一种仔猪红痢c型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种仔猪红痢C型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法，将C型产气荚膜梭菌的菌种NCTC3180接种于血平板培养基上，37℃厌氧培养36h；将培养物采用自制的产毒培养基（100毫升PBS缓冲液、2克蛋白胨、1克糊精、2克酵母提取物、1.2克L-精氨酸），在厌氧环境下振荡培养制备类毒素，然后将其灭活、过滤加入佐剂制成。使用时，肌肉注射，母猪在分娩前一月和半月各注射一次，剂量为每次5-10毫升。本发明用于免疫妊娠后期的母猪，新生仔猪通过初乳获得被动免疫，可以预防仔猪红痢。还能预防绵羊猝狙，犊牛肠毒血症，从而能够有效地控制C型产气荚膜梭菌病的流行。
【专利说明】一种仔猪红痢C型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法(-)发明领域
[0001]本发明涉及一种仔猪红痢C型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法。
(二)发明背景
[0002]魏氏梭菌又称产气荚膜梭菌，根据所产毒素的不同，可分为ABCDE五型。C型菌主要是绵羊猝狙的病原，初生仔猪易感，表现为血痢和高死亡率，也能引起羔羊、犊牛、绵羊的肠毒血症和坏死性肠炎，该菌主要产生α、β两种外毒素。自八十年代中期，全国约二十个省市首先在猪牛羊兔群中出现猝死症，给畜牧业生产带来了很大损失。近年来，全国各地反刍动物坏死性肠炎及肠毒血症的发病率还有明显上升趋势，成为困扰我国畜牧业发展的一大难题，严重地影响了畜牧业的发展。
[0003]为了控制产气荚膜梭菌病的流行，许多学者曾研制过产气荚膜梭菌的灭活菌苗用于预防。王克领(1998)等对兔出血病、魏氏梭菌病、巴氏杆菌病三联苗进行研究；谭诗文等(2000)曾经进行了羔羊痢疾、大肠杆菌病、羊猝狙、羊肠毒血症四联油佐剂灭活苗的研制。文希喆等(1985)还研制了魏氏梭菌多联干粉灭活苗。此外还有羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗，家兔产气荚膜梭菌病A型灭活疫苗，这些疫苗对该病的流行有一定的控制作用，但也存在一些不足，如家畜接种反应较重，多联苗的注射剂量较大，而且有些疫苗的免疫效果不确实，质量需进一步改进。
[0004]C型菌的致病机理为外界因素导致肠道内产气荚膜梭菌大量增殖，在肠道内产生大量外毒素粘附在肠粘膜上皮上，使得肠壁通透性增加，毒素进入血液循环，引起毒血症。Bohenel指出:“魏氏梭菌致病是由于它们形成分泌的毒素和代谢产物，无毒素产生就不会出现临床症状”。根据上 述致病机理，C型产气荚膜梭菌疫苗的预防重点应当在对外毒素研究的基础上，研制类毒素疫苗。
(三)
【发明内容】
[0005]为了解决上述问题，本发明提供了一种仔猪红痢C型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法。
[0006]一种仔猪红痢C型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法，包括如下步骤:
[0007]将C型产气荚膜梭菌的菌种接种于血平板培养基上，37°C厌氧培养36h复苏；取复苏后的一个单菌落接种于硫乙醇酸盐流体培养基FT，37°C厌氧培养12h增菌；将增菌培养物按照接种量5% (体积比)接种于产毒培养基，40°C厌氧振荡培养5h ;培养液离心,取上清，蔡氏滤器过滤除菌，得到外毒素溶液；在外毒素溶液中加入外毒素溶液体积比0.3%的甲醛，充分振荡混匀，37°C，灭活8天，期间每隔5-6h振摇一次得到灭活好的类毒素溶液；将白油与span-80以体积比32:3混匀后，再加入白油与span-80混合液质量比2%的硬脂酸铝，高压灭菌得到油相；在灭活好的类毒素溶液中加入体积比2%的Tween-80混合得到水相；将油相与水相以体积比1:1乳化，每IOOml乳化液中加入0.01克硫柳汞，混匀后，制成C型产气荚膜梭菌类毒素疫苗；[0008]所述血平板培养基成分为:100毫升蒸馏水、I克葡萄糖、3.8克豆琼脂粉和5毫升绵羊血；所述产毒培养基成分为:100毫升PBS缓冲液、2克蛋白胨、I克糊精、2克酵母提取物和1.2克L-精氨酸；所述PBS缓冲液的成分为:100毫升去离子水、0.8克氯化钠、0.02克氯化钾、0.358克十二水合磷酸氢二钠和0.027克磷酸二氢钾。
[0009]使用时，肌肉注射，母猪在分娩前一月和半月各注射一次，剂量为每次5-10毫升。
[0010]有益效果
[0011]本研究开发制备了效价高、免疫力强、治疗效果好，无毒副作用的绵羊猝狙、仔猪红痢、犊牛肠毒血症的C型产气荚膜梭菌类毒素疫苗，用于免疫妊娠后期的母猪，新生仔猪通过初乳获得被动免疫，可以预防仔猪红痢。还能预防绵羊猝狙，犊牛肠毒血症，从而能够有效地控制C型产气荚膜梭菌病的流行。
(四)【具体实施方式】
[0012]实施例1仔猪红 痢C型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备
[0013]细菌增菌用接种环挑取三环C型产气荚膜梭菌菌种(National Collection ofType Cultures英国微生物菌种保藏中心保藏,保藏号:NCTC3180)接种于一个血平板培养基(100毫升蒸馏水、I克葡萄糖和3.8克豆琼脂粉灭菌后，加入5毫升绵羊血分装到六个血平板上)上，37°C厌氧培养36h。取单个菌落接种于一个含7-8毫升硫乙醇酸盐流体培养基(FT)(培养基成分通用)的试管内，37°C厌氧培养((88% N2,7% H2和5% CO2) ) 12h增菌。取5毫升液体培养物接种于100毫升产毒培养基(100毫升PBS缓冲液、2克蛋白胨、I克糊精、2克酵母提取物、1.2克L-精氨酸)中，所述PBS缓冲液的成分为:100毫升去离子水、0.8克氯化钠、0.02克氯化钾、0.358克十二水合磷酸氢二钠、0.027克磷酸二氢钾，40°C厌氧振荡培养5h。
[0014]外毒素制取培养液4°C 10000r/min离心30min，取上清，用孔径0.22 μ m的蔡氏滤
器过滤除菌，得到外毒素溶液。
[0015]毒素灭活在制取好的外毒素溶液中加入外毒素溶液体积比0.3%的甲醛，充分振荡混匀，然后置37°C，8天完全灭活，期间每隔5-6h振摇一次，得到灭活好的类毒素。
[0016]类毒素疫苗制备将白油与span-80以32:3的体积比混匀后，再加入白油与span-80混合液质量比2%的硬脂酸铝，高压灭菌，即为油相。在灭活好的类毒素溶液加入体积比2%的Tween-80混合，即为水相。油相与水相以体积比1:1乳化，每IOOml乳化液中加入0.01克硫柳汞，混匀后，制成C型产气荚膜梭菌类毒素疫苗。
[0017]疫苗的无菌检验参照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》(2001年版)附录301页进行，无菌生长。
[0018]疫苗的安全检验用体重1.5-2千克的家兔4只，各肌肉注射C型产气荚膜梭菌类毒素疫苗5毫升，观察10日，均健活，注射部位没有发生坏死。
[0019]疫苗效力检验用体重40kg以上的健康易感猪6只，其中4只猪每只肌肉注射C型产气荚膜梭菌类毒素疫苗5毫升，2只不注射疫苗作为对照组；14日后，6只猪均注射10毫升本发明制备的C型产气荚膜梭菌外毒素溶液，观察3-5日，对照组2只猪全部死亡，免疫组猪4只均未死；继续观察7天，未出现绵羊猝狙、仔猪红痢、犊牛肠毒血症等病症，说明该疫苗对猪的保护力达到了 100%。[0020]免疫剂量的确定选体重40kg以上的健康易感猪8只，平均分为四组，分别编号为A组、B组、C组、D组，每组分别注射C型产气荚膜梭菌类毒素疫苗剂量为1ml、3ml、5ml、7ml，两周后，8只猪均注射10毫升的C型产气荚膜梭菌外毒素溶液，观察3-5日，A组和B组猪均死亡，C组和D组均健康存活，因此免疫剂 量定为5毫升。
【权利要求】
1.一种仔猪红痢C型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤: 将C型产气荚膜梭菌的菌种接种于血平板培养基上,37°C厌氧培养36h复苏；取复苏后的一个单菌落接种于硫乙醇酸盐流体培养基FT，37°C厌氧培养12h增菌；将增菌培养物按照接种量5%体积比接种于产毒培养基，40°C厌氧振荡培养5h;培养液离心，取上清，蔡氏滤器过滤除菌，得到外毒素溶液；在外毒素溶液中加入外毒素溶液体积比0.3%的甲醛，充分振荡混匀，37°C，灭活8天，期间每隔5-6h振摇一次得到灭活好的类毒素溶液；将白油与span-80以体积比32:3混匀后，再加入白油与span-80混合液质量比2%的硬脂酸铝，高压灭菌得到油相；在灭活好的类毒素溶液中加入体积比2%的Tween-80混合得到水相；将油相与水相以体积比1:1乳化，每IOOml乳化液中加入0.01克硫柳汞，混匀后，制成C型产气荚膜梭菌类毒素疫苗； 所述血平板培养基成分为:100毫升蒸馏水、I克葡萄糖、3.8克豆琼脂粉和5毫升绵羊血；所述产毒培养基成分为:100毫升PBS缓冲液、2克蛋白胨、I克糊精、2克酵母提取物和1.2克L-精氨酸；所述PBS缓冲液的成分为:100毫升去离子水、0.8克氯化钠、0.02克氯化钾、0.358克十二水合磷 酸氢二钠和0.027克磷酸二氢钾。
【文档编号】A61K39/08GK103432578SQ201310416011
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】柴同杰, 樊金, 王海荣 申请人:山东农业大学