人工合成的StreptomyceshirsutusATCC19091蛋白编码基因及其应用的制作方法

文档序号:12030101阅读:164来源:国知局
人工合成的Streptomyces hirsutus ATCC 19091蛋白编码基因及其应用的制作方法与工艺
本发明涉及人工合成的streptomyceshirsutusatcc19091蛋白编码基因及其应用,特别是涉及一种根据大肠杆菌偏好密码子设计并合成的streptomyceshirsutusatcc19091蛋白编码基因及其应用,属于基因工程领域。
背景技术
:我们发现来源于streptomyceshirsutusatcc19091的氨基酸序列为序列表中序列2所示的streptomyceshirsutusatcc19091蛋白可以作为一种催化剂用于l-2-哌啶甲酸的合成。将编码其的基因序列克隆到某一菌体中,从而通过这一重组菌体以全细胞催化剂的形式来实现其催化效果。但是用于其编码的如序列表中序列1所示的野生型基因序列无法满足上述需求。因此,为了更好地实现这一蛋白的催化效果,我们就需要提供一种方式,使其可以在某一菌体中高效表达。技术实现要素:首先我们选择大肠杆菌作为用于高效表达streptomyceshirsutusatcc19091蛋白的菌体。并通过全基因合成的方法,对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整,采用大肠杆菌偏好性密码子对其进行优化,并且调整dna序列的gc含量到40%~60%,从而实现大肠杆菌中的高效表达。具体来说我们利用primerpremier(http://primer3.ut.ee/)和optimizer(http://genomes.urv.es/optimizer/)进行设计,并保证tm差异控制在3℃以内,引物长度控制在50base以内。按照设计好的引物合成,得到目标引物后,将获得的引物加双蒸水溶解后,加到如下的反应体系中,使得各引物的终浓度为30nm,首尾引物的终浓度为0.6μm。2mmdntpmix(2mmeachdntp)5μl10×pfubuffer5μlpfudnapolymerase(10u/μl)0.5μlddh2o使得反应体系总体积至50μl将配制好的pcr反应体系置于博日xpcycler基因扩增仪中,按下列程序进行扩增:98℃30s,65℃45s,72℃120s,35x。将pcr得到的dna片段进行切胶纯化,利用同源重组的方法克隆进pet30a的ndei/xhoi位点。利用这一方法,我们获得了如序列表中序列3所示的dna序列。其引物序列为:同时,含有所述dna分子的重组载体、大肠杆菌均属于本发明的保护范围。其中重组载体既可以是克隆载体,也可以是表达载体。本发明中还要求保护含有所述dna分子的大肠杆菌作为全细胞催化剂的用途。特别是作为l-赖氨酸盐酸盐生物转化制备l-2-哌啶甲酸这一反应的全细胞催化剂。采用含有所述dna分子的大肠杆菌后,形成了一高效率的生物催化体系。可以提高底物l-赖氨酸盐酸盐投量,缩短反应时间,获得高ee值的目标产物。附图说明图1为seqidno.3的表达质粒图谱图2为含有seqidno.3表达质粒的大肠杆菌的sds-page图谱。图3为生物转化反应的tlc图谱图4为l-2-哌啶甲酸的hplc谱图图5为l-2-哌啶甲酸的ms谱图具体实施方式为了更好的解释本发明,下面结合实施例对本发明进行进一步的阐述。在本实施例中所用到的仪器、试剂,除非有特殊说明,均为市售产品。以下实施例中涉及到的tlc检测中:展开剂:三氯甲烷:甲醇:水=6:5:1,混匀后放置10min左右。硅胶板规格:薄层层析硅胶板5*10。显色剂:茚三酮显色100ml乙醇加入0.1g茚三酮,500ul冰乙酸混匀。以下实例中涉及到的lc-ms检测条件为:prevailc18色谱柱(250×4.6mm,i.d.5μm);柱温:30℃;流动相:0.4%(v/v)三氟乙酸水溶液;流速:0.5ml/min;检测器:蒸发光散射检测器(elsd);检测器温度:120℃;载气:氮气(纯度99.9%);载气流速:4l/min;进样体积:10μl。实施例1将streptomyceshirsutusatcc19091置于atccmedium196培养基中培养,控制温度为26.0℃,180rpm培养2天,离心收集沉淀,用dna提取纯化试剂盒qiaampkit(qiagen,germany)提取纯化streptomyceshirsutusatcc19091基因组dna。用pfu高保真酶对streptomyceshirsutusatcc19091基因组dna进行pcr扩增,所用引物为shi-f5'atcttgcaagctgagcgcacg3'shi-r5'tcatcgtcgcgctccggc3'由于streptomyceshirsutusatcc19091的dna局部gc含量接近80%,故在扩增时添加终浓度0.5m的甜菜碱。之后将扩增的片段用taq聚合酶72℃处理10分钟,在dna3'端添加碱基a。之后将其连接到pmd19t-simple(takara宝生物公司,北京)克隆载体中,挑取单克隆送至上海杰李生物进行测序。测序得到dna序列为seqidno.1,相应的氨基酸序列为seqidno.2实施例2通过全基因合成的方法,对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整,并且调整dna序列的gc含量到40%~60%,以实现在大肠杆菌中的高表达。利用primerpremier(http://primer3.ut.ee/)和optimizer(http://genomes.urv.es/optimizer/)进行设计,并保证tm差异控制在3℃以内,引物长度控制在50base以内,得到以下引物:合成上述引物,并将获得的引物加双蒸水溶解后,加到如下的反应体系中,使得各引物的终浓度为30nm,首尾引物的终浓度为0.6μm。2mmdntpmix(2mmeachdntp)5μl10×pfubuffer5μlpfudnapolymerase(10u/μl)0.5μlddh2o使得反应体系总体积至50μl将配制好的pcr反应体系置于博日xpcycler基因扩增仪中,按下列程序进行扩增:98℃30s,65℃45s,72℃120s,35x。将pcr得到的dna片段进行切胶纯化,利用同源重组的方法克隆进pet30a的ndei/xhoi位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的dna序列为seqidno.3。实施例3挑取含有seqidno.3表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中:胰蛋白胨10g/l,酵母提取物5g/l,磷酸氢二钠3.55g/l,磷酸二氢钾3.4g/l,氯化铵2.68g/l,硫酸钠0.71g/l,七水硫酸镁0.493g/l,六水氯化铁0.027g/l,甘油5g/l,葡萄糖0.8g/l,添加卡那霉素至50mg/l。30℃,250rpm过夜培养。次日取1l三角瓶,按1:100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中:胰蛋白胨10g/l,酵母提取物5g/l,磷酸氢二钠3.55g/l,磷酸二氢钾3.4g/l,氯化铵2.68g/l,硫酸钠0.71g/l,七水硫酸镁0.493g/l,六水氯化铁0.027g/l,甘油5g/l,葡萄糖0.3g/l,添加卡那霉素至50mg/l。于30℃中培养至菌体od5-6,立刻将三角瓶置于25℃摇床中,250rpm培养1小时。加iptg至终浓度0.1mm,并于25℃,250rpm继续培养16小时。培养结束后,将培养液于4℃,12000g下离心20分钟收集湿菌体。然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次,收集菌体,-70℃保存。同时取少量菌体进行sds-page检测。结果见图2,其中1道为蛋白上清,2道为包涵体。sds-page蛋白胶显示,含有seqidno.3表达质粒的大肠杆菌表达量高,满足生物转化反应实验的需要。实施例4加入0.1m磷酸钾缓冲液(ph8.0),50g/l含有seqidno.3表达质粒的菌体,55g/ll-赖氨酸盐酸盐,0.1mmnad,敞口反应,25℃,摇床转速设为180rpm。反应中不断取样进行tlc检测,当反应16小时时,检测结果如图3,结果显示16小时生成大量产物,无底物残余。对获得的产物进行定量实验,产物最终浓度为32g/l。同时取样进行lc-ms检测,检测结果如图4,图5所示。当我们在体系中加入l-赖氨酸的时候,其快速转变为l-赖氨酸盐酸盐,然后按照前述实施例的方式进行反应。sequencelisting<110>南京诺云生物科技有限公司<120>人工合成的streptomyceshirsutusatcc19091蛋白编码基因及其应用<130>2016<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>1095<212>dna<213>streptomyceshirsutus<400>1atgatcttgcaagctgagcgcacgcacatcgtcgacgccgaagccgtcgccaccatcgtc60acgaaggtgggactggggcaactctacgacctgaccatcgcccgcatggaggcggctctc120accggtggacccggtgcgccggtggagatgaagcagcgggacggtttcctgctggagaca180ccgcagttgggcctgctcgagtggatgccggcggtccgccaaggcaccacggtctccatc240aagatggtcgcctacaacccgcacaatccggtcaagaaccagctgcccaccatcctgtcg300acactgtgcgccttcgacacggacagcggccaccttcgtgccgtcgtcgacggcacgttc360gccaccgccgtccgtacgggcgcggcgtccgcactggccagccgggtgctcgctcgcccg420gactccgccgtgctcggcctggtgggctgcggtgcccaggcggtcacgcagttgcacgcc480ctggcacgcgtcttctcgttctccgaggtgctcgtccacgacaaggacgcgcgggcggag540cgatccttcgcggcgagggcccggatgcccgaggggctggtgcgcgtcgcgccgctcgcg600gaggtggaggagcgggccgacgtgctgtgcaccgccacctcggtcggcccccacgagggg660ccggtcatccggggcacgtcactcaagccctgggtgcacgtcaacaccatcggatcggac720atgccgggcaagacggagctgccgctggaccttctgcgcgcggcggtcgtctgcccggac780cacgtggagcaggcacgggccgagggtgactgccagcagctcgcccccgaggagatcggg840gctccgctccccgacctgctgcgtgatccggacgcgcaccgcaggctgtcgccggtcacc900accgtgtacgactcgacaggtctcgcgctgcaggatctcgtcatggtggaggtgctggag960gagttggcgcgggacctcgacgtcggacaccacgtcttcatcgaggcgacggccgacgac1020ccgcaggacccgtactcgttcctccctgcggaggtcacccggtccctggccggcacggcc1080ggagcgcgacgatga1095<210>2<211>364<212>prt<213>streptomyceshirsutus<400>2metileleuglnalagluargthrhisilevalaspalaglualaval151015alathrilevalthrlysvalglyleuglyglnleutyraspleuthr202530ilealaargmetglualaalaleuthrglyglyproglyalaproval354045glumetlysglnargaspglypheleuleugluthrproglnleugly505560leuleuglutrpmetproalavalargglnglythrthrvalserile65707580lysmetvalalatyrasnprohisasnprovallysasnglnleupro859095thrileleuser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