专利名称：人工合成玉米耐淹基因sSub1A及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，是一种人工合成的玉米耐淹基因sSublA及其应用。
背景技术：
玉米(zea mays L.)是世界上分布最广泛的粮食作物之一，也是一种重要的经济作物。在我国，其分布范围和种植面积都很大，是我国旱谷地区人民的主要粮食之一。但是每年由于洪涝灾害造成玉米产量损失巨大，目前玉米常规育种缺乏耐淹种质资源，育种进程相对缓慢，通过现代生物技术将抗涝基因导入玉米中培育具有抗涝的玉米新品种是减灾的重要措施。淹水胁迫造成缺氧环境，玉米在缺氧环境下诱导基因表达变化，改变了染色体的结构，激活转录因子转录。厌氧导致翻译正常状况下蛋白质的多聚核糖体发生分离，翻译厌氧蛋白的mRNA的多聚核糖体降低，厌氧表达的Adhl转录产物与核糖体结合有效性比有氧时高。在DNA水平上，氧诱导基因的特征是在启动子区存在厌氧反应元件(ARE)，在玉米、醛缩酶和拟南芥的的启动子区域发现了元件破坏玉米或拟南芥中的这些基序(motif)导致基因在厌氧时不表达或表达量减少。ARE由GC-基序和GT—基序组成，二者对于低氧基因的诱导都很重要。Hocren等发现基因可以诱导基因，并证实了厌氧反应的许多基因都依赖于似基因。唐万虎等通过对玉 米Mol7和Hz32淹水胁迫发现，淹水处理4h时玉米Mol7中Adh2基因表达量最大，在淹水胁迫8h后基因Jofe 表达量开始降低，而在Hz32中基因Adh2表达量稳定上升，在8h后达到最大，推测玉米的抗涝性和基因有关。2006年，菲律宾国际水稻研究所Mackill领导的研究小组发现含有控制水稻耐淹品性5^74的变异品种FR13具有超强的抗淹能力，这种品系的植株经过10-14d的没顶淹涝，待淹没状态消失后仍能恢复生长，Septiningsih等借助分子标记辅助选择，已经成功将SublA位点被嵌入印度一个高产籼稻品种Swarna中并成功表达。由于基因来源于水稻，将其直接应用到转基因玉米中具有表达量低、表达产物不稳定、耐淹效果差等缺陷，因此，对水稻基因进行改造，提供能在玉米中稳定高效表达、显著提高玉米耐涝性的基因序列是十分必要的，但是目前还未见相关报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种人工合成的提高玉米耐涝性的基因序列。本发明的再一的目的是，提供一种上述基因序列的用途。本发明的另一的目的是，提供一种重组载体。本发明的第四个目的是，提供一种遗传工程化的宿主细胞。本发明的第五个目的是，提供一种制备转基因植物的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种人工合成的提高玉米耐涝性的基因序列，所述的基因序列选自下列中的一种a)由SEQ ID NO. 8所示的序列构成的核苷酸序列；或b)与a)中所限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是如上所述的基因序列在提高植物耐涝性中的应用。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是一种重组载体，所述的重组载体含有如上所述的基因序列。为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有如上所述的重组载体；或其基因组中整合有外源的如上所述的基因序列。为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是一种制备转基因植物的方法， 所述的方法是把如上所述的重组载体导入植物细胞、组织或器官，并筛选出整合有如上所述的基因序列的植物细胞、组织或器官。所述的植物为作物。所述的植物为禾本科植物。所述的禾本科植物选自玉米、水稻、小麦、大麦或高粱。本发明优点在于本发明通过研究水稻和玉米密码子使用情况，发现两者在密码子的使用上存在很大差异，利用密码子偏好性，重新设计改造水稻基因，并人工合成了能在玉米中稳定、高效表达的基因，将该基因导入玉米中，显著提高了玉米的耐涝性，培育获得新型耐涝玉米，为提高玉米产量提供强有力的保障。
附图I 是 pMD18_T SimpleVector 图谱。附图2是CPB载体图谱。附图3是sSubl和Subl的序列比对图。附图4是转基因玉米淹水处理后的生长情况图。附图5是转基因植株叶片过氧化氢酶活性测定结果。附图6是转基因植株叶片相对电导率测定结果。附图7是转基因植株叶片CTK (细胞分裂素)含量测定结果。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。一、材料
PMD18-T SimpleVector (图谱见图I)、CPB载体(图谱见图2)购于宝生物工程(大连)有限公司；DH5a大肠杆菌感受态细胞、EH105感受态农杆菌细胞购于宝生物工程(大连)有限公司；植物基因组DNA提取试剂盒为康为世纪新型植物基因组DNA提取试剂盒ReverseTranscription System反转录试剂盒购于promega公司；除草剂basta购于生工生物工程(上海)有限公司。YEP液体培养基配方为牛肉浸膏10 g，酵母提取液10 g，NaCl 5 g，pH 7.0，对应的固定培养基添加I. 5%的琼脂；MS、1/4MS培养基购于上海鼎杰生物科技有限公司。二、方法和结果I、采用Trizol法提取水稻FR13A总RNA 具体步骤如下
(1)取0.Ig幼嫩的FR13A水稻叶片进行研磨，研钵须预冷；
(2)研磨充分后，转移到I.5mL离心管中，向样品中加入2mL RNAiso Plus并完全覆盖样品(在加入RNAiso Plus时要保证组织没有融化，否则RNA易被RNase降解)；
(3)冰上静置25-30分钟；
(4)待样品完全融化，用研杵继续研磨至裂解液呈透明状，将匀浆液转移至2个I.5mL离心管中，冰上静置5min后，在4°C环境温度下，以转速13500rpm离心7min，将上清液转移至新的I. 5mL离心管中；
(5)每ImL液体中加入200y L的氯仿，盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15s，直至溶液充 分乳化，无分层相现象；
(6)冰上静置5min,4°C, 13500rpm离心15min,准备新的I. 5mL离心管；
(7)从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，上层是透明的水层，RNA溶解在此层中；
(8)中间层为半固体状，此层中包含DNA;粉红色的有机溶剂下层，蛋白质、多糖等物质溶解在此层中；
(9)把上层溶液小心转移至新的离心管中，大约每个离心管中能去出500ii L谨慎操作，切勿吸到中间层；
(10)加入等体积(500y L)异丙醇上下颠倒离心管，充分混匀；
(11)冰上静置IOmin后，在4°C下以13500rpm转速离心IOmin；
(12)可在离心后的离心管底观察到少量白色沉淀，小心去上清液；
(13)向含有沉淀的离心管中缓慢加入lmL，-20°C预冷的75%乙醇，轻轻上下颠倒，清洗沉淀；
(14)再次在4°C下以13500rpm离心5min,用移液枪去除上清液；
(15)打开离心管管盖，冰上放置干燥；用30ii L的RNA free ddH20溶解沉淀；
(16)RNA电泳检测取2ii L的RNA提取液，I. 2%琼脂糖凝胶电泳检测，5V/cm电泳。待两条指示剂分开Icm后将凝胶放在凝胶成像系统下观察，如果距离点样孔较劲的28S rRNA的主带的宽度和亮度是另一条18S rRNA的二倍，则表明RNA未被降解。2、反转录获得cDNA
用反转录试剂盒对提取的RNA进行反转录，得到cDNA。反转录反应体系如下
MgCla, 25mMUuL
ReverseTranscriptionlO X Buffer2 U L
dNTPMixture, IOmM2 u L
RecombinantRNasinRibonucleaseInhibitor0.5 U L
AMVReverseTranscriptase(HighConc.)0.5 U L
Oligo (dT) 15PrimerIuL
TotalRNA2 U L
Nuclease-Freeffater8 U L
反转录反应程序42°C，15min ；95°C，5min ；4°C，5min。3、PCR 扩增 SublA 基因3.1引物设计引物设计软件为Primer Premier 5.0,引物序列如下
Subl-F (SEQ ID NO. I) GCTCTAGAATGTGTGGAGGAGAAGTGATCCCCGC ；
Subl-R (SEQ ID NO. 2) CGGGATCCTCAGGCTTCCCCTGCATATGATATG,
目的片段长度为840bp。3. 2 PCR反应体系如下
权利要求
1.一种人工合成的提高玉米耐涝性的基因序列，其特征在于，所述的基因序列选自下列中的一种 a)由SEQID NO. 8所示的序列构成的核苷酸序列；或 b)与a)中所限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2.如权利要求I所述的基因序列在提高植物耐涝性中的应用。
3.—种重组载体，其特征在于，所述的重组载体含有如权利要求I所述的基因序列。
4.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞 含有如权利要求3所述的重组载体；或 其基因组中整合有外源的如权利要求I所述的基因序列。
5.一种制备转基因植物的方法，其特征在于，所述的方法是把如权利要求3所述的重组载体导入植物细胞、组织或器官，并筛选出整合有如权利要求I所述的基因序列的植物细胞、组织或器官。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的植物为作物。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的植物为禾本科植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的禾本科植物选自玉米、水稻、小麦、大麦或高粱。
全文摘要
本发明对水稻Sub1基因进行了重新设计和改造，提供一种人工合成的提高玉米耐涝性的基因序列，所述的基因序列选自下列中的一种a)由SEQIDNO.8所示的序列构成的核苷酸序列；或b)与a)中所限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列。本发明还提供了上述基因序列在提高植物耐涝性中的应用，并提供了含有该基因序列的重组载体、工程化的宿主细胞。实验证实本发明的基因序列能在玉米中稳定、高效的表达，显著提高玉米的耐涝性，在培育获得新型耐涝玉米、提高玉米产量方面具有广阔的应用前景。
文档编号C12N5/10GK102766636SQ20121017045
公开日2012年11月7日 申请日期2012年5月29日 优先权日2012年5月29日
发明者周健, 姜威, 姜翠萍, 朱苏文, 江海洋 申请人:安徽农业大学