临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种过氧化物酶的测定试剂盒，特别是涉及一种用于定量检测髓过氧 化物酶的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 当前临床上对急性冠脉综合征的诊断与评估主要应用心肌酶谱等指标。此类指标 的水平通常会在心肌发生实质损伤后发生明显升高，因此，该类指标不能对心血管疾病的 发生提供早期预警。髓过氧化物酶是由人中性粒细胞、单核细胞产生的一种有酶活性的血 色素蛋白，其分子量约为118kDa，由一对重链和轻链组成。通常合成后存于中性粒细胞的嗜 天青颗粒中，但在炎症条件下可释放入血，可将氯化物和过氧化氢催化成次氯酸盐，参与杀 菌效应。但髓过氧化物酶能氧化低密度脂蛋白胆固醇，促进巨噬细胞向泡沫细胞转化；该蛋 白也可激活金属蛋白酶（MMPs)，并促进粥样硬化斑表面失稳定、甚至破裂；可降低NO的含 量及生物利用度，影响其对血管扩张和抗炎功能的效应。近年来的研究表明，髓过氧化物酶 参与了心脏冠脉疾病的发生、发展过程，是急性冠脉综合征发生的重要原因，其活性的水平 在一定程度反应了冠脉疾病的活化程度。目前，国内各临床实验室已认识到髓过氧化物酶 检测在急性冠脉综合征诊断中的重要价值，并开始尝试对其开展检测，并用于急性冠脉综 合征等炎症疾病的诊断。
[0003] 当前对于髓过氧化物酶的检测主要有二种方法，一种是酶活性检测方法，即利用 髓过氧化物酶的过氧化物酶活性进行检测；另一种是利用髓过氧化物酶的抗原性建立的酶 联免疫检测法。第一种方法的主要特点是可检测髓过氧化物酶的活性，但方法灵敏度差、且 多为定性检测。而酶联免疫检测法快速且可定量分析，但常规方法中用辣根过氧化物酶标 记的抗体直接检测，并采用髓过氧化物酶作为标准品，因此，其检测灵敏度低；易受髓过氧 化物酶本身过氧化物酶的干扰，特异性差；同时，标准品稳定性差。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种高灵敏、高特异、重复性好、易操作的临床用 髓过氧化物酶检测试剂盒。
[0005] 本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，包括抗髓过氧化物酶抗体预包的酶 标板、生物素化抗髓过氧化物酶抗体、亲和素化碱性磷酸酶、碱性磷酸酶底物液、髓过氧化 物酶标准品、髓过氧化物酶质控品、样本稀释液和酶反应终止液；
[0006] 其中，所述髓过氧化物酶标准品和髓过氧化物酶质控品均为重组的髓过氧化物酶 肽抗原；所述髓过氧化物酶质控品用于校准、拟合标准曲线。
[0007] 进一步，本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，所述抗髓过氧化物酶抗体 预包的酶标板按以下步骤制备：
[0008] 将稀释的羊抗人髓过氧化物酶多抗加入96孔聚苯乙烯酶标板中，孵育8-12小时； 将抗体吸出后，用洗涤缓冲液洗加样孔三遍；加入封闭液静置4小时；弃去孔中液体，冷风 机吹干后，真空包装，置4°C保存；
[0009] 所述稀释的羊抗人髓过氧化物酶多抗，浓度为10yg/mL;
[0010] 所述洗涤缓冲液为加〇? 08 %吐温-20的0?ImM磷酸缓冲液，pH为7. 4 ;
[0011] 所述封闭液为含5%牛白蛋白和5%人白蛋白的pH7. 4的0.ImM磷酸缓冲液，以上 所述百分数均为质量百分数。
[0012] 更进一步，本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，所述羊抗人髓过氧化物 酶多抗为髓过氧化物酶全蛋白免疫羊后，纯化、制备的多抗。
[0013] 进一步，本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，所述生物素化抗髓过氧化 物酶抗体按以下步骤制备：
[0014] 将兔抗人髓过氧化物酶多抗采用N-羟基丁二酰亚胺（生物素）进行偶联标记；用 磷酸缓冲液透析去除游离生物素后，即制得生物素化抗髓过氧化物酶抗体；
[0015] 将制得的生物素化抗髓过氧化物酶抗体用含20%甘油、10%牛白蛋白、0. 5%海藻 酸钠和0. 05 %叠氮钠的0.IM磷酸缓冲液按I:20-200稀释，-20 °C保存；
[0016] 所述磷酸缓冲液pH为7. 4,以上百分数均为质量百分数。
[0017] 进一步，本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，所述亲和素化碱性磷酸酶 按以下步骤制备：
[0018] 将碱性磷酸酶用链霉亲和素采用戊二醛法进行标记；透析去除游离链霉亲和素 后，即制得亲和素化碱性磷酸酶；
[0019] 将制得的亲和素化碱性磷酸酶用含20%甘油、10%牛白蛋白、0. 5%海藻酸钠和 0. 05%叠氮钠的0.ImM磷酸缓冲液按1:20-200稀释，-20°C保存；
[0020] 所述磷酸缓冲液pH为7. 4,以上所述百分数均为质量百分数。
[0021] 进一步，本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，所述碱性磷酸酶底物液按 以下步骤制备：将PNPP以IOmM的浓度溶于含ImM1%(：12的0.IM二乙醇胺缓冲液（pH9. 8) 中，即制得碱性磷酸酶底物液。
[0022] 进一步，本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，所述样本稀释液为含0. 5% 牛白蛋白的〇.ImM磷酸缓冲液，pH为7. 4。
[0023] 进一步，本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，所述酶反应终止液为3N的 NaOH0
[0024] 进一步，本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，所述髓过氧化物酶标准品 的浓度分别为 30ng/mL、15ng/mL、7. 5ng/mL、3. 75ng/mL、l. 87ng/mL。
[0025] 进一步，本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，所述生物素化抗髓过氧化 物酶抗体和亲和素化碱性磷酸酶应用的稀释比均为1:2000,稀释液均为含20%甘油、10% 牛白蛋白、〇. 5 %海藻酸钠和0. 05 %叠氮钠的0.ImM磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液pH为 7. 4,以上所述百分数均为质量百分数。
[0026] 本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒与现有技术不同之处在于：
[0027] 1、本发明的临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒中采用碱性磷酸酶作为标记物， 替代常规方法中的辣根过氧化物酶，避免了髓过氧化物酶本身的干扰，提高了检测的特异 性；本发明在检测体系中采用生物素-亲和素增敏系统整合，提高了检测灵敏度；同时，标 准品采用重组髓过氧化物酶肽，由于重组髓过氧化物酶肽表位比较单一，结合特异性更好， 因此提高了标准品检测的重复性和定量检测的稳定性，降低了成本。
[0028] 2、经实验验证本发明试剂盒的检测区间为0. 233-30ng/ml;无论是高浓度样本， 还是低浓度样本，其批内CV值均小于7%，方法学精密度良好；试剂盒的回收效率平均为 101. 39%，说明准确度良好。
[0029] 下面结合附图和实施例对本发明的临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒作进一 步说明。
【附图说明】
[0030] 图1为本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒的技术原理图；
[0031] 图2为本发明实施例2中采用不同包被抗体浓度的检测结果曲线图；
[0032] 图3为本发明实施例3中采用不同检测抗体浓度的检测结果曲线图；
[0033] 图4为本发明实施例4中采用不同碱性磷酸酶浓度的检测结果曲线图；
[0034] 图5为本发明实施例5中采用不同抗原和标准品的孵育时间的检测结果曲线图；
[0035] 图6为本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒对髓过氧化物酶的检测区间 图。
【具体实施方式】
[0036] 实施例1
[0037] 本实施例的临床用定量检测髓过氧