专利名称：葡萄糖氧化酶生产方法
技术领域：
本发明涉及一种葡萄糖氧化酶生产方法。
背景技术：
作为重要的食品保鲜食品添加剂，目前未见完整的葡萄糖氧化酶生产工 艺报道，大多数文献资料报道仅仅是生产工艺的一个某一环节，相互之间链 接性差，可操作性不强之特点。本专利工艺较为系统报道了葡萄糖氧化酶制 剂生产方法，具有发酵生产周期短，生产设备要求简单，可操作性强之特点， 所制备得到的葡萄糖氧化酶具有性能稳定，催化速度快，作用于底物高度专 一等特点。
发明内容
本发明的目的是提供一种葡萄糖氧化酶生产方法，工艺简单、易操作、 酶活高、收率高、生产成本低。
为达到上述目的，本发明所提供的技术方案是 一种葡萄糖氧化酶生产 方法，包括以下步骤
(l)葡萄糖氧化酶粗酶液的获得
① 高含量的葡萄糖氧化酶发酵液获取 挑取长满可产葡萄糖氧化酶点的青霉菌菌苔，在一级培养基中30
32"C振荡培养24h;
然后以2 3%接种量接种于二级培养基中，30 32"振荡培养24h;
最后以2 3%接种量接种于内有三级培养基的发酵罐中，控制溶氧 为60%以上，pH保持在6.0 7.0之间，发酵36 48h即可得到酶活为7.0 U 以上的葡萄糖氧化酶发酵液；
② 发酵液离心浓縮处理
对发酵液进行离心处理，8000rpm， 20min，收取上清液，微滤去除 残留的微小颗粒及菌体，超滤浓縮，直至酶活达到20U以上的葡萄糖氧化酶
3发酵液；
(2) 葡萄糖氧化酶的提纯及脱盐
4。C条件下，向超滤浓縮酶液体中缓缓加入硫酸铵固体颗粒，直至形成
90%硫酸铵溶液，盐析4 6h， 12000r/min离心得沉淀，用pH 7.0的Tris-HCl
缓冲溶液收取沉淀蛋白，加去离子水稀释8 10倍，超滤脱盐浓縮处理；
(3) 形成葡萄糖氧化酶冻干成品
加入保护剂于-2(TC条件下冷冻真空干燥48小时，即得到葡萄糖氧化酶 冻干品。
所述步骤①中的一级培养基、二级培养基和三级培养基的成分为葡萄 糖80g/L、蛋白胨5g/L、硝酸钠3g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁0.5g/L、 氯化钙2g/L。
本发明具有的优点本发明生产葡萄糖氧化酶具有工艺简单、易操作、 酶活高、收率高、生产成本低之特点，获取制备得到的葡萄糖氧化酶可广泛 运用于食品添加剂工业中。
1、 本发明较为系统的公布了葡萄糖氧化酶冻干品的生产工艺流程，制备 得到的葡萄氧化酶具有收率高，酶活高的特点。
2、 本工艺流程操作简单，操作性强，适合大规模生产，所制备得到的葡 萄糖氧化酶为黄白，杂质少，不存有任何的有害的化学药品，可广泛运用于 食品添加剂量工业。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以助于理解本发明的内容。 实施例
(1)、葡萄糖氧化酶粗酶液的获得 ①高含量的葡萄糖氧化酶发酵液获取
a、 挑取长满可产葡萄糖氧化酶点青霉菌菌苔于30ml的灭菌培养基(葡萄 糖80g/L、蛋白胨5g/L、硝酸钠3g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁0.5g/L、氯 化钙2g/L)中(250ml规格三角瓶)，30 32。C振荡培养24h;
b、 然后以2 3%接种量接种于乘有150ml (250ml规格三角瓶)灭菌培养基中(葡萄糖80g/L、蛋白胨5g/L、硝酸钠3g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁 0.5g/L、氯化钙2g/L)， 30 32t:振荡培养24h;
c、再以2 37。接种量接种于灭菌好培养基(葡萄糖80g/L、蛋白胨5g/L、 硝酸钠3g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钙2g/L)发酵罐中，通 过转数及通气量控制溶氧为60%以上，通过氢氧化钠溶液使发酵罐内pH保 持在6.0 7.0之间，经36 48h发酵即可得到含有酶活为7.0U (酶活定义 每分钟催化氧化lpmol葡萄糖的酶量的定义为一个酶活力单位)以上葡萄糖 氧化酶发酵液。
②发酵液离心浓縮处理
离心制备得到发酵液(离心条件8000rpm， 20min)，去除菌丝体收取上 清液，过微滤膜去除残留的微小颗粒及菌体，过超滤膜进行浓縮处理直至酶 活达到20U以上。
(2) 、葡萄糖氧化酶的进步提纯及脱盐
fC条件下，超滤浓縮酶液体中缓缓加入硫酸铵直至形成90%硫酸铵溶 液，盐析4 6h， 12000 r/min离心得沉淀，用定量的Tris-HCl( pH 7.0)缓冲 溶解收取沉淀蛋白，加去离子水稀释，经由一定量的中空纤维超滤柱膜脱盐 浓縮处理。
(3) 、葡萄糖氧化酶冻干成品形成
收集得到脱盐浓縮葡萄糖氧化酶酶液，加入保护剂于-2(TC条件下冷冻真 空干燥48小时，即得到葡萄糖氧化酶冻干品。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限 制，虽然本发明己以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何 熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭 示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离 本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简 单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
权利要求
1、一种葡萄糖氧化酶生产方法，包括以下步骤(1)葡萄糖氧化酶粗酶液的获得①高含量的葡萄糖氧化酶发酵液获取挑取长满可产葡萄糖氧化酶点的青霉菌菌苔，在一级培养基中30～32℃振荡培养24h；然后以2～3％接种量接种于二级培养基中，30～32℃振荡培养24h；最后以2～3％接种量接种于内有三级培养基的发酵罐中，控制溶氧为60％以上，pH保持在6.0～7.0之间，发酵36～48h即可得到酶活为7.0U以上的葡萄糖氧化酶发酵液；②发酵液离心浓缩处理对发酵液进行离心处理，8000rpm，20min，收取上清液，微滤去除残留的微小颗粒及菌体，超滤浓缩，直至酶活达到20U以上的葡萄糖氧化酶发酵液；(2)葡萄糖氧化酶的提纯及脱盐4℃条件下，向超滤浓缩酶液体中缓缓加入硫酸铵固体颗粒，直至形成90％硫酸铵溶液，盐析4～6h，12000r/min离心得沉淀，用pH7.0的Tris-HCl缓冲溶液收取沉淀蛋白，加去离子水稀释8～10倍，超滤脱盐浓缩处理；(3)形成葡萄糖氧化酶冻干成品加入保护剂于-20℃条件下冷冻真空干燥48小时，即得到葡萄糖氧化酶冻干品。
2、 根据权利要求1所述的葡萄糖氧化酶生产方法，其特征在于所述步骤①中的一级培养基、二级培养基和三级培养基的成分为葡萄糖80g/L、蛋白胨5g/L、硝酸钠3g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钙2g/L。
全文摘要
本发明公开了一种葡萄糖氧化酶生产方法，包括以下步骤(1)葡萄糖氧化酶粗酶液的获得①高含量的葡萄糖氧化酶发酵液获取，和②发酵液离心浓缩处理；(2)葡萄糖氧化酶的提纯及脱盐；以及(3)形成葡萄糖氧化酶冻干成品。本发明生产葡萄糖氧化酶具有工艺简单、易操作、酶活高、收率高、生产成本低之特点，获取制备得到的葡萄糖氧化酶可广泛运用于食品添加剂工业中。
文档编号C12N9/04GK101481680SQ20091000512
公开日2009年7月15日 申请日期2009年1月19日 优先权日2009年1月19日
发明者乔彦良, 崔增学, 李国保 申请人:崔增学