专利名称：抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗及其制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗及其制作方法。
背景技术：
魏氏梭菌(Clostridiumwelchii)，又称产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)是
动物肠道正常菌群之一，也是引起魏氏梭菌病的原凶。其发病机理是在饲养环境和饲料 突然改变等诱因下，肠道内魏氏梭菌大量繁殖，产生的毒素经消化道吸收，导致动物出 现肠毒血症，坏死性肠炎，绵羊软肾病，仔猪红痢、羔羊痢疾、兔出血性下痢，创伤性 气性坏疽，动物猝死症等。根据菌体分泌外毒素不同，将魏氏梭菌分为五个血清型，即 A、B、C、D、E型(见表1)。外毒素是魏氏梭菌的毒力因子，目前已发现有15种之 多，但致死性因子只有4种，S卩α、β、ε和t，其中最根本、最重要的致病因子—— α毒素(C.perfringens alpha toxin, CPA)是A E型所共有的毒力因子。α毒素具有磷 脂酶C (PhospholipaseC，PLC)和鞘磷脂酶(Sphingomyelinase)活性，能水解卵磷脂和鞘 磷脂使细胞膜破裂，因而具有溶血性、细胞毒性、致死性和皮肤坏死等特性。表1各型魏氏梭菌及其主要分泌毒素
权利要求
1.一种抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗的制作方法，其特征是该方法包括(1)以含编码魏氏梭菌α毒素的质粒或病料为模板，利用PCR或RT-PCR扩增获得 魏氏梭菌α毒素基因，将获得的魏氏梭菌α毒素基因和Ti质粒分别进行酶切，回收目 的基因和植物表达载体片段，连接并转化大肠杆菌，对重组Ti进行酶切、PCR和测序鉴 定，用重组质粒转化根瘤农杆菌，筛选、PCR鉴定获得阳性重组根瘤农杆菌ρΑ:已于 2010年6月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO: Μ 2010130。(2)植物种子经春化、萌发、剪接，获得外植体，用步骤(1)中重组的根瘤农杆菌 ρΑ分别侵染外植体，通过筛选、继代、生根、移栽，获得转化植株，筛选鉴定转基因阳 性植株，提取转基因植物基因组或蛋白进行Southern blot、Northern blot或Western blot鉴 定，证明魏氏梭菌毒素在植物中得到表达。
2.根据权利要求1所述的抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗的制作方法，其特征是步 骤(1)中所述的魏氏梭菌α毒素也可以采用魏氏梭菌α毒素和/或魏氏梭菌β毒素和 /或魏氏梭菌ε毒素和/或魏氏梭菌ι毒素；所述的Ti质粒也可以采用Ri质粒，同时 所述的根瘤农杆菌采用发根农杆菌。
3.根据权利要求1或2所述的抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗的制作方法，其特征是 步骤(2)中所述的植物包括牧草或蔬菜或农作物或水果或模式植物，所述的牧草包括苜 蓿，所述的蔬菜包括马铃薯，所述的农作物包括玉米，所述的水果包括西红柿，所述的 模式植物包括烟草。
4.一种利用权利要求1-3的方法制作的抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗，其特征是 所述的抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗为直接口服疫苗，或者将植物表达的蛋白抗原经提 取、加工成口服或注射制剂使用。
5.—种抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗的制作方法，其特征是该方法包括(1)以含黏膜佐剂大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位(LT-B)的质粒或病料为模板， 利用PCR或RT-PCR扩增获得黏膜佐剂LT-B基因，以含编码魏氏梭菌α毒素的质粒 或病料为模板，利用PCR或RT-PCR扩增获得魏氏梭菌α毒素基因，将所述的黏膜佐 剂LT-B基因与所述的魏氏梭菌α毒素基因融合获得融合基因，将获得融合基因和Ti质 粒分别进行酶切，回收目的基因和植物表达载体片段，连接并转化大肠杆菌，对重组Ti 质粒进行酶切、PCR和测序鉴定，用重组质粒转化根瘤农杆菌，筛选、PCR鉴定获得阳 性重组根瘤农杆菌pLA:已于2010年6月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号 为CCTCCNO M 2010131。(2)植物种子经春化、萌发、剪接，获得外植体，用步骤(1)中重组的根瘤农杆菌 pLA分别侵染外植体，通过筛选、继代、生根、移栽，获得转化植株，筛选鉴定转基因 阳性植株，提取转基因植物基因组或蛋白进行Southern blot、Northern blot或Western blot 鉴定，证明魏氏梭菌毒素在植物中得到表达。
6.根据权利要求5所述的抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗的制作方法，其特征是步 骤(1)中所述的大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位(LT-B)或者采用霍乱毒素B亚基 (CT-B)。
7.根据权利要求5所述的抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗的制作方法，其特征是步 骤(1)中所述的魏氏梭菌α毒素也可以采用魏氏梭菌α毒素和/或魏氏梭菌β毒素和/或魏氏梭菌ε毒素和/或魏氏梭菌ι毒素；所述的Ti质粒或者采用Ri质粒，同时所 述的根瘤农杆菌采用发根农杆菌。
8.根据权利要求5所述的抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗的制作方法，其特征是步 骤(2)中所述的植物包括牧草或蔬菜或农作物或水果或模式植物，所述的牧草包括苜 蓿，所述的蔬菜包括马铃薯，所述的农作物包括玉米，所述的水果包括西红柿，所述的 模式植物包括烟草。
9.一种利用权利要求5-8方法制作的抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗，其特征是所 述的抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗为直接口服，还为将植物表达的蛋白抗原经提取、加 工成口服或注射制剂使用。
全文摘要
抗魏氏梭菌病转基因植物疫苗及其制作方法。目前免疫接种抗魏氏梭菌病的疫苗保护率较低。本发明包括(1)以含编码魏氏梭菌毒素的质粒或病料为模板，利用PCR或RT-PCR扩增获得魏氏梭菌毒素基因，将获得的魏氏梭菌毒素基因和Ti或Ri质粒分别进行酶切，回收目的基因和植物表达载体片段，连接并转化大肠杆菌，对重组Ti或Ri质粒进行酶切、PCR和测序鉴定，用重组质粒转化根瘤农杆菌或发根农杆菌，筛选、鉴定阳性重组农杆菌；(2)植物种子经春化、萌发、剪接，获得外植体，用步骤(1)中重组的农杆菌分别侵染外植体，通过筛选、继代、生根、移栽，获得转化植株，筛选鉴定转基因阳性植株。
文档编号C12N15/82GK102008720SQ20101023114
公开日2011年4月13日 申请日期2010年7月20日 优先权日2010年7月20日
发明者刘松梅, 朱延明, 李一经, 葛俊伟 申请人:东北农业大学