专利名称：一种用于快速基因克隆的酶混合物及制备方法、包含该酶混合物的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术领域，具体地涉及ー种酶混合物，尤其涉及一种用于快速基因克隆的酶混合物及其制备方法。此外，本发明还涉及包含该酶混合物的试剂盒。
背景技术：
λ噬菌体Red重组系统已成功地应用于基因的定点替代、修复和染色体工程中，特别的，该系统也可应用于快速基因克隆，取代传统的TA克隆法，限制性酶切与连接法等。TA克隆高效、成功率高，但是需要単独再次构建表达载体。限制性酶切与连接法是利用II型限制性内切酶双酶切，将目的基因和表达载体切出互补的粘性末端，利用T4 DNA Iigase将互补的粘性末端或者平末端连接。这两种方法费时费力并且在克隆设计上经常会遇到很多限制，比如I.没有合适的酶切位点。2.多余的酶切位点又会増加不必要的氨基酸，在蛋白表达中使重组蛋白与天然蛋白性质变得不同。3.不适合高通量的基因克隆等等。所以，ー种不依赖连接酶，而直接用同源重组的方法，即无缝克隆(seamlesscloning)技术，完成目的片段与载体相连接的基因克隆技术日渐获得研究者的青睐。目前，市场上销售的无缝克隆酶或试剂盒有Invitrogen公司的GENEART+15+Seamless Cloningand AssemblyKit ;Clontech 的 In-Fusion HD Cloning Kit ;金斯瑞的CloneEZ 重组克隆试剂盒；德聚生物的Dogene seamless cloning kit等等。这些试剂盒使用融合酶，重组酶或酶混合物，可以促进有15bp末端序列同源的线性化载体和目的片段的同源重组而完成无缝克隆实验。这些试剂盒都无需酶切连接，但是有的反应时间超过30分钟，如，GENEART Seamless Cloning andAssembly Kit 和CloneEZ 重组克隆试剂盒，有的反应过程复杂，需要两个不同的温度，如CkmeEZ 重组克隆试剂盒(室温25° C 30分钟，然后冰上放置 5 分钟)，Dogene seamlesscloning kit (室温 25°C, 30 分钟；然后 42°C, 15 分钟)；Clontech的In-Fusion HD CloningKit虽然只要15分钟,但它需要在50°C温度下反应，需要提前预热水浴锅，不如室温25°C放置简单方便，等等这些都给实验带来不便。因此，亟需研发一种新的融合酶，重组酶或酶混合物用于无缝克隆。
发明内容
本发明要解决的技术问题之ー在于提供一种用于快速基因克隆的酶混合物，其可有效应用于无缝克隆(seamless cloning),在室温下放置较短时间就能达到很高的阳性率。本发明要解决的技术问题之ニ在于提供ー种包含该酶混合物的试剂盒。本发明要解决的技术问题之三在于提供一种该酶混合物的制备方法。为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案在本发明的一方面，提供一种用于快速基因克隆的酶混合物，该酶混合物由Reda蛋白，Red^蛋白和Gam蛋白组成,在该酶混合物中，三种蛋白的混合比例如下Reda蛋白的使用浓度为3ng/ μ I ；Red^蛋白的使用浓度为150ng/ μ l_1500ng/ μ I ;Gam蛋白的使用浓度为 3ng/ μ l-300ng/ μ I。本发明是一种基于λ噬菌体Red重组系统的应用于快速基因克隆技术的酶混合物。研究表明，Red重组系统要发挥其高效的同源重组功能，需要Reda，Red^和Gam三种蛋白的作用。Reda，Red^和Gam来源于基因工程重组蛋白，纯度>95%。Reda是ー个24kd的蛋白，具有5' —3'核酸外切酶的活性，可使线性双链DNA产生突出的3'粘性末端。Redii是ー种退火蛋白，分子量为25kD，可以自发地形成环状结构，紧紧地结合在单链DNA3/粘性末端，防止DNA被单链核酸酶降解，同时介导互补单链DNA的退火，促进替代基因两端的序列和与其同源的靶基因序列间发生重组，在重组反应中起非常大的作用。Gam蛋白只有16kd，但它能与宿主细胞中RecB⑶核酸酶结合，抑制RecB⑶核酸酶对外源DNA的降解，对外源DNA起到保护作用。
在本发明的另一方面，提供ー种含有上述酶混合物的试剂盒。该试剂盒还包括如下反应缓冲液100-500mM 的 Tris-HclCpH 7. 5，25。。)，IOOmM 的 MgCl2, IOmM 的 ATP，5-10mM的 DTT，0-0. 5%mM 的 BSA。mM=lmmol/L 毫摩尔每升。在本发明的另一方面，提供一种该酶混合物的制备方法，包括如下步骤(I)Reda , Red^和Gam蛋白表达菌株的获得全基因合成Red a，Red β和Gam蛋白的DNA序列，合成Reda，Red^和Gam蛋白的引物，以合成好的基因为模板，用对应的引物PCR获得的产物Ndel和Xhol双酶切后连接到用相同的酶酶切好的Pet30a载体上，转化DH5a,测序获得正确的阳性表达质粒pet30a_Reda，pet30a-Red^ , pet30a_Gam ;然后这三种质粒转化BL21 (DE3 )，获得表达菌株；(2) Reda，Red^和Gam蛋白的表达和纯化步骤(I)获得的表达菌株接种到LB培养基中培养，进行诱导表达，离心收菌，进行超声破菌，离心收集上清；过附柱纯化，阴离子柱纯化，得到纯化后的Red a , Red β和Gam蛋白。步骤(I)中，所述的引物序列为reda nde F:5’ -ccgCATATGACACCGGACATTATCC-3’ (SEQ ID NO. I),reda xho R ’-ccgCTCGAGTCGCCATTGCTCCCCAAATAC-3’ (SEQ ID NO. 2)；redb nde F:5’ -ccgCATATGAGTACTGCACTCGCAAC-3’ (SEQ ID NO. 3),redb xho R :5’ -ccgCTCGAGTGCTGCCACCTTCTGCTC-3’ (SEQ ID NO. 4)；gam nde F :5’ -ccgCATATGGATATTAATACTG-3’ (SEQ ID NO. 5),gam xho R:5’ -ccgGATATTGATTCAGAGGTACTCGAG-3’ (SEQ ID NO. 6)。步骤(2)具体为将步骤(I)获得的表达菌株I : 100接种到LB培养基中，37°C，250rmp震荡培养到0D600=0. 6时，加入ImM IPTG诱导表达，同时将培养温度降至20°C，低温诱导表达过夜，5k转离心收菌；Ig菌体加入IOml缓冲液，超声破菌；12k转离心30min收集上清，过Ni柱纯化；阴离子柱纯化。步骤(2)中，所述过Ni柱纯化具体包括如下步骤第一歩平衡用平衡缓冲液平衡柱子，直至pH达到8. O,紫外检测读数为5 10个柱体积，检测调零后上样；第二步上样样品应保持澄清，如发现沉淀浑浊则需要离心，收集流出；第三步平衡上样结束，用平衡缓冲液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定；第四步预洗用预洗缓冲液预洗，收集洗脱组分；第五步洗脱用洗脱液洗脱目标蛋白，收集洗脱组分；第六步洗柱用洗柱缓冲液冲洗层析柱，收集洗脱组分。步骤(2)中，所述阴离子柱纯化具体包括如下步骤第一歩平衡用缓冲液平衡柱子，直至pH达到8. O,紫外检测读数为5 10个柱体积，检测调零后上样；第二步上样样品应保持澄清，如发现沉淀浑浊则需要离心，样品中离子强度不宣 超过5ms/cm,收集流出；第三步平衡上样结束，用平衡液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定;第四步洗脱用不同盐浓度I)20mM Tris-HCl, pH8. 0,50mMNaCl ；2) 20mMTris-HCl, pH8. O,IOOmMNaCl ；3) 20mM Tris-HCl, pH8. 0,200mMNaCl ；4) 20mM Tris-HCl,pH8. 0,300mMNaCl ；5)20mM Tris-HCl，pH8. 0，500mMNaCl 分步洗脱，分步收集各个洗脱组分。本发明的有益效果在于本发明将λ噬菌体Red重组系统的三种蛋白在体外按ー定浓度比例混合后，在特定的反应体系下，该混合物就能在室温25°C，20min内完成克隆实验，克隆效率和阳性率与其他试剂盒相当。该混合物制备简单，成分明确，可以有效应用于无缝克隆(seamless cloning)。与其他相同功能酶或酶混合物相比,本发明酶混合物及试剂盒在室温(25°C )放置20分钟就能达到很高的阳性率，操作较其他试剂盒更方便(室温，无需加热及冰上放置等)，完成克隆实验的时间更短。
图I是实施例2中15%的SDS-PAGE蛋白电泳图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进ー步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人,分子克隆实验室手册■ (New York:Cold SpringHarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例I. Red α，Red β和Gam蛋白表达菌株的获得全基因合成Reda，Red^和Gam蛋白的DNA序列，序列參照NCBI中λ噬菌体(NC_001416)的基因序列。合成如下引物reda nde F:5’ -ccgCATATGACACCGGACATTATCC-3’ (SEQ ID NO. I),reda xho R ’-ccgCTCGAGTCGCCATTGCTCCCCAAATAC-3’ (SEQ ID NO. 2)；redb nde F:5’ -ccgCATATGAGTACTGCACTCGCAAC-3’ (SEQ ID NO. 3),redb xho R :5’ -ccgCTCGAGTGCTGCCACCTTCTGCTC-3’ (SEQ ID NO. 4)；gam nde F :5’ -ccgCATATGGATATTAATACTG-3’ (SEQ ID NO. 5),gam xho R:5’ -ccgGATATTGATTCAGAGGTACTCGAG-3’ (SEQ ID NO. 6)；以合成好的基因为模板，用对应的引物PCR获得的产物Ndel和Xhol双酶切后连接到用相同的酶酶切好的Pet30a载体上，转化DH5a，测序获得正确的阳性表达质粒pet30a-Red a , pet30a-Red β，pet30a-Gam。然后这三种质粒转化 BL21 (DE3),获得表达菌株。实施例2. Red α，Red β和Gam蛋白的表达和纯化I.将实施例I获得的菌种I :100接种到LB培养基中，37°C，250rmp震荡培养到0D600=0. 6时，加入ImM IPTG诱导表达，为了提高蛋白可溶性表达的比例，同时将培养温度降至20°C,低温诱导表达过夜(16h), 5k转离心收菌。2.破菌菌体总量与破菌缓冲液(50mM Tis-Hcl,pH 8. 0,500mM NaCl) I 10 混合，即Ig菌体加入IOml缓冲液，超声破菌。12k转离心30min收集上清，过Ni柱纯化。3. Ni 柱纯化3. I 第一歩平衡用平衡缓冲液(20mM Tris-HCl,pH8. O, 500mMNaCl, 20mM 咪唑·)平衡柱子，缓冲液及样品中不可有EDTA，Arg等物质，直至pH达到8. O,紫外检测读数稳定，一般为5 10个柱体积，检测调零后可以上样。3. 2第二步上样样品应保持澄清，如发现沉淀浑浊则需要离心，收集流出。3. 3第三步平衡上样结束，用平衡缓冲液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定。3. 4 第四步预洗用预洗缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8. 0，500mMNaCl，50mM 咪唑)预
洗，收集洗脱组分。3. 5 第五步洗脱用洗脱液(20mM Tris-HCl, pH8. O, 500mMNaCl, 200mM 咪唑)洗脱
目标蛋白，收集洗脱组分。3. 6 第六步洗柱用洗柱缓冲液(20mM Tris-HCl, pH8. O, 500mMNaCl, 500mM 咪唑)
冲洗层析柱，收集洗脱组分。Red α，RedP和Gam蛋白会在第五步洗脱下来,纯度达到95%。4.为了去除蛋白中微量的但会影响后期实验的宿主残留DNA或质粒DNA，这部分样品会再经过阴离子柱纯化(Q Sepharose Fast Flow)。阴离子柱纯化具体步骤如下4. I第一歩平衡用缓冲液(20mM Tris-HCl, pH8. O)平衡柱子，直至pH达到8. 0，紫外检测读数稳定，一般为5 10个柱体积，检测调零后可以上样。4. 2第二步上样样品应保持澄清，如发现沉淀浑浊则需要离心，样品中离子强度不宜超过5ms/cm,收集流出。4. 3第三步平衡上样结束，用平衡液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定。4.4 第四步洗脱用不同盐浓度(l)20mM Tris-HCl, pH8. 0,50mMNaCl ；2) 20mMTris-HCl, pH8. 0,IOOmMNaCl ；3) 20mM Tris-HCl, pH8. 0,200mMNaCl ；4) 20mM Tris-HCl,pH8. 0,300mMNaCl ；5) 20mM Tris-HCl, pH8. 0,500mMNaCl)分步洗脱，分步收集各个洗脱组分。5.因为残留DNA—般在高盐组分中，所以收集低盐洗脱的蛋白质样品供后续实验。6.蛋白样品加入相同体积甘油-80°C保存(Reda，Red^和Gam蛋白的电泳检测结果见图I)。
实施例3.蛋白残留宿主DNA的影响鉴定取实施例2纯化好的蛋白(lmg/ml) 10μ I转化100μ I DH5a感受态(感受态效率>109cfu/ug)，42°C热激后加入900μ I无抗SOC培养基，复苏Ih后，5k离心5min，去掉800 μ I上清，剩余200 μ I混匀后涂在kana抗性的LB板上，37°C过夜培养，计算板上克隆数。实验结果表明，板上没有克隆长出，说明纯化好的蛋白没有DNA污染，可以供后续实验。实施例4载体pucl9经EcoRl/Sall双酶切后割胶回收，回收后线性化载体浓度为(20ng/μ I)。目的片段经PCR获得，长度为lkb，胶回收后浓度为(50ng/y I)两端与线性化pucl9载体有15bp的同源序列。载体与插入片段的摩尔数比为I : 3。反应体系为20μ1，各组分含量分别如表I所不
表I
^~体积(μ )puc 19( EcoR I/Sal I) Ρ0τ §/μ1)6
R的片段PCR产物(50ng^l)3
^IOx缓冲液2
Γ Tris-HcKPh7.5@25 °C) Γ 300 mM MgC12IOOmM
ATPIOmM
DTT7 mM
BSA0.25%
,混合物^i
Reda3ng/pl
Redp腦 ng/μ
Gam150η§/μ1
去离子水^g混匀后，室温(25°C)放置20分钟后，取10 μ I加入100 μ I DH5a感受态细胞(感受态效率>5X106cfU/y g)中进行转化实验，转化方法等同常规方法冰上放置30分钟后，42°C热激I分钟后再在冰上放置3分钟，加入900 μ I SOC培养基37°C孵育45分钟，取100 μ I菌液均匀涂在含有氨苄抗性、加有IPTG和x-gal的LB平板上，37°C过夜培养。第二天，数板上白斑克隆数，同时菌落PCR进行阳性鉴定。同时对其他公司无缝克隆试剂盒按其说明书一起进行反应，同样数白斑克隆和菌落PCR，比较效果。实验结果如表2所示表权利要求
1.一种用于快速基因克隆的酶混合物，其特征在于，该酶混合物由Reda蛋白，Redii蛋白和Gam蛋白组成，在该酶混合物中，三种蛋白的混合比例如下Reda蛋白的浓度为3ng/ μ I ；Red β 蛋白的浓度为 150ng/ μ l_1500ng/ μ I ；Gam 蛋白的浓度为 3ng/ μ l_300ng/μ I。
2.一种含有权利要求I所述酶混合物的试剂盒。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括如下反应缓冲液100-500mM 的 Tris-Hcl，IOOmM 的 MgCl2, IOmM 的 ATP, 5-1OmM 的 DTT,0-0. 5%mM 的 BSA。
4.一种如权利要求I所述的用于快速基因克隆的酶混合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)Reda,Red^和Gam蛋白表达菌株的获得全基因合成Red a , Red β和Gam蛋白的DNA序列，合成Reda ,Red^和Gam蛋白的引物，以合成好的基因为模板，用对应的引物PCR获得的产物Ndel和Xhol双酶切后连接到用相同的酶酶切好的Pet30a载体上，转化DH5a，测序获得正确的阳性表达质粒pet30a_Reda，pet30a-Red^ , pet30a_Gam ;然后这三种质粒转化BL21 (DE3 )，获得表达菌株； (2)Reda，Red^和Gam蛋白的表达和纯化步骤(I)获得的表达菌株接种到LB培养基中培养，进行诱导表达，离心收菌，进行超声破菌，离心收集上清；过附柱纯化，阴离子柱纯化，得到纯化后的Red a，Red β和Gam蛋白。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的引物序列为 reda nde F :5’ -ccgCATATGACACCGGACATTATCC-3’ (SEQ ID NO. I),reda xho R: ’ -ccgCTCGAGTCGCCATTGCTCCCCAAATAC-3’ (SEQ ID NO. 2)；redb nde F :5’ -ccgCATATGAGTACTGCACTCGCAAC-3’ (SEQ ID NO. 3),redb xho R :5’ -ccgCTCGAGTGCTGCCACCTTCTGCTC-3’ (SEQ ID NO. 4)；gam nde F :5’ -ccgCATATGGATATTAATACTG-3’ (SEQ ID NO. 5),gam xho R :5’ -ccgGATATTGATTCAGAGGTACTCGAG-3’ (SEQ ID NO. 6)。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)具体为将步骤(I)获得的表达菌株I :100接种到LB培养基中，37°C，250rmp震荡培养到0D600=0. 6时，加入ImMIPTG诱导表达，同时将培养温度降至20°C，低温诱导表达过夜，5k转离心收菌；Ig菌体加入IOml缓冲液，超声破菌；12k转离心30min收集上清，过Ni柱纯化；阴离子柱纯化。
7.如权利要求4或6所述的方法，其特征在于，所述过Ni柱纯化具体包括如下步骤 第一步平衡用平衡缓冲液平衡柱子，直至PH达到8. 0，紫外检测读数为5 10个柱体积，检测调零后上样； 第二步上样样品应保持澄清，如发现沉淀浑浊则需要离心，收集流出； 第三步平衡上样结束，用平衡缓冲液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定; 第四步预洗用预洗缓冲液预洗，收集洗脱组分； 第五步洗脱用洗脱液洗脱目标蛋白，收集洗脱组分； 第六步洗柱用洗柱缓冲液冲洗层析柱，收集洗脱组分。
8.如权利要求4或6所述的方法，其特征在于，所述阴离子柱纯化具体包括如下步骤 第一步平衡用缓冲液平衡柱子，直至PH达到8. 0，紫外检测读数为5 10个柱体积，检测调零后上样； 第二步上样样品应保持澄清，如发现沉淀浑浊则需要离心，样品中离子强度不宜超过5ms/cm,收集流出； 第三步平衡上样结束，用平衡液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定; 第四步洗脱用不同盐浓度1) 20mM Tris-HCl, ρΗ8· 0,50mMNaCl ；2) 20mM Tris-HCl,pH8. 0,IOOmMNaCl ；3) 20mM Tris-HCl, pH8. 0,200mMNaCl ；4) 20mM Tris-HCl, pH8. 0， 300mMNaCl ；5) 20mM Tris-HCl, pH8. 0,500mMNaCl分步洗脱，分步收集各个洗脱组分。
全文摘要
本发明公开了一种用于快速基因克隆的酶混合物，该酶混合物由Redα蛋白，Redβ蛋白和Gam蛋白组成，在该酶混合物中，三种蛋白的混合比例如下Redα蛋白的浓度为3ng/μl；Redβ蛋白的浓度为150ng/μl-1500ng/μl；Gam蛋白的浓度为3ng/μl-300ng/μl。此外，本发明还公开了该酶混合物的制备方法。另外，本发明还公开了含有该酶混合物的试剂盒。本发明的酶混合物及试剂盒可有效应用于无缝克隆(seamless cloning)，与其他相同功能酶或酶混合物相比,在室温放置20分钟就能达到很高的阳性率，操作较其他试剂盒更方便(室温，无需加热及冰上放置等)，完成克隆实验的时间更短。
文档编号C12N9/22GK102676470SQ20121017028
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月29日 优先权日2012年5月29日
发明者林霞, 王娟, 蔡丽君, 许志戎 申请人:吴江近岸蛋白质科技有限公司