专利名称：魏氏梭菌高压脉冲电场灭活方法及检验方法
技术领域：
本发明涉及一种对细菌进行灭活处理的方法及灭菌处理后的检测方法，确 切讲本发明涉及魏氏梭菌灭活方法及检验方法。
背景技术：
魏氏梭菌(cllwelchii )为产气荚膜梭菌(Clostridium per fringens )，属于革兰 氏阳性菌，是引起人和家畜肠道疾病的重要病因，广泛分布于土壤、污水、饲 料、食物、人畜粪便及肠道中。该菌群属典型的条件致病菌，可以引起地区性 流行，也有散发性报道，每年都有大量的动物因不同的产气荚膜梭菌感染时死亡。
根据魏氏梭菌所分泌的肠毒素(a、 (31、卩2、 s、 i、 enterotoxin)性质不同可 分为A E五型，其中对人致病的主要是A、 C两型，B、 C、 D三型与动物 的感染密切相关。A型菌主要引起人的气性坏疽和食物中毒，也可引起动物的 气性坏疽，还可引起牛、羔羊、新生骆驼、野山羊、驯鹿、仔猪、家兔等的肠 毒血症；B型菌主要引起羔羊痢疾，还可引起驹、犊牛、羔羊、绵羊和山羊的 肠毒血症或坏死性肠炎；C型菌主要是绵羊猝狙的病原，也能引起羔羊、犊牛、 仔猪、绵羊的肠毒血症和坏死性肠炎以及人的坏死性肠炎；D型菌引起羔羊、 绵羊、山羊、牛以及灰鼠的肠毒血症；E型菌可致犊牛、羔羊肠毒ffll症，但很少 发生。该病发病率和死亡率高，是影响动物产业发展的重要疫病，给我国的经 济带来的严重的损失。
众所周知，疫苗是预防魏氏梭菌病最有效的方法之一，然而，截止目前， 国内外将更多的目光转向毒素蛋白重组疫苗的研制，国内使用较多的三联氢氧 化铝灭活苗、四联浓縮灭活疫苗和蜂胶灭活疫苗都是通过加入0.5%-0.8%不等的 化学试剂甲醛来杀灭细菌、抑制细菌生长的，而甲醛在动物体内的残留可直接 影响到了人类的饮食安全和身体健康。甲醛除可杀灭细菌外，同时具有强烈的 致癌和促癌作用，长期接触低剂量甲醛可引起慢性呼吸道疾病，引起鼻咽癌、 结肠癌、脑瘤、月经紊乱、细胞核的基因突变，DNA单链内交连和DNA与蛋白质交连及抑制DNA损伤的修复、妊娠综合症，引起新生儿染色体异常、白血
病，引起青少年记忆力和智力下降。因此寻找一种能替代甲醛并能有效杀灭细
菌新方法是十分必耍的。
发明内容
本发明提供一种可克服现有技术不足，用高压脉冲电场对魏氏梭菌灭活方 法及检验方法。
本发明的灭活方法是先将魏氏梭菌接种于培养液中进行扩菌培养，魏氏
梭菌的浓度为1.9 2.3xl(^个/ml后过滤得到菌液，取菌液200mL，在电场强度 为32 50KV/cm、脉冲频率为500Hz~2000 Hz、温度在30 55。C、进行高压脉冲 电场处理，收集处理完毕的菌液，得到灭活的菌液。实际上菌液浓度低于前述 值时对本发明的实现并无影响。
本发明的魏氏梭菌高压脉冲电场灭活优选方法是所用脉冲频率为1008Hz、 菌液的流速为10 50ml/min、电导率为330 680jam/cm、温度在42 5(TC，进行 高压脉冲电场处理，处理时间为6 8min，收集处理完毕的菌液，得到灭活的菌 液。
用本发明的方法进行灭活处理后可将经灭活的菌液接种于厌氧肝汤屮，培 养10天，显微镜检查无细菌的繁殖和单个菌落的生长；也可将经灭活的菌液接 种于新鲜血平皿培养24-72h，肉眼观察无单个菌落的生长及溶血环的产生。通 过前述检测可以确定火活的效果
脉冲电场灭活处理是一门新兴的生物物理技术，与其它现有的细菌灭活工 艺，如加热、超声、电磁场相比，该方法电场传递迅速，处理时间短，处理后 温度-般控制在5(TC以下，耗能低；与化学灭活相比，这种方法无其他化学试 剂的参与，具有简便、易操作、效率高、无污染等优点。近年来在基因工程、 生物医学工程等领域中已有初步的应用。但用这种方法处理魏氏梭菌尚末见报 道。
具体实施方式
1.菌种制备
1.1本发明的相关试验中采用标准魏氏梭菌菌种，即A型C57-l、B型C58-2、C型C59-1、 D型C60-2
1.2菌种鉴定
a) 将1.1中所述的菌种分别接种于斜面、普通肉汤和厌氧肝汤37'C培养 4 28h，应不在前面两种培养基上生长，而仅在第三种培养基中迅速生长；
b) 对厌氧肉肝汤中的培养物巾涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阳性大杆菌， 单个生长，菌端较平；
c) 新鲜血平皿厌氧培养18-24h，形成突起、半透明、灰色、表面光滑、边缘 整齐、l-3mm大的圆形菌落，菌落周围有溶血环。
根据上述的培养特性、显微镜检查、及血平皿的培养特点，培养的细菌为
魏氏梭菌。
2.抗原制造
2.1 1L营养肉汤配方
蛋白胨 10g
葡萄糖 10g
酵母粉 5g
氯化钠 5g K2HP04 lg
牛肉膏 3-5g
2.2 1L厌氧肝汤配方
营养肉汤(PH=7.4) 1L 肝块 100g 液体石蜡 500ML 2.3新鲜血平皿的制备 在100ML的营养肉汤中加入2g琼脂粉，121"C高压20min，待冷至45 50°C 时，以无菌操作加入无菌脱纤羊血或抗凝血IOML。立即轻轻震荡混匀，倒入事 先准备好的灭菌平皿，每个平皿倒入20ML，待凝固后4t:冰箱保存。
2.4接种培养基高压灭菌，待温度降到37"C以下，将各型菌按1: 4的 比例接到1L的厌氧肝汤中37。C孵箱培养，从接种计算，A、B、 C三型培养18h,D型菌培养20h结束培养，每瓶进行血平皿细菌计数，魏氏梭菌的浓度在 1.9xl06 2.3xl()7个/ml范围之内，实测菌液的电导率为330 680|im/cm。
3. 魏氏梭菌高压脉冲电场灭活
3.1魏氏梭菌灭活将细菌浓度为10、10"个/mL的菌液用双层纱布过滤后 去除肝块，并用移液器吸走上层的石蜡油。以200mL/次进行高压脉冲电场处理， 处理电场强度为32-50KV/cm，脉冲频率为1008Hz，流速为30mL/min的条件下， 循环14min收集齒液，处理后的温度保持在50°C以下。
4. 灭活效果检验
4.1收集的菌液进行灭活效果检查
取灭活后的菌液在试管厌氧肝汤接种后培养IO天后用显微镜进行检验，显 微镜放大倍率为IOOO倍，同时在新鲜血平皿接种后培养24-72h，用肉眼进行观 察无单个菌落及溶血环的产生。经检验釆用前述高压脉冲电场进行火活后的菌
液无细菌的繁殖和单个菌落的生长，证明本发明的灭活效果是可靠的。本发明 的这种方法不使用其它的化学药物，因此经本发明处理后的产物及处理人员接 触整个灭活处理过程中均不存在任何如现有技术的甲醛处理后所可能产生的负 作用。
权利要求
1、魏氏梭菌高压脉冲电场灭活方法，其特征是将魏氏梭菌接种于培养液中进行扩菌培养，魏氏梭菌的浓度为1.9×106～2.3×107个/ml后过滤得到菌液，取菌液200mL，在电场强度为32～50KV/cm、脉冲频率范围为500Hz～2000Hz、温度在30～55℃、进行高压脉冲电场处理，收集处理完毕的菌液，得到灭活的菌液。
2、 根据权利要求l所述的魏氏梭菌高压脉冲电场灭活方法，其特征是所用 脉冲频率为1008Hz、菌液的流速为10~50ml/min、电导率为330~680|am/cm、温 度为42 5(TC，进行高压脉冲电场处理，处理时间为6 8min，收集处理完毕的 菌液，得到灭活的菌液。
3、 根据权利1和2的所述方法灭活处理后的检验方法，其特征是将经灭活 的菌液接种于厌氧肝汤中，培养10天，用显微镜检查无魏氏梭菌的生长繁殖。
4、 根据权利1和2的所述方法灭活处理后的检验方法，其特征是将经灭活 的菌液接种于新鲜血平皿培养24-72h，肉眼观察无单个菌落的生长及溶血环的 产生。
全文摘要
本发明涉及一种对魏氏梭菌灭活方法及检验方法。本发明的灭活方法是用电场强度为32～50KV/cm、脉冲频率为500Hz～2000Hz的脉冲电场对菌液进行处理，处理的温度在30～55℃，收集处理完毕的菌液，得到灭活的菌液。本发明的检测方法是将灭活后的菌液接种于厌氧肝汤或新鲜血平皿中进行培养，再进行镜检。经本发明处理后的产物及处理人员接触整个的灭活处理过程中不存在任何如现有技术的甲醛处理后所可能产生的副作用。
文档编号C12N13/00GK101481684SQ20091000570
公开日2009年7月15日 申请日期2009年1月24日 优先权日2009年1月24日
发明者周继章, 宫晓炜, 曹小安, 蔺国珍, 邱昌庆, 郑福英 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所