核盘菌凝集素SSL‑6蛋白及其编码基因与应用的制作方法

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种核盘菌凝集素SSL-6蛋白及其编码基因与在抗油菜菌核病方面的应用。

背景技术：

油菜是重要的经济作物。来自油菜的菜籽油是人类最主要的食用油来源之一，是我国粮油安全保障的重要一环，为我国重要的战略物质之一。目前，我国的食用油将近60％依赖进口。制约我国油菜产量与品质提高的重要限制因素之一是核盘菌对田间油菜的危害。菌核病是由腐生型真菌核盘菌寄生引起的一种世界范围性严重病害，是我国油菜最主要病害，严重影响油菜的品质和产量。一般年份菌核病发病率为10％-30％，严重的时候可以达到80％以上(费维新,李强生,吴新杰.中国油料作物学报,2002,3:47-49)。

目前，如何防治油菜抗菌核病主要有如下途径：农药与生物防治、选育抗(耐)菌核病材料、基因工程方法。通过这些途径，取得了一些成绩，筛选到一些抗(耐)病性比较好的材料，但是生产中菌核病危害严重的问题依然存在(刘正立,刘春林.甘蓝型油菜抗菌核病研究进展.中国农学通报,2015,31(15):114-123)。

基因工程途径解决菌核病危害的问题，应该是一条可行的途径，可是现有的思路与转基因实践并未获得显著提高抗菌核病的油菜材料。为此，与以往基因工程的策略不同，本发明人改变思路，采用“以毒攻毒”的思想，克隆核盘菌中推测为凝集素SSL-6的基因，并构建该基因的过表达质粒；然后将核盘菌凝集素SSL-6蛋白基因转入甘蓝型油菜中，以期获得具有抗菌核病的油菜种质资源。本发明通过基因工程的方法，首次发现核盘菌凝集素SSL-6蛋白及其编码基因，该基因可显著提高油菜对核盘菌的抗性。

技术实现要素：

本发明的目的是，针对上述现有技术的不足，提供一种来源于油菜病原菌核盘菌的核盘菌凝集素SSL-6蛋白及其编码基因，同时提供该基因在油菜抗核盘菌中的应用。

为达上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种核盘菌凝集素SSL-6蛋白，来源于油菜致病菌核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID No:1；

2)将序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸残基序列经过一至五个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对提高油菜抗菌核病作用的蛋白质。

编码本发明核盘菌凝集素SSL-6蛋白的基因(SSL-6)，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID No:2的核苷酸序列；

2)编码序列表中的SEQ ID No:1蛋白质序列的DNA；

3)与序列表中的SEQ ID No:2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID No:2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件为：用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID No:2由936个碱基组成，其编码框为自5’端第1-933位碱基，编码具有序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸残基序列的蛋白质。

本发明还包括含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系和工程菌以及扩增该基因中任一片段的引物对。

本发明还提供上述的核盘菌凝集素SSL-6蛋白基因在调控油菜抗菌核病中的应用。

本发明还提供将编码上述核盘菌凝集素SSL-6蛋白的基因转入油菜中，经培育得到转基因油菜，该转基因油菜的抗菌核病能力得到提高，从而得到抗核盘菌侵染的高抗菌核病的油菜种质资源。

本发明的为核盘菌凝集素SSL-6蛋白基因的过表达转基因油菜对菌核病抗性显著提高。本发明为油菜提高油菜抗菌核病提供了一个优质基因。本发明的蛋白质及其编码基因具有较高的实际应用价值，应用前景广阔。

附图说明

图1是核盘菌菌核在PDA培养基上培养5天的生长情况图。

其中：5d表示生长到第5天时的菌丝分别情况，S3表示紧靠培养皿壁的发育中的新菌核。

图2是从发育中的核盘菌菌核中分离出的总RNA电泳图。

其中：M为指示DNA片段大小的DNA分子标记，1、2为核盘菌菌核样品；该两个样品来源的RNA都有明显5S rRNA、18S rRNA和28S rRNA三条带，说明RNA质量可靠，能用于下一步反转录合成cDNA。

图3是核盘菌凝集素SSL-6蛋白基因全长CDS的PCR扩增产物电泳图。

其中，M为DNA片段分子量大小的100bp plus Ladder DNA标记，1为扩增产物。

图4是构建的SSL-6基因过表达质粒的菌落PCR验证电泳图。

其中：M为指示DNA片段大小的DNA分子标记，1为空白对照，2-8为单菌落。

图5是构建的SSL-6基因过表达质粒的酶切验证电泳图。

其中：M为指示DNA片段大小的DNA分子标记，1为未经酶切的表达质粒，2为经NcoI和XbaI双酶切的表达质粒。

图6是转pFGC5941-SSL-6CDS质粒的油菜抗性苗的转基因PCR检测电泳图。

其中：M为DNA片段分子量大小的100bp plus Ladder DNA标记，1-5、7、8和11为过表达转基因植株；6、9、10为非转基因植株；12为空白对照，13为阳性对照。

图7是转基因植株中目标基因表达的RT-PCR检测图。

其中：1-8为转基因植株，9为空白对照；BnaACTIN2为油菜看家基因的表达情况，作为表达量的相对参照；SSL-6为转基因植株中SSL-6基因的相对表达量。

图8是核盘菌接种油菜的抗性试验图。

其中：A为转基因植株，B为受体植株；从菌斑大小可以看出转SSL-6基因的植株抗菌核病能力显著提高。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。所用引物和测序工作由上海生工生物科技有限公司完成。

实施例1.核盘菌总RNA分离与凝集素SSL-6蛋白基因全长CDS的克隆

一、核盘菌总RNA分离与第一互补链cDNA的合成

在超净工作台上，将核盘菌菌株SS-3(由湖南农业大学作物代谢调控实验室提供)的菌核用75％的乙醇消毒5min，用灭菌蒸馏水冲洗3次，灭菌后的菌核接种到带PDA固体培养基的培养皿中央；接种后培养皿放置在培养箱中，25℃暗培养5天。暗培养第5天，沿着培养皿壁会有新的菌核形成(图1)。从接种后培养第5天的培养皿中，取发育中的菌核约100mg放入1.5mL离心管中，盖紧管盖，迅速转移至液氮中速冻；往离心管中加入700μL REB(RNA extraction buffer(REB)组成：1M Tris-HCl(pH＝8)40mL，0.5M EDTA(pH＝8)10mL，LiCl 3.4g，SDS 2g，H₂O定容至200mL)，并用电动研磨棒快速研磨；研磨充分后，加入700μL水饱和酚，剧烈振荡，12000×g，4℃离心10min；取上清液至1.5mL离心管中，并加入600μL氯仿，充分振荡，12000×g，4℃离心10min；取上清液至另一个1.5mL离心管中，加入200μL的冷乙醇和40μL 3M的NaAc，-20℃静置20min以上；12000×g，4℃离心10min后弃上清液，加入700μL的75％乙醇(DEPC处理水配制)，洗涤沉淀；11000×g，4℃离心5min后弃上清液，将带有总RNA沉淀的离心管放入生物安全柜中吹干，至沉淀为半透明状，然后加入40μL无RNA酶水(RNase-free水)溶解RNA 5min左右；整个操作要带口罩及一次性手套。

取RNA溶液5μL与1×loading buffer(6×loading buffer：30mM EDTA,36％(v/v)甘油,0.05％(w/v)溴酚蓝)混合，用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测，见图2。结果显示：第二泳道的28S rRNA的亮度大约是18S rRNA的2倍，而且5S的条带较弱，未见DNA残留，表明提取的核盘菌RNA质量较好，纯度较高，可用于下一步反转录合成cDNA。提取的总RNA溶液经DNAase酶消化后，利用Thermo Scientific公司商业化的Revertaid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒合成cDNA(具体步骤按照试剂盒说明书操作)，反转录成的cDNA用于下一步SSL-6基因全长CDS的克隆的PCR模板。

二、核盘菌SSL-6基因全长CDS克隆

从NCBI网站上查找核盘菌凝集素目标基因的参考序列为XM_001584918，根据参考的CDS全长序列，使用Primer Premier 5软件设计SSL-6基因全长CDS的PCR引物对，引物序列分别为正向引物SSL-6CDSF：5’－TCTAGAATGTCTCTTCTTACCACGGAGCTTG－3’(SEQ ID No:3，下划线表示为XbaI酶切位点)和反向引物SSL-6CDSR：5’－CCATGGTCATGCGGGGATGACAGTAGTACC－3’(SEQ ID No:4，下划线表示为NcoI酶切位点)。以前述反转录成的cDNA为模板，高保真PCR扩增SSL-6基因的全长CDS序列。50μl PCR反应体系包含：模板2μl，高保真酶Phusion High-fidelity DNA Polymerase(Invitrogen)1μl，10×缓冲液5μl，2.5uM dNTP 8μl，20μM的正向和反向引物各1μl，水32μl。反应条件为：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，57℃退火30秒，68℃延伸1分钟，共30个循环。反应结束后，将PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图3，扩增得到一条936bp大小的DNA片段，与预期的目标片段大小相符。将扩增片段回收并纯化后，将其克隆到载体pEASY-Blunt Cloning(购自全式金公司)中，得到含有目的片段的重组质粒pEASY-SSL-6CDS，经转化、筛选后测序，结果见SEQ ID No:2所示的核苷酸序列，其由936个碱基组成，其编码框为自5’端第1-936位碱基(最后三个碱基为终止密码子TGA)，编码具有SEQ ID No:1的氨基酸残基序列的蛋白质,为311个氨基酸残基，编码的蛋白命名为SSL-6。

实施例2.SSL-6基因过表达质粒的构建

选择测序正确的pEASY-SSL-6CDS重组质粒，与pFGC5941质粒分别同时用Fast Digest Enzyme NcoI和XbaI(Fermetans)两种质粒进行双酶切，酶切温度37℃，酶切时间为30-40min，反应体系40μL(1μg质粒DNA，2μL 10×FastDigest Green Buffer，0.5μL FastDigest NcoI，0.5μL FastDigest XbaI，加水至40μL)，具体按照Fermetans公司试剂盒说明进行；酶切产物经过1.5％琼脂糖凝胶电泳分离后，切下目的条带，用胶回收试剂盒纯化回收，将回收的两个目标DNA片段通过T4连接酶连接，连接产物通过热激法转化大肠杆菌(Esherichia coli)DH5α，转化细胞在液体LB培养基中，37℃、200rpm的条件下复苏1h；将经过恢复培养的细胞均匀涂于含卡那霉素(50μg/mL)的LB固体培养皿上，37℃培养16h。挑取LB固体培养基上的单菌落，以引物35SF：5'-CTATCCTTCGCAAGACCCTTC-3'(SEQ ID No.5)和SSL-6CDSR(SEQ ID No.4)进行菌落PCR鉴定，见图4，显示PCR扩增产物电泳带在1000bp与900bp之间，结果与预期的片段大小一致。选择PCR检测正确的单菌落扩大培养，提取质粒，以Fast Digest Enzyme NcoI和XbaI进行双酶切验证，见图5，双酶切片段弱大于1000bp，与预期的片段大小一致。PCR鉴定和双酶切鉴定两种结果都说明过表达质粒pFGC5941-SSL-6CDS构建成功。

实施例3.甘蓝型油菜转化及分子鉴定与转基因油菜抗菌核病检测

一、甘蓝型油菜转化

一)外植体的准备

选取甘蓝型油菜易感病品种“98C40”完整饱满的种子约100颗，置于150mL三角瓶中。向装有种子的三角瓶中加入20-30mL 75％乙醇，振荡消毒30s，弃去酒精；再加入20mL 0.1％HgCl₂和1滴TWEEN-20的消毒液，剧烈摇晃至起泡，静置20min，弃去消毒液，用无菌水反复冲洗3-5遍以洗净泡沫；加入50mL经高温灭菌的无菌水浸泡种子，浸泡时间为1h；倒掉无菌水，把种子均匀铺在1/2MS固体培养基上，22℃暗培养4-5d。待油菜幼苗长到4-5cm后将其转移到光照条件下生长6-8h，使幼苗子叶转绿。子叶柄作为转化的外植体。

二)农杆菌的准备

幼苗生长到1-2cm时，开始准备菌液。将分别带有pFGC5941-SSL-6CDS质粒的农杆菌LBA4404菌株在含50mg/mL卡那霉素、50mg/mL链霉素和100mg/mL利福平的YEB固体培养基上划线，28℃恒温培养3d。挑取单菌落于10mL含50mg/mL卡那霉素、50mg/mL链霉素和100mg/mL利福平的YEB液体培养基中，28℃、200rpm扩大培养16-18h。吸取1mL菌液加入到50mL含50mg/mL卡那霉素、50mg/mL链霉素和100mg/mL利福平的YEB液体培养基中，扩大培养至菌液OD₆₀₀达到0.4-0.8。

三)子叶柄的农杆菌转化与抗性苗筛选

将油菜幼苗子叶柄从生长点以上的分支处切下，转移到BM液中。将扩大后的农杆菌菌液从三角瓶转移至50mL离心管，6000rpm/min离心10min，去上清后于离心管中加入25mL BM液，振荡使农杆菌重悬；再加入10μLβ-巯基乙醇和20μL乙酰丁香酮，摇匀后作为工作液倒入已灭菌的平皿中。将切好的子叶柄转到该工作液中浸泡10min。浸泡后，将子叶柄转移到已灭菌的吸水纸上。用镊子翻动子叶柄使子叶柄表面残留工作液被吸水纸吸干。最后将子叶柄均匀铺放在共培培养基(1升MS+1mg 6-苄氨基嘌呤+30g蔗糖+1.6g植物凝胶)上，22℃，暗共培养36h。共培完成后，将外植体转移到筛选培养基(1升MS+2mg 6-苄氨基嘌呤+20mg草铵膦+500mg头孢霉素+30g蔗糖+1.6g植物凝胶)中。22℃，长日照培养；每10-14d更换一次筛选培养基。

当外植体分化出若干簇抗性不定芽后，将不定芽切开分离后放入生根培养基(1升1/2MS+20mg草铵膦+10g蔗糖+1.6g植物凝胶)上继续培养。分化苗长出足够的根系后，将其从生根培养基中取出，并用无菌水将根上残留的培养基清洗干净。然后将分化苗移入蛭石中，炼苗10天。炼苗之后转入土壤中，共获得草铵膦抗性苗11株。抗性苗用于下一步PCR转基因检测鉴定。

四)抗性苗转基因鉴定与SSL-6基因表达检测

用CTAB方法从转pFGC5941-SSL-6CDS质粒的抗性苗叶组织中提取总DNA，以总DNA作为模板，35SF(SEQ ID No.5)和SSL-6CDSR(SEQ ID No.4)为引物，进行PCR检测(扩增片段为1925bp)，检测结果显示与质粒为阳性对照扩增片段大小一致的有8株，说明总共获得了8株SSL-6基因过表达转基因植株(见图6)。用Trizol(Invitrogen)法提取8株转基因植株叶片中的总RNA，利用Thermo Scientific公司商业化的Revertaid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒合成cDNA(具体步骤按照试剂盒说明书操作)。以cDNA为模板，SSL-6CDSF(SEQ ID No.3)和SSL-6CDSR(SEQ ID No.4)为引物，用半定量RT-PCR方法扩增目标片段，以BnaACTIN2基因作为内参。结果显示8株转基因植株中，有7株植株有SSL-6表达，但是表达程度不同，又高有底(见图7)。选SSL-6基因表达量最高的转基因植株做抗菌核病鉴定。

二、转基因油菜抗菌核病检测

所用核盘菌的菌株为能侵染油菜的菌株SS-3(由湖南农业大学作物代谢调控实验室提供)。取其饱满、无裂无霉变的SS-3的菌核颗粒，用75％乙醇浸泡5min，无菌水冲洗3～4次，灭菌后接种到带PDA培养基的培养皿中央，放置在培养箱中，25℃暗培养2-3天。接种用植株为生长到有4片真叶的转基因植株与易感病98C40受体植株。在PDA培养基上生长大约3天，核盘菌菌丝已经触及平皿边缘，用直径为1厘米的打孔器沿着圆形培养皿边缘采集菌块；将菌块上带有菌丝的面覆盖到油菜叶片上，使菌丝与叶片表面直接接触；将接种了核盘菌菌丝的植株转入28℃，湿度大于90％的光照培养箱中。放置5-7天后，观察接种核盘菌菌丝的叶片上形成的菌斑大小。结果见图8，显示，转基因植株接种叶片上的菌斑明显小于易感菌核病品种98C40受体植株叶片上的病斑，说明SSL-6基因能显著提高油菜抗菌核病的能力。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南农业大学

<120> 核盘菌凝集素SSL-6蛋白及其编码基因与应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 311

<212> PRT

<213> 核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum)

<400> 1

Met Ser Leu Leu Thr Thr Glu Leu Ala Cys Thr Ser Ala Pro Asp Gln

1 5 10 15

Val Leu His Leu Phe Phe Gln Asp Gly Gln Asn Ile Leu Glu Ala Arg

20 25 30

Ser Pro Asp Gly Gly Asn Val Trp Thr Thr Gln Asp Thr Ile Ile Ala

35 40 45

Lys Asp Gly Asp Tyr Asn Gly Ser Ser Met Thr Cys Tyr Tyr Val Asp

50 55 60 65

Lys Asp Ala Asn Phe Asp Asn Gln Pro Ser Ile His Leu Leu Tyr Met

70 75 80

Asn Lys Asp Lys Gln Leu Thr Glu Lys Val Lys Arg Met Lys Gly Asp

85 90 95

Asn Pro Ile Trp Glu Asp Ala Lys Val Pro Asp Glu Val Arg Lys Gly

100 105 110

Pro Glu Gln Tyr Ser Lys Leu Thr Ser Gly Ser Phe Asn Gln Gly Thr

115 120 125

Gly Trp Asn Pro Asn Gly Ser Gln Trp Ala Tyr Phe Ser Ala Ser Lys

130 135 140 145

Asp Gly Lys Met Gly Ile Val Glu Ile Arg Arg Thr Pro Lys Asp Pro

150 155 160

Trp His Thr Glu Thr Ile Leu Glu Glu Lys Trp Gly Asp Glu Leu Pro

165 170 175

Gly Thr Ala Leu Ala Cys Val Ile Gly Asn Gly Lys Ile Arg Val Phe

180 185 190

Leu Gln His His Asp Tyr Ser Ile Ile Leu Tyr Glu Asn Gln Asn Asn

195 200 205

Thr Trp His Asp Arg Gly Thr Phe Ile Pro Lys Asp Lys Val Gln Ala

210 215 220 225

Thr Thr Pro Leu Ala Cys Thr Met Thr Lys Asp Gly Ser Val His Leu

230 235 240

Phe Tyr Val Ser Lys Ser Asn Lys Ile Ile His Cys Thr Asp Gly Lys

245 250 255

Lys Glu Glu Glu Leu Ile Asn Phe Phe Pro Gly Ser Lys Leu Gly Ala

260 265 270

Thr Ser Val Glu Asn Lys Ile Thr Leu Phe Phe Arg Asn Leu Asn Pro

275 280 285

Val Asn Glu Val Gly Thr Leu Glu Asn Glu Asn Gly Ser Trp Lys His

290 295 300 305

Gly Thr Thr Val Ile Pro Ala

310

<210> 2

<211> 936

<212> DNA

<213> 核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum)

<400> 2

atgtctcttc ttaccacgga gcttgcttgc acttctgccc ccgatcaagt cttgcatctt 60

ttcttccaag acggccaaaa cattctcgaa gcgcgatctc cagatggcgg caatgtttgg 120

actactcaag atactatcat tgctaaagat ggagattaca atggctcttc tatgacatgc 180

tactatgtag acaaagacgc aaatttcgat aaccagccct caattcatct cctctacatg 240

aacaaggata agcaattgac ggagaaagtc aagcgcatga agggagacaa tccaatttgg 300

gaggacgcta aggtcccaga cgaagtcagg aaaggaccag agcaatattc gaagttgacc 360

agcggctcat tcaaccaagg cactggttgg aacccgaatg gttcacaatg ggcatacttt 420

tcagcctcca aggatggcaa gatgggcatc gtcgaaattc gacgcactcc aaaagatcca 480

tggcatacag agactattct cgaagaaaag tggggtgatg aactccctgg aaccgctcta 540

gcctgtgtaa ttgggaatgg aaagatcagg gtgttcctcc agcaccatga ctacagcatc 600

atactctacg aaaatcaaaa caacacatgg catgaccgag gcaccttcat tccgaaagac 660

aaggttcaag ccacaacacc gcttgcttgc accatgacca aggacggaag cgtccatctc 720

ttctacgtct caaagtctaa caagattatt cattgcaccg atggcaagaa agaggaagaa 780

ttgatcaatt tcttcccagg ctcgaagttg ggcgctactt cagttgagaa caagatcacc 840

ttgttcttca gaaacttgaa ccctgtcaat gaagttggca cgcttgagaa tgagaatggc 900

tcctggaagc atggtactac tgtcatcccc gcatga 936

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tctagaatgt ctcttcttac cacggagctt g 31

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ccatggtcat gcggggatga cagtagtacc 30

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ctatccttcg caagaccctt c 21