在特定的方面，本发明提供了本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段、核酸分子或的抑制剂干扰病原体和负责感染后遗症的哺乳动物宿主之间最初的物理相互作用的用途。尤其是可以在如下方面使用本发明的分子i)阻止粪肠球菌粘附于植入装置上的哺乳动物细胞外基质蛋白质或伤口的细胞外基质蛋白质；ii)阻断蛋白质介导的哺乳动物细胞侵入，通过例如引发哺乳动物酪氨酸激酶的磷酸化(Rosenshine，I.等人，1992)，iii)阻断哺乳动物细胞外基质蛋白质与介导组织损伤的细菌蛋白质之间的细菌性粘附；iv)阻断除了装置的植入或其它手术技术以外例如通过抑制营养的获得启动的感染中致病的正常进程。
此处提供的每个DNA编码序列可以用于抗菌化合物的发现和开发。编码蛋白质在表达时能用作抗菌药筛选的靶点。另外，编码编码的蛋白质氨基酸区域或Shine-Delgarno或各自mRNA的其它翻译促进序列的DNA序列能用于构建反义序列以控制目的编码序列的表达。
可以采用拮抗剂和激动剂以例如抑制源自肠球菌尤其是粪肠球菌感染的疾病，例如脓毒症。
在仍然另一方面，本发明涉及亲和装置，这样的亲和装置包含至少一种支持材料和附着于支持材料的任何根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段。由于根据本发明的超免疫血清反应性抗原及其片段对它们的靶细胞或靶分子或它们的相互作用伴侣的特异性，只要满足结合的条件，超免疫血清反应性抗原及其片段允许它们的相互作用伴侣从应用于支持材料的任何种类的样品中选择性去除。样品可以是生物或医学样品，包括但不限于发酵肉汤、细胞碎片、细胞制备物、组织制备物、器官制备物、血液、尿液、淋巴液、液体等等。
超免疫血清反应性抗原及其片段可以以共价或非共价方式附着于基质。合适的支持材料对于本领域技术人员是已知的，并选自纤维素、氧化硅、玻璃、铝、顺磁珠、淀粉和右旋糖苷。
本发明进一步通过下面的图示、实例和序列列表举例说明，从中可以取得进一步的特性、实施方案和优点。要理解只经由例证不经由公开的限制给予本实例。
与本发明相关

图1显示了粪肠球菌特异性人血清的特征。
图2显示了来自粪肠球菌V583的小片段基因组文库LEF-70的特征。
图3显示了使用生物素化人IgG通过MACS对细菌细胞的挑选。
表1显示了用粪肠球菌基因组文库和人血清进行的所有筛选的概述，以及通过同源性检索鉴别的粪肠球菌蛋白质。
表2显示了人血清的表位血清学。
在详述中提到的图示在下面有更详细地描述。
图1显示了如免疫试验测量的抗粪肠球菌抗体的人血清的特征分析。使用从粪肠球菌菌株V583制备的总细菌裂解物或培养上清组分，通过标准ELISA测量总抗粪肠球菌IgG抗体水平。(A)显示了健康成人血清的代表性实验结果。数据表示为线性检测范围内的血清稀释度(2.000X和10,000X)在405nm处的吸光度计算来的ELISA单位。(B)为了确保对蛋白质抗原的多重免疫反应性，对通过ELISA挑选的高滴度血清进行免疫斑点分析。显示了使用总细菌裂解物和在5.000X稀释度的挑选的人血清的代表性实验结果。用抗人IgG次级抗体试剂显色斑点。泳道1-4包括在筛选库中的个体高滴度血清(N1-4)，泳道5低滴度血清(N5)，泳道6阴性对照，(无血清，仅有次级抗体)。MW分子量标记。(C)显示了来自健康成人(N，编号与B相同)与肠球菌感染(如创伤感染，菌血症，感染的导管)急性期患者(P)的血清中获得的IgG滴度的比较。数据表示为ELISA单位，如对(A)所述计算。(D)显示来自心内膜炎患者的恢复期血清的实验结果。数据表示为线性检测范围内的血清稀释度(2.000X)在405nm处的吸光度计算来的ELISA单位。(E)为了用蛋白质抗原确定多种免疫反应性，用来自心内膜炎的患者之高滴度血清进行免疫斑点分析。显示了在5.000X稀释度使用总细菌裂解物和所选人血清的代表性结果。用抗人IgA次级抗体试剂显示斑点。泳道1-6来自心内膜炎患者的个体血清。Mw分子量标记。
图2(A)显示了粪肠球菌V583小片段基因文库LEF-70的片段大小的分布。在测序576个随机挑选的克隆后，修齐序列以消除载体残基，对有各种基因组片段大小的克隆数量作图。(B)显示了粪肠球菌V583染色体之上LEF-70的483个随机测序的克隆分布图。长方形指出了与有注解的ORF配对的序列，菱形代表了与+/+或+/-方向的非编码染色体序列完全匹配的克隆。环形决定了有嵌合序列的所有克隆的位置。碱基对中的数字距离指出了环形基因组上的方向。图底下的数字和百分比给出了文库内各种克隆集合的划分。
图3(A)显示了用生物素化的人IgG的MACS挑选。用20μg生物素化的人血清(IC10-IgG)在第一和第二轮中筛选了pMAL9.1中的LEF-70文库。作为阴性对照，没有血清加入到筛选的文库细胞。显示了对于第一轮的第一次和第二次洗脱之后挑选的细胞数以及第二轮的第一到第4次洗脱后挑选的细胞数，带有或不带有添加的IgG。图3B显示了如用人血清(IC10-IgG，约4μg/μl)的Western印迹分析的2轮细菌表面展示后分离的特异性克隆(1-26个)的反应性，用于通过MACS的挑选在1∶3,000稀释度使用。作为负载对照，相同的斑点用针对平台蛋白质LamB的抗体在高免疫兔血清1∶5,000稀释度也进行分析。LB，来自表达LamB而没有外源肽插入的克隆的提取物。
表1细菌表面展示鉴别的免疫原性蛋白质。
(A)用高抗肠球菌滴度的来自健康成人的血清鉴别的抗原。A，用IC10-IgG在fhuA中来自粪肠球菌V583的LEF300文库(723)，B，在fhuA中的LEF300文库(389)，C，在fhuA中的带有IC10-IgG的LEF300文库(1096)，D，在fhuA中的带有IC9-IgG的LEF300文库(1065)。表1b显示通过与表1a中所列出的粪肠球菌抗原至少70％同一性的同源性检索鉴别的粪肠球菌蛋白质。用计算机程序TBLASTN鉴别粪肠球菌与屎肠球菌序列之间的同一性(http//www.hgsc.bcm.tmc.edu/microbial/microbialblast.cgi？organism＝Efaecium)。基于相应的粪肠球菌抗原的完整ORF序列计算氨基酸序列的同一性。表1c显示了利用带有高抗肠球菌滴度血清的恢复的心内膜炎患者血清所鉴别的抗原。E，用P25-IgG在fhuA中来自粪肠球菌V583的LEF70文库(843)；F，用P26-IgG在fhuA中来自粪肠球菌V583的LEF70文库(845)；G，用P25-IgG在fhuA中的LEF300文库(691)；H，用P26-IgG在fhuA中的LEF300文库(770)；*，程序ANTIGENIC(Kolasker，A，等人，1990)进行长于5个氨基酸的抗原性序列的预测。
表2用人血清的表位血清学。
显示了代表所选表位的个体合成肽与人血清的免疫反应性。反应性的程度用代码的颜色显示，白色-(＜100U)，浅灰+(100-249U)，深灰++(250-349U)，黑+++(＞350U)。ELISADANW(U)从OD405nm读数以及血清稀释度计算。以所有反应性的加和计算得分(-＝0；+＝1；++＝2；+++＝3)。N1-N10血清为来自健康成人的高滴度血清，用于IC9-和IC10-IgG库的筛选。P1-P11为来自患有粪肠球菌感染的患者的血清。给出了根据V583菌株的基因组标注的抗原性ORF中合成肽的位置，显示第一个和最后一个氨基酸残基。肽名称EF0020.1，存在于染色体上注释的ORF EF0020；ARF0679.1，在替代的开放读框EF0679中的可能的新ORF，EFC0034.1，存在于质粒上的注释的ORF；ARFC0021.1，存在于来自质粒C的替代的开放读框ARFC0021中的可能的新ORF。
实施例实施例1基于抗粪肠球菌抗体的人血清来源的表征和挑选、抗体筛选试剂的制备试验过程酶联免疫试验(ELISA)。
用包被缓冲液(0.1M碳酸钠pH 9.2)稀释的5-10μg/ml总蛋白质包被ELISA平板(Maxisorb，Millipore)。PBS-BSA中制成三个稀释度的血清。根据生产厂商的推荐(稀释度1,000x)使用高特异性辣根过氧化物酶(HRP)-连接的抗人IgG或抗人IgA二抗(SouthernBiotech)。通过基于自动ELISA阅读仪(TECAN SUNRISE)OD405nm的读数测量底物转化为颜色产物，定量抗原抗体复合物。
细菌抗原提取物的制备总细菌裂解物细菌在BHI(脑-心浸出液)中生长过夜，重复冷冻-解冻循环裂解细菌在干冰/乙醇混合物上孵育直到冻结(1分钟)，然后在37℃解冻(5分钟)重复3次。这之后是超声和离心收集上清(3,500rpm，15分钟，4℃)。
培养上清液离心去除细菌后，通过混合1份上清和3份无水乙醇，用冰冷的乙醇沉淀过夜生长的细菌培养物的上清，在-20℃孵育过夜。离心收集沉淀物(2,600g，15分钟)。干燥的粒状沉淀物为了ELISA溶于PBS，或为了SDS-PAGE和免疫斑点溶于尿素和SDS样品缓冲液。Bradford试验测定样品的蛋白质浓度。
免疫斑点从体外生长的粪肠球菌V583株制备总细菌裂解物和培养上清样品。使用BioRad Mini-Protean细胞电泳系统通过SDS-PAGE分离10至25μg总蛋白质/泳道，蛋白质转移到硝酸纤维素膜(ECL，AmershamPharmacia)。在5％的奶中封闭过夜后，加入2,000x稀释的人血清，HRPO标记的抗人IgG用于检测。
用于基因组筛选的抗体的纯化基于筛选程序中使用的血清合并物的总抗肠球菌滴度挑选来自患者和健康组的五份血清。通过将热灭活血清与全细胞大肠杆菌细胞(DH5α，用pHIE11转化，在与细菌表面展示使用的相同的条件下生长)孵育去除抗大肠杆菌蛋白质的抗体。根据厂商说明书(超连接固定蛋白质G，Pierce)用蛋白质G亲和色谱从合并的耗贫(depleted)血清生产IgG高度富集的制备物。用SDS-PAGE、Western斑点、ELISA和蛋白质浓度测量检查耗贫(depletion)和纯化的效率。
结果人免疫系统产生的并存在于人血清的抗粪肠球菌抗体是抗原蛋白质的体内表达和它们的免疫原性的指征。这些分子对于如本发明描述的方法中各体抗原的鉴别是必须的，所述方法基于特异性抗肠球菌抗体和相应的肠球菌肽或蛋白质的相互作用。为了获得相关抗体所有组分(repertoires)，从健康成人、以及带有肠球菌感染的患者和幼稚个体(5-10月龄的年幼儿童，在其已经丧失母体抗体后)收集人血清。
暴露于病原体的个体中诱导的血清和例如粘膜分泌物的其它体液中的抗体对于抗原鉴别是至关紧要的。暴露于肠球菌导致了无症状的群集、当前或过去的急性或慢性感染。粪肠球菌的群集和感染是普遍的，作为来自以前的遭遇的天然免疫的后果抗体是存在的。由于肠球菌是机会(不是强制性的)致病菌，很可能来自健康个体的血清也含有相关抗体。
通过一系列免疫试验对来自健康成人的70个血清和来自由粪肠球菌引起的心内膜炎的恢复的患者的16份和来自急性感染(主要为创伤和菌血症)的8份患者血清进行抗粪肠球菌抗体的特征分析。使用例如总细菌提取物和从粪肠球菌V583株制备的培养上清蛋白质的两个不同的抗原制备物通过ELISA完成初步特征分析。图1中显示了使用来自健康成人群(图1A)和来自心内膜炎患者(图1D)的血清的典型实验。在反应是线性的给定的稀释度比较抗体滴度。基于IgG的针对两个复合抗原混合物的反应性对血清进行分级，挑选最高的血清进行进一步的免疫斑点测试。这个分析证实预先挑选的血清抗多重肠球菌蛋白质的高抗体反应性(图1B&E)，尤其与未挑选的低滴度血清比较时。然而，血清的ELISA分级不总是与免疫斑点信号相关，提示抗非蛋白质组分(例如脂磷壁质，肽聚糖等)抗体也对针对总细菌提取物的ELISA反应性有贡献。因而，包括在抗体合并物中的血清的最终挑选主要基于免疫斑点试验中的多个免疫原性条带。这个广泛的抗体特征分析方法导致了抗肠球菌超免疫血清的明确的鉴别。这些选自健康成人的血清与来自具有多种急性肠球菌感染(例如，创伤感染、菌血症和导管相关的感染)的患者的血清相比较。显然，抗粪肠球菌抗体滴度在急性患者组较低，提示疾病可在低滴度个体中发生(图1C)。这些患者血清然后主要用于有效性目的，即测量针对所鉴别的表位的抗体水平。但是，患有由粪肠球菌引起的心内膜炎的患者(通过常规微生物诊断证实)在恢复期出现高水平的抗体，如在此处分析的16个样品中所证实的高滴度血清百分比(图1E&D)。
从健康成人中选择10份血清，从患有心内膜炎的恢复患者的供体组选择10份血清。合并血清(每组5份样品)，经纯化用于通过细菌表面展示IgG抗体鉴别抗原的IgG从合并的血清中纯化，方法是通过亲和色谱，并耗尽大肠杆菌反应性抗体以避免细菌表面展示筛选中的背景。
实施例2粪肠球菌的高度随机的、挑选框架的、小片段的基因组DNA文库的产生实验过程肠球菌基因组DNA的制备。来自冷冻穿刺培养物的粪肠球菌V583细菌接种于50ml脑心浸出液(BHI)并且在通风和37℃摇晃18h而生长。然后收集培养物，1,600xg离心15分钟，去除上清。用PBS清洗细菌小球3次，小心悬浮于0.5ml的溶菌酶溶液(100mg/ml)。加入0.1ml的10mg/ml热处理的RNase A和20U的RNase T1，小心混合，溶液在37℃孵育1h。0.2ml的20％SDS溶液和0.1ml蛋白酶K(10mg/ml)的加入之后，试管在55℃孵育过夜。然后加入1/3体积的饱和NaCl，溶液在4℃孵育20分钟。微离心机中沉淀提取物(13,000rpm)，上清转入新的试管。用PhOH/CHCl3/IAA(25∶24∶1)和用CHCl3/IAA(24∶1)萃取溶液。加入0.6x体积的异丙醇在室温下沉淀DNA，用无菌Pasteur移液管从溶液缠绕DNA并转入含有80％冰冷乙醇的试管中。10-12,000xg离心沉淀物重新获得DNA，然后空气中干燥并溶于ddH2O中。
小基因组DNA片段的制备。使用杯状管(cup-horn)超声仪(Bandelin Sonoplus UV 2200超声仪，装有BB5杯状管，在100％动力输出10秒脉冲)将基因组DNA片段机械剪切成大小范围150和300bp之间的片段或通过温和的DNase I处理(Novagen)剪切成大小50至70bp之间的片段。观察到当将DNA打碎成150-300bp大小范围的片段时，超声得到了紧凑很多的片段大小分布。然而，虽然DNA大量暴露于超声波诱导的流体力学剪切力，还是不能有效率并可重复的获得随后片段大小的降低。所以，使用Novagen的鸟枪(shotgun)剪切试剂盒通过温和的DNase I处理获得大小50至70bp的片段。制备试剂盒提供的1∶20稀释度的DNase I，在MnCl2存在下在60μl体积中在20℃进行消化5分钟以确保酶的双链剪切。用2μl 0.5M EDTA中止反应，在2％TAE-琼脂糖凝胶上评价片段化的效率。这个处理导致了基因组DNA片段化为近50-70bp片段。然后使用T4DNA聚合酶在100μM每个dNTP的存在下平端处理(blunt-ended)片段两次以确保末端的有效净化(flushing)。片段在连接反应中立即使用或为了随后的使用冷冻于-20℃。
载体的描述。在有与卡那霉素抗性基因交换的β-内酰胺酶(bla)基因的pASK-IBA骨架上{Skerra，A.，1994}构建载体pMAL4.31。另外，将bla基因克隆进多个克隆位点。编码成熟的β-内酰胺酶的序列先于ompA的先导肽序列以允许有效的跨细胞质膜的分泌。此外，编码成熟的β-内酰胺酶最初12个氨基酸(间隔子序列)的序列跟在ompA先导肽序列后面以避免紧接在先导肽酶切割位点之后的序列的融合，因为例如这个区域的正性电荷氨基酸群将降低或取消跨细胞质膜的转位{Kaiava，A.等人，2000}。SmaI限制性位点供给文库的插入。用于挑选片段的重新获得的上游FseI位点和下游NotI位点在SmaI位点的两侧。以bla基因转录在-1阅读框在NotI位点后得到一个终止密码子15bp的方式在编码12个氨基酸间隔子序列的序列之后插入三个限制性位点。+1bp插入重建了bla ORF以至于得到β-内酰胺酶伴随着氨苄青霉素抗性的获得。
通过将lamB基因克隆进pEH1的多个克隆位点构建载体pMAL9.1{Hashemzadeh-Bonehi，L.等人，1998}。随后，序列在氨基酸154后插入lamB，含有限制性位点FseI、SmaI和NotI。以挑选了框架的DNA片段的转移得到fhuA的连续阅读框和各自插入的这个方式构建这个插入的阅读框，所述DNA片段通过用来自质粒pMAL4.31的FseI和NotI的消化进行剪切。
通过将fhuA基因克隆进pEH1的多克隆位点构建了载体pHIE11。之后，序列在氨基酸405后插入fhuA，含有限制性位点FseI、XbaI和NotI。以挑选了框架的DNA片段的转移得到lamB的连续阅读框和各自插入的这个方式选择这个插入的阅读框，所述DNA片段通过用来自质粒pMAL4.31的FseI和NotI的消化进行剪切。
用于框架挑选的文库的克隆和评价。基因组粪肠球菌DNA片段连接到载体pMAL4.31的SmaI位点。将重组DNA电穿孔进DH10B电穿孔胜任的大肠杆菌细胞(GIBCO BRL)，转化株接种于补充了卡那霉素(50μg/ml)和氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂平板上。平板在37℃孵育过夜，为了大规模的DNA提取收集克隆。储存和保留代表性的平板以收集克隆用于菌落的PCR分析和大规模的测序。简单的菌落PCR试验用于最初测定大致的片段大小分布以及插入效率。从测序的数据评价精确的片段大小、在插入位点的接合的完整性以及框架选择的精确性(3n+1规则)。
用于细菌表面展示的文库的克隆和评价。从pMAL4.31载体切割基因组DNA片段，含有有限制性酶FseI和NotI的粪肠球菌文库。然后完整的片段群转移到质粒pMAL9.1(LamB)或pHIE11(FhuA)中，所述质粒已经用FseI和NotI消化。使用识别8bp富含GC序列的这两个限制性酶，在每个平台载体中维持pMAL4.31载体中挑选的阅读框。然后通过电穿孔将质粒文库转化进大肠杆菌DH5α细胞。细胞接种于补充了50μg/ml卡那霉素的大的LB琼脂平板上，在可以得到清晰可见的单个菌落的密度在37℃生长过夜。然后从这些平板的表面刮下细胞，用新鲜LB培养基清洗，分装在-80℃储存用于文库筛选。
结果用于框架挑选的文库。在pMAL4.31载体中产生分别有大约70和300bp大小的三个文库(LEF-70和LEF-300)。对于各个文库，大约1μg的pMAL4.31质粒DNA和50ng的片段化的基因组粪肠球菌DNA的连接和其后的转化在框架挑选后得到了1.5×105至1×106个克隆。为了评价文库的随机性，测序了大约576个LEF-70的随机选择的克隆。其中有483个被成功的修齐并用于随后的生物信息分析。生物信息分析显示这些克隆中只有很少的克隆多于一次存在。此外，显示大约73％的克隆的大小在范围25和100bp之间，有平均大小大约82bp(图2)。几乎所有序列遵循3n+1规则，显示了所有克隆恰当地选择框架。
细菌表面展示文库。大肠杆菌表面上肽的展示要求来自LSPy文库的插入体从框架挑选载体pMAL4.31转移到展示质粒pMAL9.1(LamB)或pHIE11(FhuA)。FseI和NotI限制性剪切基因组DNA片段，5ng插入体与0.1μg质粒DNA连接，其后转化进DH5α细胞得到了7.5×105-2×106个克隆。从LB平板刮下克隆并冷冻而没有进一步的扩增。所述细胞用做随后筛选步骤中的文库。
实施例3使用细菌表面展示的基因组文库和人血清鉴别来自粪肠球菌的高度免疫原性肽序列试验过程MACS筛选。来自给定文库的大约2.5×108个细胞在37℃在5ml补充了50μg/ml卡那霉素的LB培养基中生长2小时。1mM IPTG加入30分钟诱导表达。用新鲜LB培养基清洗细胞两次，大约2×107个细胞重新悬浮在100μl LB培养基中并转移到Eppendorf管中。
20μg生物素化的从血清纯化的人IgG加入到细胞，悬浮液在4℃轻微震摇孵育过夜。加入900μl LB培养基，混合悬浮液，随后在6,000rpm4℃离心10分钟(对于IgA筛选，使用10μg纯化的IgA，这些用生物素化的抗人IgG二抗捕获)。用1ml LB清洗细胞一次，然后重新悬浮于100μl LB培养基。加入10μl偶联于链亲和素的MACS微珠(MiltenyiBiotech，德国)，继续在4℃孵育20分钟。之后加入900μl LB培养基，将MACS微珠细胞悬浮液上样到已经平衡的固定于磁铁的MS柱(Miltenyi Biotech，德国)。(MS柱通过用1ml 70％EtOH清洗一次并用2ml LB培养基清洗两次平衡)。
然后用3ml LB培养基清洗柱三次。磁铁去除之后，通过用2ml LB培养基清洗洗脱细胞。用3ml LB培养基清洗柱后，2ml洗脱物第二次上样到相同的柱上，重复清洗和洗脱步骤。进行第三次上样、清洗和洗脱步骤，得到2ml的终洗脱物。
第二轮筛选进行如下。离心收集终洗脱物的细胞，重新悬浮在1ml补充了50μg/ml卡那霉素的LB培养基。培养物在37℃孵育90分钟，然后在1mM IPTG诱导30分钟。随后收集细胞，用1ml LB培养基清洗一次，悬浮于10μl LB培养基。对于第二轮筛选，加入相同量(20μg)的人生物素化的IgG，悬浮液在4℃轻微震摇孵育过夜。所有进一步的步骤与第一轮挑选完全一样，除了洗涤、上样和洗脱循环的数量依照每次筛选加以调整。两轮挑选之后挑选的细胞接种于补充了50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃孵育过夜。
通过测序和Western斑点分析对挑选克隆的评价。挑选的克隆在补充了50μg/ml卡那霉素的3ml LB培养基中37℃生长过夜以使用标准程序制备质粒DNA。在MWG(德国)或与TIGR(美国)合作进行测序。
对于Western斑点分析，用10％SDS-PAGE分离大约10至20μg总细胞蛋白质，转印到HybondC膜(Amersham Pharmacia Biotech，英格兰)上。使用人血清作为第一抗体在大约1∶3,000至1∶5,000的稀释度以及偶联于HRP抗人IgG或IgA抗体作为第二抗体在1∶5,000的稀释度检测LamB或FhuA融合蛋白质。使用ECL检测试剂盒(AmershamPharmacia Biotech，英国)进行检测。或者，兔抗FhuA或兔抗LamB多克隆免疫血清用作第一抗体，联合各自的偶联于HRP的第二抗体以检测融合蛋白质。
结果使用生物素化Ig通过磁铁激活的细胞分拣(MACS)对细菌表面展示文库的筛选。
来自健康个体(表1a)或从恢复期心内膜炎患者(表1c)的血清的生物素化的人IgG合并物筛选pMAL9.1中的LEF-70和pHIE11中的LEF-300文库(参见，实施例1从人血清制备抗体)。如实验过程下描述地进行挑选过程。图3A显示了用LEF-70文库和IC10-IgG的筛选的代表性实例。如从菌落计数可以看到地，在从MACS筛选的第一挑选循环之后，最后重新获得的细胞总数戏剧性地从1×107个细胞降到大约5×104个细胞，但是没有抗体加入的挑选显示了相似的细胞数的降低(图3A)。对于第二轮，2×105个细胞上样于柱，在4个循环的上样、洗涤和洗脱后，几乎所有(1×105)的用IC10-IgG回收，而当不加入人血清的IgG时，仅有低于100个细胞被回收。结果清楚地显示了挑选依赖于粪肠球菌特异性抗体。通常，挑选导致约30％-70％克隆被用所加的血清IgG特异性的挑选。对于每次筛选，将400-1200个克隆进行DNA测序，所得序列与粪肠球菌V583的基因组相比对(blast)。生物信息分析允许基于通过加入人IgG所选的各个克隆的频率评价每次筛选。为证实筛选的良好实施，选择所有多于一次被挑选的克隆，用相同的合并的血清IgG进行Western印迹分析(图3B)。对更为频繁选择的克隆(＞5X)的分析揭示了多于90％的所挑克隆显示了与相关血清中存在的抗体的反应性，而表达没有粪肠球菌特异性插入物的LamB的对照株与相同的血清IgG不反应。一般，以较低频率(＜5x)挑选的克隆显示与所施加的血清IgG的低反应性百分比。菌落PCR分析显示了所有挑选并测试的克隆含有期待大小范围的插入物。
随后大量随机选择的克隆(每轮筛选400至1200个)的测序导致了基因和被用于筛选的人血清抗体特异性识别的相应的肽或蛋白质序列的鉴别。挑选特异性克隆的频率至少部分反映了在用于挑选的血清中并且识别这个克隆呈现的表位的特异性抗体的丰度和/或亲和力。在这点，很惊人地源自一些ORF的克隆(例如，EF3060，EFA0042)被选择了多次，且在多于一次的筛选中被选择，显示它们高度免疫原的特性。表1a总结了用来自健康成人的血清实施的四次筛选所获得的数据，表1c是用恢复期心内膜炎患者血清的四次筛选。后一表中仅含有相对于表1a所列出的而言为新的抗原。通过两类血清鉴别了26个抗原，分别从健康成人和患者的血清中挑选了71和42个独特型抗原ORF。
所有表1中显示的克隆已经通过Western印迹验证，方法是利用来自单一克隆的完整细胞提取物以显示与在各个筛选中所用人血清合并物的所示反应性。如表1所示，所鉴别的ORF的独特区被鉴别为免疫原性的，因为不同大小的蛋白质片段被在平台蛋白质的表面上展示。
更加值得注意多数细菌表面展示筛选鉴别的基因编码附着于粪肠球菌的表面的和/或是分泌的。这个与表面附着的或分泌的蛋白质在粪肠球菌毒力中期望的作用是一致的。
表1b显示通过与表1a中所列出的粪肠球菌抗原至少70％同一性的同源性检索鉴别的屎肠球菌蛋白质。用计算机程序TBLASTN鉴别粪肠球菌与屎肠球菌序列之间的同一性(http//www.hgsc.bcm.tmc.edu/microbial/microbialblast.cgi？organism＝Efaecium)。基于相应的粪肠球菌抗原的完整ORF序列计算氨基酸序列的同一性。所得结果显示屎肠球菌含有与临床密切相关的粪肠球菌在结构上相关的蛋白质。由于粪肠球菌的同源性蛋白业已在本发明中提供为超免疫血清反应性抗原，表1b中给出的屎肠球菌蛋白质提供了相同的用途，特别是用作包含在药物组合物，例如针对肠球菌感染的疫苗，中的抗原。
实施例4高度免疫原性肽序列与个体人血清反应性的评价实验过程肽合成使用Syroll合成器(Multisyntech，Witten，德国)在Rink酰胺树脂上(PepChem，Tübingen，德国)使用标准F-moc化学小规模(4mg树脂；平行最多288个)合成肽。序列组合后，用Fmoc-ε-氨基己酸(作为连接剂)和生物素(Sigma，St.Louis，MO；象正常的氨基酸被激活的)延长肽。用93％TFA、5％三乙基硅烷和2％水1小时将肽从树脂上切下来。真空下干燥肽，从乙腈/水(1∶1)冷冻干燥3次。正确质量的存在通过质谱在Reflex
酶联免疫实验(ELISA)根据生产厂商的说明书在链亲和素ELISA平板(EXICON)上在10μg/ml浓度包被生物素标记的肽(在N-末端)。根据生产厂商的推荐使用高度特异性辣根过氧化物酶(HRP)连接的抗人IgG二抗(Southern Biotech)(稀释度1,000x)。在200X和1,000X两个血清稀释度测试血清。手工包被之后，通过有内置ELISA阅读仪(GENIOS，TECAN)的Gemini 160 ELISA机器人(TECAN)处理和分析肽平板。
结果对挑选克隆的生物信息分析之后，设计并合成相应的肽。在有多于26个氨基酸残基的表位的情况下，制造重叠肽。所有的肽用N-末端生物素标记进行合成并用作链亲和素包被的ELISA平板上的包被试剂。
为了证实所选表位的免疫原性，通过利用个体人血清(其包括在用于细菌表面展示筛选的所述表位检定中的IC9-和IC10 IgG合并物中)的肽ELISA测量特异性抗体水平。显示了存在于61个粪肠球菌抗原中的104个肽与10个健康成人筛选血清(N1-N10)的血清反应性和与来自不同粪肠球菌感染的11个血清(P1-P11)的血清反应性的总结。通过基于阳性血清数和反应的程度计算的每个肽的分数对肽进行比较。肽在对弱阳性血清有很高的反应性到有广泛的反应性的范围内。在最高得分的肽表位(来自表面蛋白质)中，可见如LPXTG细胞壁蛋白质(EF0490.3和EFA0042.1-2)，分泌的蛋白质(EF0360.1和EF0792.1)以及假设蛋白质(EF0428.1-2，EF3207.2和EFC0034.1-2)。有趣的是，两个主要表位属于替代阅读框ARF0679(44个氨基酸长)和ARF2052(54个氨基酸长)，提示这些蛋白质确实存在，且在体内聚集和/或感染过程中表达。如相对于高滴度健康血清的患者血清之低总粪肠球菌抗体水平所示(图1C)，与患者血清的肽反应性也较低。
表1A细菌表面展示鉴别的免疫原性蛋白质。
表1B通过与鉴别的粪肠球菌抗原的同源性检索鉴别的屎肠球菌抗原
表1c通过细菌表面展示用心内膜炎患者血清鉴别的免疫原性蛋白质
表2人血清的表位血清学

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序列表Seq ID 1atggtaggaa ttatcctagc aagtcacggt gaatttgctg aagggatctt gcaatctggt60gcaatgatct ttggcgaaca agaaaatgta aaagcagtta cgttaatgcc tagcgaaggt 120cccgatgatg taaaagcaaa aatgcaagaa gccattgcat cgtttgacaa tcaagacgaa 180gtactatttt tagttgacct atggggagga acaccattta accaagcgaa ctcattgtta 240gaagatcata aagacaaatg ggcaatcgtt gcaggtatga acttaccaat ggttattgaa 300gcatatgctt ctcgtttctc tatggaatca gcacaagaaa ttgcgacaca cattcttgaa 360acagcaaaag atggtgtcaa agttaaacta gaagagttac aaccagcaga agcaccaaaa 420gctgctgcga cagaagatgc acagccaaaa ggttcgttac caccaggtac agttgttggc 480gatggcaaaa ttaaatttgt gctagcacgt attgattcac gtttattaca tggtcaagta 540gcaacagctt ggacaaaagc aacacaacca aacagaatta ttgttgtttc tgatgccgtt 600gcaaaagatg acttacgtaa gaaattaatc gaacaagcag ctcctccagg agtaaaagcc 660aatgttattc caatcagtga aatgattgaa gtagcgaaag atccacggtt tggcaataca 720aaagcattat tattatttga aaatcctgaa gacgtcttaa aagtggttga aggcggcgta 780gaaatcccag aagtaaacgt tggttcaatg gctcactctg ttggaaaagt cgttgtaagc 840aaagtattat caatgggtca agaagacgtt gatacgtttg atgaattaaa agccaaaggc 900atcaaatttg atgtgcgtaa agtgccaaat gattcaaaag cgaatatgga cgaaattttg 960aaaaaagcaa aaaatgagtt agcaaacgcg990Seq ID 2atgaaaaata aaagtaggca gtttttaaaa aacaactggc cttatatgtt agccagtttc60ttcattccat ttttaattat ggcaattatc tatttgagta ttgggattta tccaggaagt 120agtcgcagtg ttttagccag cgatgccttt tctcaatttt caaattttca cgcaagcttt 180aacaatgttc ttcatggaaa acaaagtctt ttctatacgt ggaatgcttc tttgggacta 240aactacttgt ccttaatttc ctattatctt ggtggcttat ttacgccgct cgtctttttc 300tttaacaatc aaaacatgcc tgatgcgctc tatttcctaa cgttgttgaa aattgggagt 360gctggcttga gtttttggtt cttggcaaaa caaaccttta agattcctaa atggtcccat 420gtgactttaa gtgtgtctta tgcgctaatg tccttcattg tggcccattc agaattaatt 480atgtggctgg atgcctttat ttatctgcca ctcgtaattt taggaattca tcgtttaatg 540gaccaacgaa aaccgacatt attgtttgtc agttatttct tgcttttcat tacaaattat 600tattttggct ttatgattgg gttgttttcc ttcctgtact attttgcacg aacgtttaca 660gactggcaac gatataaatc tcgaatcgtt gcgtatttta ctacttctct tttagctggt 720ggagcatcca tgattatggt cttacctgct gtcttagatt tacgaaccaa tggtgaaact 780ctttctgaaa ttacaacctt taaaacagaa gcgactgcct ttttagatat tattatgaaa 840aatatgattg gcgtttacga tacaaccaaa tatgggtcca ttccttttat ttacattggg 900ttgttgcctt tgattttttg tctcttctat ttcgttacga aagaagttcc attgaaaaac 960aaactacttt ttggcagttt gtttgtccta ttgattgcta gcttttacat cacgccctta 1020aatttattct ggcacggtat gcatgcgccg aacatgtttc ttttccgcta tagtttcctc 1080ttttcattct tagttatttt gcttgcaggt tatggttggg agaaatttga aaaggatgat 1140ctcggtgtct taagcggctt gattttgatt cttttagcaa tttttgctct tgcaatgggc 1200acaaaaggtg ctactagtta tacgtatgtg actttaacct ctttcgtatt aacggcaact 1260tttttactat tatacttttt cgggattgct ttttatcaat tgaaaaaagc gcctatgcaa 1320tacttagtga ttttgttatt gctgctcgtt tctggtgaag caatcattaa cacacgggcg 1380atggtcactg gtattttaga tgattggaac tacgcatcac gcagcttgta ttctgagcct 1440tatcctgact taaaaaatct agtcgatcaa acaaaaaaag aaaatgatac cttttaccgc 1500ttggaaaatt taaatggtgt ttcggccaat gacggcatta actatggcta cagtggcatt 1560agcatgtttt cttccgtacg gaaccgacat tcttcaacat acctaaacgc cttaggtttc 1620cgctcacgag gcacgaattt aaatattcgt taccaaaata ataccttgtt aatggatgct 1680ttgatgggca ttaaatacaa tattgctgaa aacaatccaa tgaaattcgg ctttgagcga 1740caagctgctg ctggtaaata tcagctttat cgtaacgaaa atgctttgcc gttaggattt 1800ttagcagaca aagagattta caatgtccgg caacctctca atgataattt aggtagtcaa 1860acaaatttac taaatgcttt agccaatact aatgaacggt attttacctt ttatcaacca 1920acgatgacgc ttcaaaataa cgtgacaatt acgcaaaata cagcgggcgt aacttttacg 1980gagaaacaac ataacgtagc caaagagatt tcttatacag tcaatgtgcc cgccaatacg 2040caagcttatt tgagtttatt cccaacggat tttgctcaat tggaaagttc cactgcgacg 2100gtcaccgtga acggctcaag tcagcaatca caaattggca ttactggcca atagtataac 2160ttaggttact atcccaaaga tacaaccgtt aacttcaaag taagttttta tggaaccaaa 2220gcagtaagtt ttgttcagcc gcaagtggtt ggcttaaata ccaatgcatt tgaaaaagcc 2280atttccgccg tgcaagaaaa aggcgttgat ttaacaactg gcaaacgctc tgcttcaggt 2340acctttaccg ccgacaaaga tcaagtactc gtcactacaa ttccttatga caaaggttgg 2400cgtgtcaaaa ttgatggcaa aaaagttacc ccaaaagcct ttaaagatgc ctttctaagc 2460gttcctgtca gcgctggaac ccatactatt cagttctctt atttaccaga aggattgatt 2520cctggcatcg tgttattcgt tctatgtact ggtggtttcg ttgcctacgt aaccttgatt 2580cctgctagac gaaaccgtaa aaaagaagac aaa 2613Seq ID 3gtgaaaaagt tgagctttaa aaaagtgaag tggggcatgc attttttaat ggctgttgcg60ttgatagcgc caagtgttac tagtacggca tatgcagtag aaacaacgag tcaacaaagt 120tcagaagcag taacaagtac caccgattca agtagaaaac aagaaccagt cattacacag 180
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权利要求
1.一种编码超免疫血清反应性抗原或其片段的分离的核酸分子，其包含选自如下的核酸序列a)与选自Seq ID No 1-2，4-8，10，12-18，20-23，25-26，29-43，45-62，64-74，76-77，79-83，85-89，91-92，94-114，117-126，128-146，148-170，373，375，379-381，387，392，394，397-399，407-408，410-411和415-424的核酸分子具有至少70％序列相同性的核酸分子，b)互补于a)的核酸分子的核酸分子，c)包含a)或b)的核酸分子至少15个连续碱基的核酸分子，d)在严格杂交条件下退火于a)、b)或c)的核酸分子的核酸分子，e)杂交于a)、b)、c)或d)中定义的核酸分子之核酸分子的简并性序列。
2.根据权利要求1的分离的核酸分子，其中序列相同性是至少80％，优选地至少95％，尤其是100％。
3.一种编码超免疫血清反应性抗原或其片段的分离的核酸分子，包含选自如下的核酸序列a)与选自Seq ID No 3，9，11，24，27，44，63，75，84，115-116，127，374，376-378，382-386，388-391，393，395-396，400-406，409和412-414的核酸分子具有至少96％，优选地至少98％，尤其是100％序列相同性的核酸分子，b)互补于a)的核酸分子的核酸分子，c)包含a)或b)的核酸分子至少15个连续碱基的核酸分子，d)在严格杂交条件下退火于a)、b)或c)的核酸分子的核酸分子，e)杂交于a)、b)、c)或d)中定义的核酸分子之核酸分子的简并性序列。
4.一种分离的核酸分子，包含选自如下的核酸序列a)选自Seq ID No 90，147的核酸分子，b)互补于a)的核酸的核酸分子，c)杂交于a)、b)、c)或d)中定义的核酸分子之核酸分子的简并性序列。
5.根据权利要求1、2、3或4中任何一个的核酸分子，其中所述核酸是DNA。
6.根据权利要求1、2、3、4或5中任何一个的核酸分子，其中所述核酸是RNA。
7.根据权利要求1至5中任何一个的分离的核酸分子，其中从基因组DNA，尤其是粪肠球菌基因组DNA分离所述核酸分子。
8.一种包含根据权利要求1至7中任何一个的核酸分子的载体。
9.根据权利要求8的载体，其中所述载体经改造适于根据权利要求1至7中任何一个的核酸分子编码的超免疫血清反应性抗原或其片段的重组表达。
10.一种包含根据权利要求8或9的载体的宿主细胞。
11.包含根据权利要求1、2、5、6或7中任何一个的核酸分子编码的氨基酸序列的超免疫血清反应性抗原及其片段，其中所述氨基酸序列选自Seq ID No 171-172，174-178，180，182-188，190-193，195-196，199-213，215-232，234-244，246-247，249-253，255-259，261-262，264-284，287-296，298-316，318-340，425，427，431-433，439，444，446，449-451，459-460，462-463和467-476。
12.包含根据权利要求3、5、6或7中任何一个的核酸分子编码的氨基酸序列的超免疫血清反应性抗原及其片段，其中所述氨基酸序列选自Seq ID No 173，179，181，194，197，214，233，245，254，285-286，297，426，428-430，434-438，440-443，445，447-448，452-458，461和464-466。
13.包含根据权利要求4、5、6或7中任何一个的核酸分子编码的氨基酸序列的超免疫血清反应性抗原及其片段，其中所述氨基酸序列选自Seq ID No 260，317。
14.超免疫血清反应性抗原的片段，其选自包含表1a和表1c“推定的免疫原性氨基酸”和“鉴别的免疫原性区域的位置”栏的氨基酸序列的肽，表2的血清反应性表位，尤其是包含如下氨基酸的肽4-10，14-21，30-36，59-68，77-82，87-93，96-105，112-121，125-133，135-141，150-162，164-183，192-203，207-213，215-226，228-234，241-247，250-285，302-308和135-148位的Seq ID No 171；15-57，60-73，77-101，108-134，136-177，185-201，203-217，226-240，244-254，272-277，283-288，292-343，354-370，380-398，406-437，439-453，473-490，532-538，584-590，595-601，606-612，664-677，679-704，715-724，731-753，759-772，786-794，814-862和657-684位的Seq ID No 172；4-9，15-36，41-47，54-60，75-81，114-120，131-146，152-158，174-182，194-202，208-215，218-226，255-271，276-285，290-295，302-311，318-328，330-344，352-359，365-377，388-395，398-405，426-432，439-449，455-500，505-513，531-537，542-552，554-561，587-595，606-612，718-734，763-771，775-782，792-801，805-812，822-828，830-843，849-863，876-894，905-911，919-926，935-947，949-958，968-979，1009-1016，1029-1045，1047-1056，1076-1081，1092-1106，1123-1133，1179-1200，1202-1211，1215-1223，1287-1299，1301-1306，398-431和1224-1237位的Seq ID No 173；17-47，74-80，90-97，126-133，137-148，167-173，179-185，214-223，250-255，270-283，329-338，342-350，352-358，360-367，372-383，398-404，411-421，426-432，435-446，452-462，472-479，515-521，582-592，611-618，623-629，642-659，666-673，678-689，704-725，732-737，744-757，768-789，824-834，842-849，862-868，877-887，904-916，923-928，941-947，962-974，982-992，1019-1030，1032-1044，1046-1052，1065-1075，1077-1087，1108-1121，1124-1132，1137-1151，1170-1182，1190-1206，1208-1214，1227-1233，1242-1251，1254-1273，1282-1298和792-825位的Seq ID No 174；19-31，39-67，82-91，104-110，113-128，149-155，161-181和137-155位的Seq ID No 175；6-18，54-63，69-85，110-127，142-156，158-167，169-211，238-246，248-257，276-311，339-349，371-380，385-391，394-403，421-438，451-456，483-489和449-468位的Seq ID No 176；5-15，24-34，50-56，61-83，98-121，123-136，149-162，166-194，202-215，221-227，229-332，337-360，367-402，404-415，427-433，444-462，471-478，487-498，511-518，521-544，550-563，568-574，580-587，597-607，610-616，624-629和468-498位的Seq ID No 177；11-19，32-49，57-63，65-71，80-89，91-133，166-181，183-191，201-230，234-257，264-291，297-303，305-314，316-335，337-354，359-366，368-374，383-388，394-405，408-442，446-470，483-490，499-505，513-538，544-555，557-563，568-590，598-608，617-623，627-636，641-647，667-685，687-693，710-723，733-739，742-754，769-815和366-388位的Seq ID No 178；4-16，30-35，42-53，67-76，82-87，101-108，112-130，132-138，147-152，161-183，187-208，218-225，265-281，295-303，305-317，322-334，338-357，360-368，370-383，387-394，400-419，421-430和255-336位的Seq ID No 179；19-27，36-47，59-66，76-83，101-112，118-125，142-147，162-180，185-196，225-240，246-263，286-304，314-319，327-333，353-367和194-214位的Seq ID No180；14-43，70-76，83-89，111-117，122-128，136-145，163-170，175-182，210-219，246-251，266-279，325-331，338-346，348-354，356-363，368-379，422-428，431-441，450-456，466-473，509-515，532-542，549-556，576-586，605-612，617-623，636-653，660-667，674-686，698-719，726-731，738-745，762-783，818-828，836-843，856-862，871-881，903-910，917-922，935-941，956-968，976-986，1013-1024，1026-1038，1059-1069，1071-1081，1102-1115，1118-1126，1131-1145，1164-1176，1187-1200，1202-1208，1221-1227，1236-1245，1248-1267，1273-1292，252-287和805-844位的Seq ID No 181；4-18，21-28，37-43，56-70，101-113，131-140，142-150，162-170，172-184，193-204，209-227，233-238，246-264和93-168位的SeqID No 182；14-20，44-50，61-70，77-96，99-106，129-142，168-181，187-196，205-221，225-241，277-296和257-281位的Seq ID No 183；18-29，43-54，64-76，78-84，88-103，125-149，159-176，198-218，230-242，256-271，279-285，287-293，300-306，325-331，344-351，357-364，371-397，400-414，419-464，485-515，517-526，529-537，548-553，573-580，584-590，603-620，639-661，676-681，687-700，716-761，772-780，785-790，795-803，823-836，848-853和106-134位的Seq ID No 184；7-13，19-42，44-51，55-75，87-97，99-110，112-118，129-135，141-156，158-178，213-220，230-286，294-308，323-338，345-352，355-365，370-392，394-419，437-446，454-460，474-497，515-526，528-546，569-575和128-141位的Seq ID No 185；12-20，24-33，45-70，73-84，86-94，103-116，118-124，135-142，163-170，176-200，202-224，226-234，237-248，250-262，265-287，296-307，334-341，347-356，361-369，382-396，405-415，418-427，431-439，443-449，452-461，467-474和113-146位的Seq ID No 186；13-38，44-50，52-59，66-72，83-94，103-110，116-124，131-137，158-180，199-204，218-233，241-264，269-317，326-342，350-356和70-86位的Seq ID No 187；29-35，49-59，63-84，86-97，103-111，113-126，130-144，150-158，174-198，221-231，250-264，266-273，291-298，310-318和70-90位的Seq ID No 188；19-25，28-52，60-66，71-76，131-142，149-155，157-178，181-213，218-223，237-242，250-257，260-266，272-279，282-290，321-330，373-385，393-407，441-453，461-475，509-521，529-542，577-589，597-610，643-655，663-677，703-718，729-734，358-464，495-570和604-685位的Seq ID No 189；4-29，51-76，116-136，158-173，179-193，207-215和86-111位的Seq ID No 190；5-23，45-70，79-90，93-107，114-122，142-151和18-36位的Seq ID No 191；9-51，68-120，133-149，158-180，186-206，211-220，222-237，248-293，296-310，317-339和248-260位的Seq ID No 192；14-24，44-63，69-98，108-119，123-136，155-161，164-176，180-193，203-208，215-223，239-247，274-281，283-289，296-304，306-313，315-327，331-341，343-353，357-386，392-405和205-246位的Seq ID No 193；5-13，16-23，36-42，53-63，70-83，96-102和14-34位的Seq ID No 194；4-13，19-35，49-56，59-76，83-107，121-134，144-153，157-164，166-186，194-202，209-216，231-253，257-264和98-134位的Seq ID No 195；16-32，38-47，58-68，78-89，98-114，117-123，132-141，146-156，164-170，179-188，196-212，219-230，232-237，244-263，265-274，278-293，297-303，306-326，339-349，352-359，362-367，373-379，384-394，396-406，423-443，451-461，465-484，490-497，504-511，523-533，537-547，550-556，558-566，573-579，586-593，598-609，615-642，647-665，671-686，693-713，723-728和332-378位的Seq ID No 196；6-21，34-44，58-64，66-74，79-87，114-127，129-143，154-162，174-189，205-214，241-262，266-273，278-297，319-324，328-338，342-351，390-398，409-415，422-435，458-464，471-477，481-486，506-531，534-540，542-550和315-389位的Seq ID No 197；4-28，39-45，52-58，69-82，93-115，122-128，135-140，146-163，177-192，209-215，221-232，271-284，331-337，341-352，360-378，383-390，392-401，409-422，428-435，462-470，474-480，482-496，531-539，541-549，551-560，562-569，576-582，598-618和98-127位的Seq ID No198；14-27，33-47，61-79，94-104，119-133和36-60位的Seq ID No 199；11-22，29-40，48-62，68-73，96-106，108-118，125-149和102-126位的SeqID No 200；4-11，45-55，76-83，86-102，105-112，138-144，147-153和20-48位的Seq ID No 201；12-20，28-56，62-68，72-82，93-99，101-107，120-133，135-145，178-186，208-232，279-292和36-64位的Seq ID No 202；6-14，23-48，65-82，92-134，140-181，188-219，228-238，244-253，255-261和124-145位的Seq ID No 203；11-25，31-38，53-59，62-71，89-99，125-133，151-157，182-190，195-203，208-215，219-229，249-262，267-275，287-295，298-316，318-325，328-334，344-353，357-363，371-377，385-391，396-415，425-436，438-457，471-485，538-552，554-561，606-625，630-636，646-653，669-679，695-704，706-715，722-747，763-773和714-738位的Seq ID No 204；10-29，33-45，50-60，70-79，83-95，118-124，136-157，176-184，192-205，207-216，223-234，240-246，258-268，275-283和37-56位的Seq ID No 205；4-24，27-38，46-54，66-72，81-97，112-119，128-137，152-157，173-179，185-214，219-225，227-248，262-284，286-295，301-307和117-134位的Seq ID No 206；26-43，49-56，60-71，74-82，87-98，110-116，131-146，154-164，169-178，183-189，205-214，241-246，255-268，275-292，305-314，316-323，326-340，346-363，397-402，419-429，440-446，452-461，467-475和29-66位的Seq ID No 207；7-16，21-39，48-58，61-78，82-89，109-136，138-150，152-176，182-247，255-261，267-332，336-345，347-358，362-368，371-392，394-404，407-472，490-498，505-513，527-544，554-582，603-611，614-620，632-638和500-523位的Seq ID No 208；24-46，77-83，90-97，99-118，123-166，168-177，204-212，229-239，248-262，273-282，287-293，300-319，321-337，340-352，357-366，391-402，411-428，442-450，464-471，479-489和19-40位的Seq ID No 209；9-23，25-34，53-58，70-86，90-97，99-116，118-128，131-141，185-191，228-233，237-253，255-261，264-271，273-280，302-312，319-349，351-359，362-369，376-383，387-394，398-406，419-434和20-31位的Seq ID No 210；15-22，37-43，71-87，105-115，121-127，135-142，152-158和32-52位的Seq ID No 211；6-12，18-29，37-47，50-58，65-83，85-91，94-99，108-123，142-150，156-163，183-193，215-222，242-249，252-258，261-270，285-308，318-326和1-95位的Seq ID No 212；9-61，65-133，144-155，166-173，175-221，233-276，278-313，329-368和210-233位的Seq ID No 213；11-29，33-39，46-51，65-93，107-113，134-143，147-154，166-177，181-188，214-220，233-243，263-269和112-128位的Seq ID No 214；8-46，110-134，155-167，174-183，188-201，210-230，253-258，267-282，289-299，312-319，322-327，330-337，365-381，389-402，405-411，419-425，439-447，465-472，489-512，525-532，540-554，577-589，591-599，605-614，616-624，633-649和503-529位的Seq ID No 215；34-49，64-70，90-118，124-131，141-152，159-165和112-128位的Seq ID No 216；5-15，26-45，55-72，80-85，93-100，121-133，142-148，154-167，198-205，209-215，241-254，260-265，271-279和244-270位的Seq ID No 217；4-36，38-54，67-83，122-153，159-178，205-212，232-242，244-253，259-268，281-288，298-309，324-331，334-370，372-381，389-401，403-429，441-450，456-462，465-471，473-479，483-504，508-518，537-543，553-565，578-584，592-609，619-625，658-667，669-679，712-719，722-729，737-744，746-752，758-765和180-226位的Seq ID No218；6-17，23-32，49-56，61-67，76-83，85-103，105-111，120-132，145-171，175-185，191-225，231-246和99-128位的Seq ID No 219；4-24，28-48，52-58，64-79，87-100，104-120，136-152，159-166和150-163位的Seq IDNo 220；15-27，65-71，77-99，104-121，128-154，183-216，223-229，234-255，277-287，296-308和77-97位的Seq ID No 221；8-18，44-76，102-109和49-57位的Seq ID No 222；5-14，28-40，42-51，54-60，77-83，89-100，117-124，146-172，176-204，216-231，237-244，267-278，324-334，342-348，396-401，427-433，438-450，452-457，465-471，473-481，491-500，509-515，523-544，550-556，558-569，589-595，606-618，625-632，640-649，665-671，678-688，691-698，717-723，728-734，781-789，800-805，812-821，833-868，873-879，889-905，929-939，988-998，1046-1061，1073-1079，1089-1096，1115-1124，1132-1140，1172-1196，1220-1226，1231-1249，1269-1277，1287-1301，1307-1330，1350-1361，1369-1378，1387-1412，1414-1420，1422-1439，1484-1491，1513-1529，1552-1561，1576-1583，1606-1613，1617-1640，1647-1654，1665-1679，1686-1698，1709-1727，1736-1743，1750-1757，1771-1790，1801-1807，1817-1823，1831-1842，1859-1868，1870-1882，1884-1891，1900-1906，1909-1914，1929-1935，1952-1960，1974-1988，2002-2011，2032-2063，2071-2081，2116-2124，2139-2147，2149-2159，2163-2190，2209-2215，2245-2253，2282-2287，2331-2342，2360-2370，2379-2393，2402-2408，2414-2421，2423-2430，2433-2439，2442-2450，2472-2478，2485-2493，2495-2503，2506-2512，2547-2554，2558-2564，2615-2625，2637-2652，2692-2698，2700-2706，2711-2723，2731-2740，2748-2753，2756-2762，2765-2772，2781-2798，2810-2824，2844-2852，2885-2899，2912-2922，2937-2944，2947-2970，2988-2998，3016-3025，3032-3037，3062-3071，3129-3148，3156-3161和530-607位的Seq ID No 223；31-36，57-62，79-85，90-96，99-112，120-146，162-185，193-203，208-217，219-226，239-253，283-290，298-304，306-321，340-349，351-361，365-372，386-395，407-438，473-486，537-551，558-568，576-594，598-604和75-95位的Seq ID No 224；14-19，24-30，34-42，45-52，54-64，66-82，95-105，107-118，126-163，171-177，184-201，210-215，260-269，3-279，288-304，321-327，358-364，370-375，380-387，394-404，407-413，421-431，436-451，465-474，504-511，531-552，578-587，614-626，629-636，638-671，691-715，719-729，733-745，752-759，768-777，785-792，794-802，805-824，844-854，867-880，885-891，893-902，907-924，939-948，955-964，966-975，987-1000，1012-1017，1023-1028，1050-1071，1083-1098，1102-1115，1133-1146，1170-1183，1204-1211，1213-1223，1262-1311，1313-1319，1346-1355，1366-1371，1383-1405，1409-1414和776-819位的Seq ID No 225；12-27，30-38，54-61，64-74，82-96，103-110，117-125，134-140，147-158，185-201，218-225，232-253，265-280，319-325，350-362，366-372，376-386，464-483，485-490，511-521，531-537，542-559，564-574，593-609，613-619，637-642，668-677和195-214位的Seq ID No 226；4-21，59-67，73-79，84-91，141-151，186-197，203-214，222-227，237-245，255-260，281-292，294-311，336-344，346-355，422-437，459-466，484-491和77-109位的Seq ID No 227；10-45，52-61，63-70，74-102，112-122，124-132，164-178，181-205，212-240，246-256和226-247位的Seq ID No228；38-50，53-63，78-87，89-111，126-152，169-176，179-186，193-228，254-267，275-282，288-304，309-318，325-341，346-353，358-367，384-395，404-427，429-435，456-465，467-501，510-521，523-536，541-548，552-560，563-584，589-595，597-620，625-637，639-645，661-666，712-729，734-741，743-750，775-806，809-816，818-840，842-850和693-714位的Seq ID No229；5-17，30-37，52-75，77-86，88-107，112-135，151-160，178-222，226-246，263-270，279-294，306-314，327-342，345-352，374-381，389-416，422-429，435-449，453-467，473-500，512-522，524-531，542-549，552-560，565-571，575-586，594-600，613-619，625-633，635-641，647-653，667-674，680-699，711-729，735-741，764-775，781-786，792-798，805-813，817-825，833-842，850-855，860-866，869-910，917-930，949-990和533-562位的Seq ID No 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237；4-15，21-27，33-39，42-56，58-64，68-82，84-90，92-98，113-122，146-162，168-175，177-189，191-203，249-268，279-285，287-304，328-342，349-358，371-378，387-393，404-413，419-425，467-479，487-498，513-524，528-539，541-565，572-579，595-606，626-635，637-642和612-626位的Seq ID No 238；7-13，52-70，76-82，97-106，110-117和13-45位的Seq ID No 239；5-10，12-48，59-64，87-102，107-128，131-140，154-161，165-171，173-215和54-74位的Seq ID No 240；4-11，19-28，34-40，74-81，87-98，126-147，163-171，184-193，205-213和49-124位的Seq ID No 241；7-14，23-29，35-40，61-67，99-106，111-122，124-133，135-161，187-206，216-229，236-245，262-268，271-280和256-273位的Seq ID No 242；4-13，17-37，47-54，85-99，105-113，120-132，147-166，180-186，192-199，204-216和127-144位的Seq ID No 243；14-27，29-37，52-62，68-76，89-96，117-123，125-131，137-145，166-195，205-212，214-222，228-235，258-264，271-281，288-296，308-324，332-339，355-361，365-371和268-293位的Seq ID No 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No265；8-16，18-28，42-50，53-75，79-86，94-99，122-128，136-142，149-163，166-173，198-212，254-272，288-295，304-318，324-329，343-348，351-364，367-383，389-395，411-420，427-436和11-56位的Seq ID No 266；19-25和6-24位的Seq ID No 267；6-39，59-68和44-63位的Seq ID No 268；5-14，21-28，38-53和29-41位的Seq ID No 269；4-13，31-41，56-65和32-56位的Seq ID No 270；5-12和4-21位的Seq ID No 271；4-18和17-32位的Seq ID No 272；4-10，23-33和14-30位的Seq ID No 273；26-34，44-53和35-52位的Seq ID No 274；1-19位的Seq ID No 275；4-17，23-30，32-37和6-23位的Seq ID No 276；5-33，40-58，61-66和45-66位的Seq IDNo 277；15-41，61-67和41-65位的Seq ID No 278；4-12，16-23，26-37和10-29位的Seq ID No 279；23-39和37-55位的Seq ID No 280；12-20和38-55位的Seq ID No 281；22-37和7-22位的Seq ID No 282；3-14位的Seq ID No 283；6-16，43-65，71-76和17-31位的Seq ID No 284；4-13，27-39，42-69和17-32位的Seq ID No 285；4-12，26-39和10-25位的SeqID No 286；2-31位的Seq ID No 287；6-38，49-62和39-55位的Seq IDNo 288；4-10，24-30和2-19位的Seq ID No 289；12-17，25-46和15-30位的Seq ID No 290；4-13和2-28位的Seq ID No 291；30-38和17-45位的Seq ID No 292；24-33，55-61和31-61位的Seq ID No 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451；82-94，111-118，125-131，206-212，261-266，310-320，328-338，345-351，353-360，414-420，424-434，440-447，451-500，506-516，548-561，566-572，584-591，601-622，630-636，650-659，661-667，674-699，703-711，717-729，736-744，752-759，765-771，813-822，826-842，852-868，870-877，881-895，897-906，913-922和602-671位的Seq ID No 452；12-18，20-25，43-54，56-65，73-79，82-88，99-111，136-142，153-169，171-183，195-223，229-248，255-260，272-277，281-292，298-319，322-329，332-351，363-379，381-389和275-304位的Seq ID No 453；4-9，34-48，65-77，101-106，111-131，138-153，186-191，230-250和148-219位的Seq ID No 454；4-23，30-35，42-53，67-76，82-87，101-108，112-130，132-138，147-152，161-183，187-208，218-225，265-283，295-303，306-317，322-334，338-357，360-368，370-383，387-398，400-419，421-430，104-182和240-304位的Seq ID No455；4-12，63-69，94-102，146-164，166-173，175-181，193-207，263-281，286-295，301-306，330-343，369-378，382-388，414-420，422-430，438-454，456-462，472-531，543-560，581-591，596-605，614-623，626-635，656-662，669-676，683-690，693-698，705-711，728-736，752-764和69-102位的SeqID No 456；6-12，43-53，141-147，164-179，185-195，197-206，227-235，237-271，288-305，308-317，335-341，351-357，365-376，386-395，397-416，422-447和11-35位的Seq ID No 457；16-24，50-65，73-84，88-99，114-124，130-146，181-187，193-203，214-220，236-247，250-258，287-297和50-113位的Seq ID No 458；4-25，50-55，76-82，117-123，131-137，139-148，157-166，239-245，253-258，266-275，277-292，300-306，51-83和93-161位的Seq ID No 459；6-22，34-43，51-86，93-100，110-116，150-161，164-171，180-187，197-218和168-237位的Seq ID No 460；4-27，55-60，74-82和10-46位的Seq ID No 461；6-19，25-31，43-49，60-79，88-100，105-129，148-161，164-171，187-193，243-263，316-322，334-340，369-378，381-391，398-404，460-466，474-483，502-509，511-517，525-530，558-567，579-596，622-627，631-638，641-651，653-659，674-680，687-693，710-716，720-727，743-753，760-775，788-795，806-813，821-828，836-842，847-860，865-880和258-377位的Seq ID No 462；4-11，25-64，71-79，88-94，107-120，123-132，167-188，231-237，240-246，261-267，306-311，330-342，351-358，389-395，406-418，429-434，439-448，483-501，511-520和71-143位的SeqID No 463；4-18，22-27，53-64，94-100，121-127，133-139，155-164，177-182，187-196，206-218，224-242，248-253，258-277和184-253位的Seq ID No 464；10-17，56-67，72-82，94-99，106-113，166-173，229-235，243-283，295-301，313-321，326-331，342-348，396-414，423-435，446-452，454-462，496-502，511-534，543-556，563-570，586-593，616-626，638-645，653-662，679-696，731-737，766-774，776-782，790-796，810-817，825-835，837-846和540-615位的Seq ID No 465；13-24，30-36，73-81，89-95，109-115，117-143，161-173，179-189，226-244，251-261，275-281，298-305，307-315，323-328，364-374，69-186和264-354位的Seq ID No 466；19-25和6-22位的Seq ID No 467；6-39，59-68和43-62位的Seq ID No 468；6-14，22-32和1-27位的Seq ID No 469；4-41和28-40位的Seq ID No 470；8-14和4-19位的Seq ID No 471；4-10，12-22，30-35和6-33位的Seq IDNo 472；4-16，24-33和37-54位的Seq ID No 473；2-23位的Seq ID No474；4-21，27-33，36-41和14-34位的Seq ID No 475；4-14，24-30，37-42，57-78，83-89，94-103，113-131和100-122位的Seq ID No 476。
15.一种生产根据权利要求11至14中任何一个的粪肠球菌超免疫血清反应性抗原或其片段的方法，包括表达根据权利要求1至7中任何一个的核酸分子。
16.一种生产表达根据权利要求11至14中任何一个的粪肠球菌超免疫血清反应性抗原或其片段的细胞的方法，包括用根据权利要求8或权利要求9的载体转化或转染合适的宿主细胞。
17.一种药物组合物，尤其是疫苗，包含如权利要求11至14中任何一个定义的超免疫血清反应性抗原或其片段或根据权利要求1至7中任何一个的核酸分子。
18.根据权利要求17的药物组合物，尤其是疫苗，特征在于它进一步包含一种免疫刺激物质，优选地选自尤其是聚阳离子肽的聚阳离子聚合物、免疫刺激脱氧核苷酸(ODN)、包含至少两个LysLeuLys基序的肽、尤其是人生长激素的神经活性化合物、明矾、弗氏完全或不完全佐剂或其组合。
19.根据权利要求1至7中任何一个的核酸分子或根据权利要求11至14中任何一个的超免疫血清反应性抗原或其片段用于制备药物制品，尤其是用于制备抗肠球菌感染的疫苗的用途。
20.一种抗体或至少其有效部分，所述抗体至少结合根据权利要求11至14中任何一个的超免疫血清反应性抗原或其片段的选择性部分。
21.根据权利要求20的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
22.根据权利要求20或21的抗体，其中所述有效部分包含Fab片段。
23.根据权利要求20至22中任何一个的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体。
24.根据权利要求20至23中任何一个的抗体，其中所述抗体是人源化抗体。
25.产生根据权利要求20至24中任何一个的抗体的杂交瘤细胞系。
26.一种产生根据权利要求20的抗体的方法，特征在于下面的步骤●通过给予非人的动物权利要求11至14中任何一个定义的超免疫血清反应性抗原或其片段而引发所述动物的免疫反应，●从所述动物移出含有抗体的体液，以及●通过对所述含有抗体的体液进行进一步的纯化步骤而产生所述抗体。
27.产生根据权利要求21的抗体的方法，特征在于下面步骤●通过给予非人的动物如权利要求12至15中任何一个定义的超免疫血清反应性抗原或其片段而引发所述动物的免疫反应，●从所述动物移出脾或脾细胞，●产生所述脾或脾细胞的杂交瘤细胞，●挑选并克隆特异于所述超免疫血清反应性抗原或其片段的杂交瘤细胞，●通过所述克隆的杂交瘤细胞的培养和可选的进一步的纯化步骤产生所述抗体。
28.根据权利要求20至24中任何一个的抗体用于制备治疗或预防肠球菌感染的药物的用途。
29.一种拮抗剂，其结合根据权利要求11至14中任何一个的超免疫血清反应性抗原或其片段。
30.一种鉴别能够结合根据权利要求11至14中任何一个的超免疫血清反应性抗原或其片段的拮抗剂的方法，包括a)在允许所述候选拮抗剂与所述超免疫血清反应性抗原或其片段结合的条件下，在能提供响应于所述候选拮抗剂与所述超免疫血清反应性抗原或其片段结合的可检测信号的组分的存在下，将所述分离的或固定化的根据权利要求11至14中任何一个的超免疫血清反应性抗原或其片段与所述候选拮抗剂接触；以及b)检测响应于所述拮抗剂与超免疫血清反应性抗原或其片段的结合产生的信号的存在与否。
31.鉴别能够降低或抑制根据权利要求11至14中任何一个的超免疫血清反应性抗原或其片段与其相互作用伴侣之相互作用活性的拮抗剂的方法，包括a)提供根据权利要求11-14中任何一个的超免疫血清反应性抗原或其超免疫片段，b)向尤其是根据权利要求20至24中任何一个的抗体的所述超免疫血清反应性抗原或其片段提供相互作用伴侣，c)允许所述超免疫血清反应性抗原或其片段与所述相互作用伴侣相互作用以形成相互作用复合物，d)提供候选拮抗剂，e)允许候选拮抗剂和相互作用复合物之间发生竞争反应，f)测定候选拮抗剂是否抑制或降低超免疫血清反应性抗原或其片段与相互作用伴侣的相互作用活性。
32.根据权利要求11至14中任何一个的超免疫血清反应性抗原或其片段的用途，用于所述超免疫血清反应性抗原或其片段的相互作用伴侣的分离和/或纯化和/或鉴别。
33.一种体外诊断与根据权利要求11至14中任何一个的超免疫血清反应性抗原或其片段的表达相关的疾病的方法，包括测定编码所述超免疫血清反应性抗原和片段的根据权利要求1-7中任何一个的核酸序列的存在，或根据权利要求11-14中任何一个的超免疫血清反应性抗原或其片段的存在。
34.一种细菌感染，尤其是肠球菌感染的体外诊断的方法，包括分析编码所述超免疫血清反应性抗原或其片段的根据权利要求1至7中任何一个的核酸序列的存在，或者根据权利要求11至14中任何一个的超免疫血清反应性抗原或其片段的存在。
35.根据权利要求11至14中任何一个的超免疫血清反应性抗原或其片段的用途，用于产生结合所述超免疫血清反应性抗原或其片段的肽，其中所述肽选自抗促成素。
36.根据权利要求11至14中任何一个的超免疫血清反应性抗原或其片段用于功能性核酸制造的用途，其中所述功能性核酸选自适体和镜面体。
37.根据权利要求11至14中任何一个的核酸分子用于制备功能性核糖核酸的用途，其中功能性核糖核酸选自核酶、反义核酸和siRNA。
全文摘要
本发明公开了来自粪肠球菌的编码超免疫血清反应性抗原或其片段的分离的核酸分子以及超免疫血清反应性抗原或其片段、分离这样的抗原的方法及其特定用途。
文档编号G01N33/569GK1798761SQ200480015159
公开日2006年7月5日 申请日期2004年5月26日 优先权日2003年5月30日
发明者A·迈因克, E·纳吉, M·汉纳, D·格尔贝曼 申请人:英特塞尔股份公司