本发明属于生物基因工程技术领域，涉及到黄野螟过氧化氢酶基因全序列及其克隆方法。该基因编码过氧化氢酶，该酶(cat)是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的抗氧化酶，是生物建立防御系统的关键酶之一，其生物学功能是催化细胞内过氧化氢的分解，具有重要的生物化学研究价值。
技术背景
过氧化氢酶(catalase，cat)与超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，sod)和过氧化物酶(peroxidase，pod)共同组成生物体抗氧化酶体系，清除细胞内的自由基。其中过氧化氢酶，又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶。它可促使h2o2分解为分子氧和水，清除生物体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受h2o2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。cat作用于过氧化氢的机理实质上是h2o2的歧化，必须有两个h2o2先后与cat相遇且碰撞在活性中心上，才能发生反应。h2o2浓度越高，分解速度越快。对该基因的研究为可以作为靶标设计新型氧化酶抑制剂提供了基础。
黄野螟(heortiavitessoides)属鳞翅目(lepidoptera)，螟蛾科(pyralidae)，在我国广泛分布于广东、广西、海南和云南等南方各省以及香港特别行政区。黄野螟是典型的寡食性害虫，仅取食沉香属(aquilaria)和漆树属(rhus)等少数几种植物近年来，随着海南、广东和云南等地人工大规模种植白木香面积的日益扩大，黄野螟的危害也越来越严重。据广东化州地区统计，黄野螟发生严重时，白木香的被害株率可高达90％以上。有关黄野螟过氧化氢酶基因目前无人研究，本发明填补了这一空白，对深入研究黄野螟体内保护酶系活性与杀虫剂、昆虫病毒、微孢子虫等外界刺激强度相互作用关系以及昆虫耐药性和抗逆性提供基础。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供黄野螟过氧化氢酶基因全序列及其克隆方法。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
1、黄野螟总rna的提取
将外地采集的黄野螟活成虫经清洗、消毒、麻醉、液氮冷冻后保存在无菌去酶的ep管中，并置于-70℃低温冰箱内保存备用。采用e.z.n.a.tmtotalrnakitii总rna提取试剂盒(omega)来提取黄野螟的总rna。
2、引物设计和3′race扩增
在本实验室构建的cdna文库中，查找并获得了黄野螟过氧化氢酶基因的5′端序列，本发明是在此基础之上进行3′race扩增，目的在于获得黄野螟过氧化氢酶基因全序列。
3′race扩增的特异性引物为：
hv-cat-3′-outer：aaaaacgggagcaccagt；
hv-cat-3′-inner：cgctgatgccaagaaacg。
3、目的基因克隆及测序
获得的pcr产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，回收相应目的dna片段，同pmd20-t载体进行连接，将连接后的产物转化到e.colidh5α感受态细胞之中，然后进行amp抗性蓝白斑的筛选，挑取合适的阳性菌落进行质粒提取。最后经由菌落pcr鉴定后进行测序。
4、序列拼接
将测序正确的序列与实验室已构建的黄野螟cdna文库中的过氧化氢酶基因序列进行不重复拼接，从而获得黄野螟过氧化氢酶基因全长序列。
黄野螟过氧化氢酶基因全长序列，此序列如下：
此序列中划线处标示的atg为初始密码子，划线处标示的taa为终止密码子。
根据黄野螟过氧化氢酶酶基因orf(openreadingframe)全序列，得到其氨基酸序列。该序列如下：
本发明获得了黄野螟过氧化氢酶基因全序列，通过对黄野螟成虫的预处理、总rna的提取、3′race扩增、目的基因片段的克隆及其序列的拼接，得到了黄野螟过氧化氢基因全长序列，该序列全长2039bp，orf序列全长1524bp，共编码507个氨基酸。
具体实施方式
以下实施例将本发明进一步说明。
1、黄野螟总rna提取
黄野螟成虫采自广州市华南农业大学启林区土沉香林。经清洗、消毒、麻醉、液氮冷冻后保存在无菌去酶的ep管中，并置于-80℃低温冰箱内保存备用。
采用trizol试剂盒进行黄野螟总rna的提取，具体步骤如下：
1)将冷冻于-80℃的黄野螟幼虫样品取出，按uniq-10柱式trizol总rna抽提kit提供的方法提取样品的总rna。
2)在液氮预冷的研钵中充分研磨样品至粉末。在液氮挥发尽时迅速转移样品粉末置于液氮中冷却好的1.5ml离心管中。
3)按照每15-25mg样品加入0.5mltrizol的比例在上述离心管中加入相应体积的trizol溶液，用涡旋混合器振荡处理，使样品充分裂解在trizol溶液中。
4)将裂解后的样品于室温下放置10min，使得核蛋白与核酸完全分离。12000rpm离心10min，取上清液。
5)加入0.1ml氯仿，上下剧烈震荡30sec，室温放置3min。12000rpm，4℃离心10min。离心后样品分三层：上层水相，中间层和下层有机相。小心吸取上层水相转移至干净的离心管中，加1/2倍体积的无水乙醇，混匀。切勿吸取任何中间层，否则会出现染色体dna污染。
6)将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加至吸附柱中，静置2min，12000rpm离心3min，倒掉收集管中的废液。
7)将吸附柱放回收集管中，加入500μlrpesolution，静置2min，10000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液。
8)再次将吸附柱放入收集管中，加入500μlrpesolution，静置2min，10000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液。
9)将吸附柱放入收集管中，10000rpm离心2min。
10)将吸附柱打开盖子于室温放置2min，以彻底晾干吸附材料中残留的乙醇，因为乙醇的残留会影响实验结果。但不要让rna过于干燥，否则会影响洗脱效率。
11)将吸附柱放入干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央悬空滴加40μldepc-treatedddh2o，静置5min，12000rpm离心2min，将所得到的rna溶液置于-80℃温冰箱内保存。
注意事项：上述rna实验所涉及的试剂，须进行干热灭菌(180℃，60min)处理，涉及到的一次性塑料容器、无菌水须进行高温高压灭菌处理。有关rna实验使用所涉及到的试剂盒及无菌水都应该专用，须避免混用之后所引起的交叉污染。
2、cdna3′末端扩增
参照3′fullracecoresetver.2.0kit试剂盒进行，具体操作步骤如下：
1)反转录反应
反应体系如下：
pcr反应程序条件：42℃下反应60min，70℃下反应15min。
2)巢式pcr扩增
a)outerpcr扩增
反应体系如下：
pcr反应程序条件：94℃下预变性4min，94℃下变性30s，55℃下退火30s，72℃下延伸1min，设置20个循环，然后72℃下延伸10min。
b)innerpcr扩增
反应体系如下：
pcr反应程序条件：94℃下预变性4min，94℃下变性30s，55℃下退火30s，72℃下延伸1min，设置30个循环，然后72℃延伸10min。获得的pcr产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳实验检测其扩增的效果。
3、目的基因克隆及测序
1)从琼脂糖凝胶中回收dna片段，按通用型dna纯化回收试剂盒的方法进行回收：
a)柱平衡步骤：先将吸附柱cb2轻轻放入收集管中，往吸附柱cb2上方中加入平衡液bl500μl，在室温条件下，12000rpm(～13.400×g)离心1min，然后弃掉收集管里的废液，将吸附柱重新放回到收集管中。
b)将琼脂糖凝胶上的目的dna单一条带切下(尽可能地切掉多余的部分)，放入到事先已称好重量的干净离心管中，并再次称取其重量。
c)向上述放有胶块的离心管中加入与胶块等倍体积的溶液pc(如果胶块重量为100mg，其等倍体积可看作是100μl，那么需要加入pc溶液的体积是100μl)，55℃金属浴放置15min左右，在这期间须不间断地上下缓慢翻转离心管，直到离心管里的胶块完全溶解。
d)将上述所得溶液缓慢加入到吸附柱cb2中(吸附柱预先放进收集管中)，在室温条件下，12000r/min离心1min，然后弃掉收集管里的废液，将吸附柱再次缓慢放回到收集管中。
e)往吸附柱cb2里加入漂洗液pw(已加无水乙醇)600μl，静置5min后进行离心。在室温条件下，12000r/min离心1min，然后弃掉收集管里的废液，将吸附柱cb2再次缓慢放回到收集管中。
f)往吸附柱cb2里再次加入漂洗液pw(已加无水乙醇)600μl，在室温条件下，12000r/min离心1min，然后弃掉收集管里的废液。
g)将吸附柱cb2再次放回到收集管里，在室温条件下，12000r/min离心2min，尽可能地去掉漂洗液。然后将吸附柱放置在室温条件5分钟左右，直至彻底晾干。
h)将吸附柱cb2再一次放回到收集管里，往其吸附膜的中间处悬空滴入适量的洗脱缓冲溶液eb，置于室温3min，12000r/min离心2min，所得溶液即为dna溶液。
i)将上述dna产物放于-20℃冰箱保存备用。
2)t载体连接
往pcr管中依次加入：pmd20-t载体1.0μl，前述目标dna产物3.0μl，去离子水1.0μl，solutioni溶液5.0μl，整个反应体系体积为10.0μl。在4℃冰箱中放置过夜。
3)转化感受态细胞
a)取感受态细胞于冰水浴中融化，并分管为每管50μl。
b)每管加入4.5μl的连接产物，轻弹混均。置于冰水30min。
c)离心管置于42℃水浴里，热激90s。
d)快速将离心管转移到冰水浴中，冷却细胞5min(此过程不要摇动离心管)。
e)吸取900μl无菌lb培养基(不含抗生素)加入到离心管中，混匀。
f)在37℃条件下，150r/min摇床振荡培养45min。
g)将离心管里的内容物充分混匀，吸取100μl已转化感受态细胞加到已配制好的平板培养基上，用弯头玻璃棒(无菌)缓慢地将细胞均匀涂抹开来，放于室温直至培养基表面直至液体被完全吸收后，将培养基倒置，在37℃条件下，培养箱中培养12-15h。
4)阳性重组子的鉴定及测序
a)在每个1.5ml的离心管中分别加入含氨苄的培养液600μl，每个平板都挑选出7个白色菌落与一个蓝色菌落分别放入培养液中，37℃下，250r/min振荡培养4h。取其菌液作为进行菌落pcr鉴定的模板。
b)菌落pcr
反应体系如下：
反应程序条件为：94℃下3min；94℃下30s；55℃下30s，设置30个循环；72℃下1min；72℃下10min。反应结束后吸取5μl的反应产物，并经琼脂糖凝胶电泳实验进行检测。
c)将可能含有正确阳性重组子的克隆菌液送到生工生物公司进行测序。
4、将测序正确的序列与实验室已构建的黄野螟cdna文库中的超氧化物歧化酶基因5′端序列进行不重复拼接，去掉相互重叠的部分，从而获得了黄野螟超氧化物歧化酶基因全长序列。