肽混合物的制作方法

肽混合物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种适于引起免疫应答的肽混合物。其包含第一肽和第二肽，所述第一肽和第二肽各自对应于RAS蛋白的片段。所述第一肽和第二肽中的每种包含包括RAS蛋白的位置13的至少8个氨基酸的区域。所述第一肽和第二肽的所述区域中的每个独立地具有不在所述位置13处的与RAS蛋白的相应区域相同的至少6个氨基酸残基。所述第一肽和所述第二肽中的每种在对应于所述位置13的氨基酸处具有点突变。所述第一肽的点突变不同于所述第二肽的点突变。
【专利说明】狀混合物 发明领域
[0001] 本发明提供用于引起免疫应答的包含RAS蛋白的肽的肽混合物，用于引起免疫应 答的RAS蛋白的肽，以及包含对递呈在MHC分子上时的此种肽具有特异性的T细胞的T细胞混 合物和T细胞制剂。本发明还涉及包含这样的肽混合物和T细胞混合物及制剂的药物制剂， 这样的肽混合物、肽和T细胞混合物及制剂用于预防和/或治疗癌症的用途，以及选择用于 治疗癌症的肽混合物、肽、T细胞混合物和T细胞制剂的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 癌症发作的遗传背景是原癌基因、癌基因和肿瘤抑制基因的改变。原癌基因是具 有变成癌基因的潜能的细胞的正常基因。所有癌基因都编码蛋白质并且通过蛋白质来行使 功能。在大部分情况中，其被证明是信号转导通路的组分。在自然中癌基因通过点突变或易 位而由原癌基因产生，由此导致载有所述突变的细胞的状态转变。癌症通过涉及癌基因和 肿瘤抑制细胞的若干突变事件的多步过程而发展。
[0004] 在其最简单的形式中，原癌基因中的单碱基置换可能导致编码的蛋白质有一个氨 基酸不同。
[0005] 在涉及鼠肿瘤的实验模型中，已经证明细胞内"自我蛋白质的点突变可能产生 由与正常的肽具有单个氨基酸差异的肽组成的肿瘤排斥抗原。在肿瘤细胞表面上的主要组 织相容性(MHC)分子的背景中识别这些肽的T细胞能够杀死肿瘤细胞并因此将肿瘤排出宿 主。（Βοοη,Τ.等，Cell 1989，Vol. 58，ρ· 293-303)
[0006] 在近三十年，进行了大量努力以分析人肿瘤抗原的抗体。已经表明此种抗体可以 用于诊断和治疗用途两者，例如连同抗癌剂一起。一个问题是抗体仅能够结合暴露在肿瘤 细胞的表面上的肿瘤抗原。因为此原因，产生基于身体免疫系统的癌症治疗的努力不如预 期的成功。
[0007] 抗体典型地识别天然构象的游离抗原并且可以有效地识别暴露在抗原表面上几 乎任何位点。相对于由Β细胞产生的抗体，Τ细胞仅识别在MHC分子背景中的抗原，所述抗原 在人中被称为HLA(人白细胞抗原），并且所述识别仅在适当的抗原加工之后，所述抗原加工 通常由蛋白质的蛋白水解片段化组成，其产生适配到MHC分子的沟中的肽。这使得T细胞能 够识别来源于胞内蛋白质的肽。T细胞可以因此识别来源于肿瘤细胞中的任何地方的异常 肽（当其被MHC分子展示在肿瘤细胞表面上时）。随后T细胞可以被激活以消灭带有异常肽的 肿瘤细胞。
[0008] T细胞可以通过多种机制控制癌症的发展和生长。细胞毒性T细胞，HLA I类限制性 CD8+和HLA II类限制性CD4+，可以直接杀死带有适当的肿瘤抗原的肿瘤细胞。需要CD4+辅 助T细胞来诱导和保持细胞毒性T细胞反应以及抗体反应，并且诱导巨噬细胞和淋巴因子活 化的杀伤细胞(LAK细胞)杀伤。
[0009] 已经鉴定了很多癌基因及其蛋白质产物。此外，已经证明健康人的T细胞库 (repertoire)包括对被递呈在适当的HLA分子上时的来源于一种p21RAS癌基因产物的合成 的肽片段具有特异性的T细胞。此外，预期全部癌症中的约20%与RAS癌基因的突变相关。
[0010] 由于以下风险，即肽混合物中的一些肽是免疫显性的并且因此抑制其他肽的HLA 递呈，所以对将所述混合物用于患者的疫苗接种存在很大的担心（Pion S等，Blood， 1999Feb 1;93(3):?952-62)。由体外进行的实验已知，多种突变的1^3肽可以竞争结合负责 向相关T细胞的递呈的HLA分子，并且具有相同长度但是表现不同突变的肽可以以不同程度 的效力抑制表现另一种突变的肽的结合和识别（T . G e d d e - D a h 1 111等，H u m a η Immunol · 1994，33，p· 266-274,以及B.H. Johanssen等，Scand.J. Immunol. , 1994,33,p.607-612)。由这些事实，免疫显性问题已被认为是突变RAS肽疫苗的一个问题。
[0011] W0 92/14756公开了引起T细胞免疫性的癌基因蛋白质产物的合成的肽和片段，其 用于针对与RAS相关的癌症的疫苗和用于治疗癌症的组合物。所述肽必须对应于由癌细胞 递呈的癌基因的活性片段并且在对应于癌基因突变的一个或多个位置处包括突变。该文献 公开了在RAS蛋白的位置12、13和61处的突变并且仅具体公开了612六、612￥、612(：、6125、 6121(、6120、6121?、〇611?、〇611(、〇6比、〇61!1、613￥和6130突变。此外，虽然该文献提及疫苗可以 包含具有在癌基因蛋白质中发现的最常见的突变的肽的选择，但是其没有提示任何具体的 组合。
[0012] W0 00/66153讨论了用于癌症疫苗的引起T细胞免疫性的合成的肽混合物。所述肽 混合物由RAS p21突变体肽组成并且该文献仅具体公开了G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、 612￥、〇61!1、〇611(、〇611^、〇611?和6130突变。该文献还公开了由肽混合物引起的免疫应答显著 高于由单个肽引起的免疫应答;然而，其没有启示可以使用除了其中所公开的那些以外的 任何其他的肽组合。
[0013] GB 2328689公开了能够诱导特异性细胞毒性T细胞反应（CD 8+)的肽，其包含 p21ras原癌基因蛋白质的8至10个氨基酸(包括p21RAS原癌基因蛋白质的位置12和/或13或 位置61)并且在位置12、13或61具有氨基酸置换。该文献还公开了所述肽可以用作癌症疫苗 并且可以在用于抗癌治疗的组合物中使用。然而，没有公开特别有用的具体肽混合物。
[0014] 此外，这些文献都没有讨论具体的肽如何与具体类型的癌症相关，并且没有解决 包含多种肽的混合物中的肽的冗余。
[0015] Gjertsen等（Int.J.Cancer 2001，92，p.441_450)公开了涉及用合成的突变体RAS 肽连同粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子给患有胰腺的腺癌的患者进行疫苗接种的I/II期试 验。该试验使用单个肽疫苗或四种突变体肽的混合物。组合疫苗由四种在胰腺癌中发现的 最常见的K-RAS突变组成，即具有G12V、G12D、G12C或G12R突变的肽。然而，该文献没有公开 可用的任何其他肽组合，没有公开与癌症相关的任何其他RAS蛋白突变，并且没有讨论具体 的肽如何与具体类型的癌症相关。
[0016] Wed6n等（Int. J.Cancer 2010,128(5)，ρ· 1120-1128)报道了用合成的突变体RAS 肽进行疫苗接种的患有胰腺癌的患者的长期随访。所述疫苗由单个的RAS肽或七种RAS肽的 混合物组成。特别的，用于该试验的七种RAS肽具有G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12VS G13D突变。然而，该文献没有讨论具体的肽如何与具体类型的癌症相关，并且没有公开可用 的任何其他肽组合。
[0017] Hunger等（Exp .Dermatol .2001,10:161-167)报道了 以安全性作为第一终点并且 以RAS肽的免疫原性作为第二终点的RAS肽的体内免疫原性的临床前导性研究。用具有四密 码子61突变的N-ras肽9残基49-73)对黑素瘤患者进行皮内免疫。八名患者显示阳性的DTH 反应。然而，该文献没有讨论具体的肽如何与具体类型的癌症相关，并且没有公开可用的任 何其他肽组合。
[0018] Prior等（Cancer Res.2012,72(10)，p.2457-2467)公开了不同类型的癌症与特定 RAS同种型的突变相关并且各同种型具有不同的密码子突变特征。此外，Prior等公开了在 RAS蛋白的位置12、13和61中出现总计18种突变，每个位置出现六种突变。该综述还讨论了 这些突变对RAS功能的影响以及导致RAS同种型突变的差异模式的潜在机制。然而，该文献 没有涉及癌症的治疗或预防，或疫苗内的免疫显性和冗余的问题。此外，没有公开针对癌症 的疫苗或治疗，并且该文献没有公开可用的任何其他肽组合。
[0019]因此，需要提供进一步的且更有效的癌症疫苗和/或治疗。特别地，需要提供靶向 特定癌症的疫苗和/或治疗，所述疫苗和/或治疗克服了免疫显性和冗余的问题，并且是成 本有效的。
[0020] 发明概述
[0021] 本发明提供用于解决以上讨论的问题的方案，因为现在已经发现包含至少两种在 对应于RAS蛋白的位置13的氨基酸处具有点突变的肽(其中每种肽具有不同的突变)的肽混 合物可以用作针对与RAS蛋白突变相关的癌症的疫苗和/或用于与RAS蛋白突变相关的癌症 的治疗。特别地，已经发现至少一些本发明的肽混合物可以用作针对超过99%的与RAS蛋白 突变相关的癌症的疫苗和/或用于超过99 %的与RAS蛋白突变相关的癌症的治疗。本发明的 肽混合物减轻了免疫显性的问题并且减少了药物组合物内的活性成分的冗余，由此使得所 述肽混合物成为更加成本有效的疫苗和/或治疗。此外，本发明允许靶向具体类型癌症的疫 苗接种和/或治疗以及选择靶向具体类型癌症的肽混合物的方法。
[0022]因此，在本发明的第一方面，提供适于引起免疫应答的肽混合物，其包含第一肽和 第二肽，第一肽和第二肽各自对应于RAS蛋白的片段，其中
[0023] 第一肽和第二肽中的每种包含包括RAS蛋白的位置13的至少8个氨基酸的区域，
[0024] 第一肽和第二肽的所述区域中的每个独立地具有不在所述位置13处的与RAS蛋白 的相应区域相同的至少6个氨基酸残基，
[0025] 第一肽和第二肽中的每种在对应于所述位置13的氨基酸处具有点突变，并且
[0026] 第一肽的点突变不同于第二肽的点突变。
[0027] 有利地，所述点突变中的每个独立地选自613六、613(：、6130、6131?、6133或613￥突 变。
[0028] 优选地，肽混合物还包含至少一种另外的肽，所述至少一种另外的肽对应于RAS蛋 白的片段，所述RAS蛋白的片段包含至少8个氨基酸的区域，所述区域包括RAS蛋白的位置 12,其中所述至少一种另外的肽的所述区域中的每个独立地具有不在所述位置12处的与 RAS蛋白的相应区域相同的至少6个氨基酸残基，并且其中在对应于RAS蛋白的位置12的氨 基酸处存在点突变;和/或至少一种另外的肽，所述至少一种另外的肽对应于RAS蛋白的片 段，所述RAS蛋白的片段包含至少8个氨基酸的区域，所述区域包括RAS蛋白的位置61，其中 所述至少一种另外的肽的所述区域中的每个独立地具有不在所述位置61处的与RAS蛋白的 相应区域相同的至少6个氨基酸残基，并且其中在对应于RAS蛋白的位置61的氨基酸处存在 点突变。
[0029] 方便地，在对应于RAS蛋白的位置12的氨基酸处的点突变选自G12A、G12C、G12D、 G12R、G12S或G12V突变和/或在对应于RAS蛋白的位置61的氨基酸处的点突变选自Q61E、 〇61!1、〇611(、〇611^、〇61?或〇611?突变。
[0030]有利地，第一肽或第二肽的点突变是G13C突变。
[0031]方便地，第一肽或第二肽的点突变是G13R突变。
[0032]优选地，第一肽或第二肽的点突变是G13D突变。
[0033]方便地，第一肽或第二肽的点突变是G13V突变。
[0034] 有利地，第一肽和/或第二肽的点突变选自G13C、G13D、G13R和G13V突变。
[0035]优选地，第一肽是具有G13C突变的肽并且第二肽是具有G13D突变的肽，并且所述 至少一种另外的肽包括：
[0036]具有G12A突变的肽，
[0037]具有G12C突变的肽，
[0038]具有G12D突变的肽，
[0039]具有G12R突变的肽，
[0040]具有G12S突变的肽，和 [00411具有G12V突变的肽。
[0042]有利地，第一肽是具有G13R突变的肽并且第二肽是具有G13V突变的肽，并且所述 至少一种另外的肽包括：
[0043]具有Q61H突变的肽，
[0044]具有Q61K突变的肽，
[0045]具有Q61L突变的肽，和 [0046]具有Q61R突变的肽。
[0047]方便地，肽混合物包含至少第三肽。
[0048]优选地，第三肽是对应于RAS蛋白的片段的肽，所述RAS蛋白的片段包含至少8个氨 基酸的区域，所述区域包括RAS蛋白的位置13,第三肽的所述区域具有不在位置13处的与 RAS蛋白的相应区域相同的至少6个氨基酸残基，并且在对应于RAS蛋白的位置13的氨基酸 处存在点突变，所述点突变不同于第一肽和第二肽的点突变。
[0049] 方便地，第三肽的点突变选自G13C、G13D、G13R和G13V突变。
[0050]有利地，肽混合物包含最多8种不同的肽。
[0051]方便地，肽混合物进一步由第三肽和第四肽组成，第三肽和第四肽各自对应于RAS 蛋白的片段，其中：
[0052]第三肽和第四肽中的每种包含包括RAS蛋白的位置13的至少8个氨基酸的区域， [0053]第三肽和第四肽的所述区域中的每个独立地具有不在所述位置13处的与RAS蛋白 的相应区域相同的至少6个氨基酸残基，
[0054]第三肽和第四肽中的每种在对应于所述位置13的氨基酸处具有点突变，并且 [0055]所述肽中的每种的点突变不同于其他肽的点突变，其中 [0056]第一肽是具有G13R突变的肽，
[0057]第二肽是具有G13A突变的肽，
[0058]第三肽是具有G13S突变的肽，并且 [0059]第四肽是具有G13V突变的肽。
[0060] 在本发明的第二方面，提供适于引起免疫应答的肽混合物，其包含至少五种肽，所 述五种肽各自对应于RAS蛋白的片段，其中：
[0061] 所述至少五种肽中的每种包含至少8个氨基酸的区域并且包括RAS蛋白的位置13，
[0062] 所述至少五种肽的所述区域中的每个独立地具有不在所述位置13处的与RAS蛋白 的相应区域相同的至少6个氨基酸残基，
[0063] 所述肽中的每种在对应于所述位置13的氨基酸处具有点突变，所述点突变选自 613厶、613(：、6130、6131?、6135或613￥突变，并且
[0064] 每种肽的点突变不同于其他肽的点突变。
[0065] 在本发明的第三方面，提供适于引起免疫应答的肽混合物，其由六种肽组成，所述 六种肽各自对应于RAS蛋白的片段，其中：
[0066]每种肽包含至少8个氨基酸的区域，所述区域包括RAS蛋白的位置12，
[0067] 所述肽的所述区域中的每个独立地具有不在所述位置12处的与RAS蛋白的相应区 域相同的至少6个氨基酸残基，
[0068] 所述肽中的每种在对应于所述位置12的氨基酸处具有点突变，所述点突变选自 612厶、612(：、6120、6121?、6125或612￥突变，并且
[0069] 每种肽的点突变不同于其他肽的点突变。
[0070] 在本发明的第四方面，提供适于引起免疫应答的肽混合物，其由六种肽组成，所述 六种肽各自对应于RAS蛋白的片段，其中：
[0071] 每种肽包含至少8个氨基酸的区域，所述区域包括RAS蛋白的位置61，
[0072] 所述肽的所述区域中的每个独立地具有不在所述位置61处的与RAS蛋白的相应区 域相同的至少6个氨基酸残基，
[0073] 所述肽中的每种在对应于所述位置61的氨基酸处具有点突变，所述点突变选自 〇6比、〇61!1、〇611(、〇611^、〇61?或〇611?突变，并且
[0074] 每种肽的点突变不同于其他肽的点突变。
[0075] 在本发明的第五方面，提供适于引起免疫应答的肽混合物，其由第一肽、第二肽、 第三肽和第四肽组成，所述第一肽、第二肽、第三肽和第四肽各自对应于RAS蛋白的片段，其 中第一肽、第二肽和第三肽中的每种包含包括RAS蛋白的位置12的至少8个氨基酸的区域， 第四肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8个氨基酸的区域，第一肽、第二肽、第三肽和第四 肽的所述区域中的每个分别独立地具有不在所述位置12或13处的与RAS蛋白的相应区域相 同的至少6个氨基酸残基，第一肽、第二肽、第三肽和第四肽中的每种分别在对应于所述位 置12或13的氨基酸处具有点突变，并且
[0076]第一肽是具有G12A突变的肽，
[0077]第二肽是具有G12R突变的肽，
[0078]第三肽是具有G12S突变的肽，并且 [0079]第四肽是具有G13C突变的肽。
[0080] 有利地，在本发明的所有方面，在包括位置12、13或61的所述区域外的每种肽与 RAS蛋白具有至少75 %序列同一性。
[0081] 在本发明的第六方面，提供用作疫苗或药物并且对应于RAS蛋白的片段的肽，其 中：
[0082] 所述肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8个氨基酸的区域，
[0083] 所述区域具有不在所述位置13处的与RAS蛋白的相应区域相同的至少6个氨基酸 残基，并且
[0084]所述肽在对应于所述位置13的氨基酸处具有G13C或G13R点突变。
[0085] 在本发明的第七方面，提供适于引起免疫应答并且对应于RAS蛋白的片段的肽，其 中：
[0086] 所述肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8个氨基酸的区域，
[0087] 所述区域具有不在所述位置13处的与RAS蛋白的相应区域相同的至少6个氨基酸 残基，并且
[0088]所述肽在对应于所述位置13的氨基酸处具有G13C或G13R点突变。
[0089] 在本发明的第八方面，提供适于引起免疫应答并且对应于RAS蛋白的片段的肽，其 中：
[0090] 所述肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8个氨基酸的区域，
[0091] 所述区域具有不在所述位置13处的与RAS蛋白的相应区域相同的至少6个氨基酸 残基，
[0092]所述肽包含不超过30个氨基酸残基，并且
[0093]所述肽在对应于所述位置13的氨基酸处具有G13C或G13R点突变。
[0094] 在本发明的第九方面，提供T细胞混合物或T细胞制剂，所述T细胞混合物包含对根 据上述的第一至第五方面中的任一方面的肽混合物之一中的各种肽具有特异性的T细胞， 所述T细胞制剂包含对递呈在MHC分子上时的以上所述的根据本发明的第六方面使用的肽 或根据第七或第八方面的肽之一具有特异性的T细胞。
[0095] 在本发明的第十方面，提供药物组合物，所述药物组合物包含根据上述的第一至 第五方面中的任一方面的肽混合物，根据上述第六方面使用的肽，根据上述第七或第八方 面的肽或根据上述第九方面的T细胞混合物或T细胞制剂以及药用载体、稀释剂和/或赋形 剂。
[0096] 优选地，上述的各方面中的任一方面的肽混合物、肽、使用的肽、T细胞混合物、T细 胞制剂或药物组合物用于预防和/或治疗癌症。
[0097] 方便地，所述癌症是肾上腺癌、自主神经节癌、胆管癌、骨癌、乳腺癌、中枢神经系 统癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、造血器官(haematopoietic)癌、淋巴癌、肾癌、大肠 癌、肝癌、肺癌、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、唾液腺癌、皮肤癌、小肠癌、胃癌、睾丸 癌、胸腺癌、甲状腺癌、上呼吸消化道癌和尿道癌和/或恶性黑素瘤。
[0098] 有利地，所述癌症是结直肠癌、肺癌和/或胰腺癌。
[0099] 方便地，根据上述的各方面的肽混合物、肽、使用的肽、T细胞混合物、T细胞制剂或 药物组合物用于预防和/或治疗恶性黑素瘤。
[0100] 在本发明的第十一方面，提供治疗或预防癌症的方法，所述方法包括:施用上述的 根据第一至第五方面中的任一方面的肽混合物，根据第六方面使用的肽，根据第七或第八 方面的肽，根据第九方面的T细胞混合物或T细胞制剂或根据第十方面的药物组合物。
[0101] 在本发明的第十二方面，提供肽混合物、用作疫苗或药物的肽、肽、T细胞混合物、T 细胞制剂或药物组合物，其用于包括以下步骤的方法：
[0102] i)鉴定存在于取自患者的样品中的RAS蛋白突变；
[0103] ii)选择包含含有对应于所述样品中鉴定的RAS蛋白突变中的至少一个的点突变 的肽的根据上述的第一至第五方面中的任一方面的肽混合物;或选择包含对应于所述样品 中鉴定的RAS蛋白突变中的至少一个的点突变的根据上述第六方面使用的肽;或选择包含 对应于所述样品中鉴定的RAS蛋白突变中的至少一个的点突变的根据上述的第七或第八方 面的肽;或选择包含对递呈在MHC分子上时包含对应于所述样品中鉴定的RAS蛋白突变中的 至少一个的点突变的肽具有特异性的T细胞的根据上述的第九方面的T细胞混合物或T细胞 制剂;或选择根据上述的第十方面的药物组合物，所述药物组合物包含含有对应于所述样 品中鉴定的RAS蛋白突变中的至少一个的点突变的肽混合物、用作疫苗或药物的肽或肽，或 包含对递呈在MHC分子上时包含对应于所述样品中鉴定的RAS蛋白突变中的至少一个的点 突变的肽具有特异性的T细胞的T细胞混合物或T细胞制剂，以及
[0104] i i i)向患者施用肽混合物、使用的肽、肽、T细胞混合物或T细胞制剂。
[0105] 在本发明的第十三方面，提供选择用于向患者施用的肽混合物、用作疫苗或药物 的肽、肽、T细胞混合物、T细胞制剂或药物组合物的方法，所述方法包括：
[0106] i)鉴定存在于取自患者的样品中的RAS蛋白突变;和
[0107] ii)选择包含含有对应于所述样品中鉴定的RAS蛋白突变中的至少一个的点突变 的肽的根据上述的第一至第五方面中的任一方面的肽混合物;或选择根据上述的第六方面 使用的肽;或选择根据上述的第七或第八方面的肽;或选择包含对递呈在MHC分子上时包含 对应于所述样品中鉴定的RAS蛋白突变中的至少一个的点突变的肽具有特异性的T细胞的 根据上述的第九方面的T细胞混合物或T细胞制剂;或选择根据上述的第十方面的药物组合 物，所述药物组合物包含含有对应于所述样品中鉴定的RAS蛋白突变中的至少一个的点突 变的肽混合物、用作疫苗或药物的肽或肽，或包含对递呈在MHC分子上时包含对应于所述样 品中鉴定的RAS蛋白突变中的至少一个的点突变的肽具有特异性的T细胞的T细胞混合物或 T细胞制剂。
[0108] 在本发明的第十四方面，提供根据上述的第一至第五方面中的任一方面的肽混合 物、根据上述的第六方面使用的肽或根据上述的第七或第八方面的肽用于制备根据上述的 第九方面的T细胞混合物或T细胞制剂的用途。
[0109] 上述的肽混合物、使用的肽和肽通常分离自其天然环境。
[0110]术语"肽"，当在本文中使用时，是指作为较长的蛋白质的片段(或具有对应于较长 的蛋白质的片段的序列）的氨基酸残基的聚合物。该术语还适用于这样的氨基酸聚合物，其 中一个或多个氨基酸残基是修饰的残基，或非天然存在的残基，如相应的天然存在的氨基 酸的人工化学拟似物，以及天然存在的氨基酸聚合物。
[0111] 两个序列之间的百分比"同一性"可以使用BLASTP算法版本2.2.2(Altschul， Stephen F.,Thomas L.Madden,Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang,Zheng Zhang, Webb Miller和David J.Lipman(1997)，"Gapped BLAST and PSI_BLAST:a new generation of protein database search programs"，Nucleic Acids Res .25:3389-3 4 0 2 )使用默认参数来确定。特别地，可以在互联网上使用U R L h 11 p : / / www · neb i. nlm · nih · gov/b last/来访问 BLAST算法。
[0112] 术语"免疫应答"，当在本文中使用时，在一些实施方案中是指在主要组织相容性 (MHC)分子将肽递呈在细胞表面上后T细胞介导的免疫应答，并且特别地是指在肽的递呈后 的Τ细胞的激活。
[0113] 术语"RAS蛋白"，当在本文中使用时，是指由ras原癌基因编码的那类小GTP酶蛋白 并且包括RAS蛋白的全部三种同种型：HRAS、KRAS和NRAS。在一些实施方案中，术语"RAS蛋 白"是指对应于UniProtKB/Swiss-Prot登录号P01112.1并且如SEQ ID N0:33中所示的蛋白 质。
[0114] 术语"RAS蛋白的位置13"，当在本文中使用时，是指从N端数起，形成野生型RAS蛋 白的一级结构的氨基酸链中的第十三个氨基酸。
[0115] 术语"RAS蛋白的位置12"，当在本文中使用时，是指从N端数起，形成野生型RAS蛋 白的一级结构的氨基酸链中的第十二个氨基酸。
[0116] 术语"RAS蛋白的位置61"，当在本文中使用时，是指从N端数起，形成野生型RAS蛋 白的一级结构的氨基酸链中的第六十一个氨基酸。
[0117] 术语"对应于位置13的氨基酸"，当在本文中使用时，表示RAS蛋白的肽中的位于所 述肽的氨基酸链中在对应于RAS蛋白的氨基酸序列的第十三个氨基酸(从N端数起）的位置 处的氨基酸。术语"对应于位置12的氨基酸"和"对应于位置61的氨基酸"具有相应的含义。
[0118] 术语"肽混合物"，当在本文中使用时，是指被混合但未化学结合的两个以上的肽。 所述混合物可以作为干粉、溶液、悬浮液或胶体呈现，并且可以是均质的或异质的。
[0119] 术语"RAS蛋白突变"，当在本文中使用时，是指在存在于取自受试者的样品中的 RAS蛋白中存在的一个或多个点突变。
[0120] 术语"点突变"，当在本文中使用时，是指蛋白质产物的多肽链中的单个氨基酸残 基被不同的氨基酸残基代替。
[0121]术语，例如，"G12V突变"，当在本文中使用时，是指使得野生型RAS蛋白的位置12处 的甘氨酸(G)被缬氨酸(V)代替的点突变。类似的定义适用于类似的术语，如G13C、G13R、 Q61H 等。
[0122] 术语"药物组合物"，当在本文中使用时，表示适用于出于治疗目的而向目标人或 动物受试者施用的药物制剂。
[0123] 附图简述
[0124] 图1是这样的图，其显示存在于所有癌症中的RAS突变的发生率。
[0125] 图2是这样的图，其显示对应于本发明的两种肽混合物(TG02和TG03)中的肽的在 所有癌症中的RAS突变的相应发生率。
[0126] 图3是这样的图，其显示对应于本发明的两种肽混合物(TG02和TG03)中的肽的在 肺癌中的RAS突变的相应发生率。
[0127] 图4是这样的图，其显示对应于本发明的两种肽混合物(TG02和TG03)中的肽的在 结直肠癌中的RAS突变的相应发生率。
[0128] 图5是这样的图，其显示对应于本发明的两种肽混合物(TG02和TG03)中的肽的在 恶性黑素瘤中的RAS突变的相应发生率。
[0129] 图6是这样的图，其显示在健康供体中，对三轮的利用具有G13C突变的RAS肽（SEQ IDN0:19)和具有G13R突变的RAS肽(SEQIDN0 :27)的混合物的体外刺激的增殖的T细胞响 应。APC:抗原递呈细胞(PBMC)，CPM:计数/分钟。
[0130] 图7是这样的图，其显示在健康供体中，对三轮的利用由G13C肽（SEQ ID NO: 19)， G13D肽（SEQ ID N0:20)，G12A肽（SEQ ID N0:21)，G12C肽（SEQ ID N0:22)，G12D肽（SEQ ID N0:23)，G12R肽（SEQIDN0:24)，G12S肽（SEQIDN0:25)，G12V肽（SEQIDN0:26)和G13R肽 (SEQ ID NO: 27)组成的RAS肽混合物的体外刺激的增殖的T细胞响应。APC:抗原递呈细胞 (PBMC)，CPM:计数 / 分钟。
[0131] 图8是这样的图，其显示在健康供体中，在利用TG02+13R的三轮体外刺激后，对 G13C RAS肽(SEQ ID从):19)的1'细胞响应<^?(：:抗原递呈细胞(？81〇,0?]\1 :计数/分钟。
[0132] 图9是这样的图，其显示取自用RAS肽混合物（TG02;小鼠#4和#7)和TG02 + Viscogel?(小鼠#24、#29和#30)接种的小鼠的脾细胞的增殖性反应。ConA:伴刀豆球蛋白A (阳性对照）。
[0133] 序列表简述
[0134] SEQ ID N0:1显示具有G13C突变的RAS肽的氨基酸序列。
[0135] SEQ ID从):2显示具有6131?突变的1^5肽的氨基酸序列。
[0136] SEQ ID从):3显示具有6130突变的1^5肽的氨基酸序列。
[0137] SEQ ID从):4显示具有613￥突变的1^5肽的氨基酸序列。
[0138] SEQ ID从):5显示具有6134突变的1^3肽的氨基酸序列。
[0139] SEQ ID从):6显示具有6135突变的1^5肽的氨基酸序列。
[0140] SEQ ID从):7显示具有6124突变的1^3肽的氨基酸序列。
[0141] SEQ ID从):8显示具有612(：突变的1^5肽的氨基酸序列。
[0142] SEQ ID从):9显示具有6120突变的1^3肽的氨基酸序列。
[0143] SEQ ID从)：10显示具有6121?突变的1^3肽的氨基酸序列。
[0144] SEQ ID从):11显示具有6123突变的1^3肽的氨基酸序列。
[0145] SEQ ID从):12显示具有612￥突变的1^3肽的氨基酸序列。
[0146] SEQ ID从)：13显示具有〇611?突变的1^3肽的氨基酸序列。
[0147] SEQ ID从)：14显示具有〇611(突变的1^3肽的氨基酸序列。
[0148] SEQ ID从)：15显示具有〇61!1突变的1^3肽的氨基酸序列。
[0149] SEQ ID从)：16显示具有〇611^突变的1^3肽的氨基酸序列。
[0150] SEQ ID从)：17显示具有〇6把突变的1^3肽的氨基酸序列。
[0151] SEQ ID从):18显示具有〇61?突变的1^5肽的氨基酸序列。
[0152] SEQ ID从)：19显示具有613(：突变的了602的1^3肽的氨基酸序列。
[0153] SEQ ID从):20显示具有6130突变的了602的1^3肽的氨基酸序列。
[0154] SEQ ID N0:21显示具有G12A突变的TG02的RAS肽的氨基酸序列。
[0155] SEQ ID从):22显示具有612(：突变的了602的1^肽的氨基酸序列。
[0156] SEQ ID从):23显示具有6120突变的了602的1^肽的氨基酸序列。
[0157] SEQ ID从):24显示具有6121?突变的了602的1^肽的氨基酸序列。
[0158] SEQ ID从):25显示具有6123突变的了602的1^肽的氨基酸序列。
[0159] SEQ ID从):26显示具有612￥突变的了602的1^3肽的氨基酸序列。
[0160] SEQ ID从):27显示具有6131?突变的了603的1^3肽的氨基酸序列。
[0161] SEQ ID从):28显示具有613￥突变的了603的1^3肽的氨基酸序列。
[0162] SEQ ID从):29显示具有0611?突变的了603的1^3肽的氨基酸序列。
[0163] SEQ ID从):30显示具有0611(突变的了603的1^3肽的氨基酸序列。
[0164] SEQ ID从):31显示具有061!1突变的了603的1^3肽的氨基酸序列。
[0165] SEQ ID从):32显示具有0611^突变的了603的1^3肽的氨基酸序列。
[0166] SEQ ID NO:33显示野生型RAS蛋白的全长氨基酸序列。
[0167] 发明详述
[0168] 本发明总体上涉及肽混合物，所述肽混合物包含RAS蛋白的至少第一肽和第二肽， 所述第一肽和第二肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8个氨基酸的区域，其中所述至少第 一肽和第二肽中的每种在位置13处具有点突变，并且其中位置13突变彼此不同。
[0169] 本发明的混合物中的肽可以是HRAS、KRAS或NRAS中的任一种的肽。这三种RAS同种 型在负责GDP/GTP结合的所有区域(即，在癌症中经历突变的区域)中都具有序列同一性。
[0170] 在一些实施方案中，第一肽和第二肽中的每种独立地包含至少8、至少9、至少10、 至少12、至少16、至少17、至少18、至少20、至少24或至少30个氨基酸。在优选的实施方案中， 第一肽和第二肽中的每种包含至少8个氨基酸。在其他优选的实施方案中，第一肽和第二肽 中的每种包含至少17个氨基酸。
[0171 ]在一些实施方案中，第一肽和第二肽中的每种独立地具有不超过30个氨基酸。例 如，在某些实施方案中，第一肽和第二肽中的每种独立地包含不超过28、26、24、22、20、18、 17、16、14、12、10或8个氨基酸。在一些实施方案中，第一肽和第二肽中的每种包含不超过17 个氨基酸。
[0172]在一些实施方案中，第一肽和第二肽中的每种独立地在除了包括位置13的区域以 外的位置处与RAS蛋白具有至少20%、至少25%、至少30%、至少37%、至少50%、至少60%、 至少66%、至少75%、至少85%、至少95%、至少99%或100%序列同一性。在一些实施方案 中，第一肽和第二肽中的每种独立地在除了包括位置13的区域以外的位置处与SEQ ID N0: 1-6之一具有至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少66%、至 少75%、至少85%、至少95%、至少99%或100%序列同一性。在优选的实施方案中，第一肽 和第二肽中的每种独立地在除了包括位置13的区域以外的位置处与SEQ ID N0:1-6之一具 有至少95%序列同一性。在其他实施方案中，第一肽和第二肽中的每种独立地在除了包括 位置13的区域以外的位置处与SEQ ID N0:1-6之一具有100%序列同一性。在一些实施方案 中，第一肽在除了包括位置13的区域以外的位置处与SEQ ID N0:1-6之一具有百分比序列 同一性并且第二肽在除了包括位置13的区域以外的位置处与SEQ ID N0:1-6中不同的一个 具有不同的百分比序列同一性。在其他实施方案中，第一肽在除了包括位置13的区域以外 的位置处与SEQ ID N0:1-6之一具有百分比序列同一性并且第二肽在除了包括位置13的区 域以外的位置处与SEQ ID N0:1-6中不同的一个具有相同的百分比序列同一"性。在所有实 施方案中，第一肽和第二肽中的每种都能够引起免疫应答。
[0173]肽混合物中的第一肽和第二肽中的每种在RAS蛋白的位置13处具有点突变，其中 第一肽中的点突变不同于第二肽中的点突变。野生型RAS蛋白在位置13处包含甘氨酸(G)。 因此，位置13处的突变可以是从甘氨酸到任何其他氨基酸的点突变。然而，发现G13A、G13C、 G13D、G13R、G13S和G13V突变与癌症尤其相关。因此，在优选的实施方案中，第一肽和第二肽 中的每种的点突变独立地是613六、613(：、6130、6131?、6135或613￥突变中的一个。在更优选的 实施方案中，第一肽和第二肽中的一个的位置13处的点突变独立地是G13C或G13R突变。在 特别优选的实施方案中，第一肽或第二肽中的一个的位置13处的点突变是G13C突变。在其 他特别优选的实施方案，第一肽或第二肽中的一个的位置13处的点突变是G13R突变。
[0174] 在一些实施方案中，第一肽或第二肽的位置13处的点突变是G13C突变并且另一个 肽的位置13处的点突变是Gl 3D突变。
[0175] 在其他实施方案中，第一肽或第二肽的位置13处的点突变是G13R突变并且另一个 肽的位置13处的点突变是Gl 3V突变。
[0176] 在另外的实施方案中，第一肽或第二肽的位置13处的点突变是G13C突变，并且另 一个肽的位置13处的点突变是Gl 3R突变。
[0177] 在本发明的备选的实施方案中，肽混合物可以包含RAS蛋白的至少第三肽，所述第 三肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8个氨基酸的区域。所述至少第三肽可以在对应于 RAS蛋白的位置13的氨基酸处具有不同于第一肽和第二肽的位置13突变的点突变。在独立 于第一肽和第二肽的点突变的情况下，所述点突变可以是G13A、G13C、G13D、G13R、G13SS G13V突变中的一种。在一些实施方案中，第一肽具有G13C突变，第二肽具有G13D突变并且第 三肽具有G13R突变。
[0178] 本发明的肽混合物可以另外地包含RAS蛋白的至少一种另外的肽，所述至少一种 另外的肽包含至少8个氨基酸的区域。在一些实施方案中，所述至少一种另外的肽的所述区 域包括RAS蛋白的位置12。在其他实施方案中，所述至少一种另外的肽的所述区域包括RAS 蛋白的位置61。
[0179] 在肽混合物包含至少第三肽的实施方案中，所述肽中的每种独立地包含至少8、至 少9、至少10、至少12、至少16、至少17、至少18、至少20、至少24或至少30个氨基酸。在优选的 实施方案中，所述肽中的每种包含至少8个氨基酸。在其他优选的实施方案中，所述肽中的 每种包含至少17个氨基酸。在另外的实施方案中，所述肽中的每种包含至少18个氨基酸。通 常，肽混合物中的每种肽可以包含与肽混合物中的其他肽中的一个或多个不同数目的氨基 酸。在一些实施方案中，肽混合物中的每种肽包含不超过30个氨基酸。例如，在某些实施方 案中，肽混合物中的每种肽独立地包含不超过28、26、24、22、20、18、17、16、14、12、10或8个 氨基酸。在一些实施方案中，肽混合物中的每种肽包含不超过17个氨基酸。
[0180] 在肽混合物包含至少一种另外的肽而所述至少一种另外的肽包含包括RAS蛋白的 位置12的区域的实施方案中，对应于RAS蛋白的位置12的氨基酸具有点突变。在野生型RAS 蛋白中，位置12的氨基酸是甘氨酸(G)。因此，在一些实施方案中，位置12处的点突变可以是 除甘氨酸以外的氨基酸。在一些实施方案中，各突变独立地是G12A、G12C、G12D、G12R、G12S 或G12V突变。在其他实施方案中，至少一种另外的肽在除了包括位置12的区域以外的位置 处与RAS蛋白具有至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少 66%、至少75%、至少85%、至少95%、至少99%或100%序列同一性。在一些实施方案中，至 少一种另外的肽在除了包括位置12的区域以外的位置处与SEQ ID N0:7-12和21-26之一具 有至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少66%、至少75%、至 少85%、至少95%、至少99%或100%序列同一性。在一些实施方案中，存在超过一种另外的 RAS蛋白的肽，其包含包括RAS蛋白的位置12的至少8个氨基酸的区域并且在对应于RAS蛋白 的位置12的氨基酸处具有点突变。在这样的实施方案中，具有位置12突变的肽中的每种具 有不同的点突变。
[0181] 在肽混合物包含至少一种另外的肽而所述至少一种另外的肽包含包括RAS蛋白的 位置61的至少8个氨基酸的区域的实施方案中，对应于RAS蛋白的位置61的氨基酸具有点突 变。在野生型RAS蛋白中，位置61处的氨基酸是谷氨酰胺(Q)。因此，在一些实施方案中，位置 61处的点突变是突变成除了谷氨酰胺之外的氨基酸。在一些实施方案中，所述点突变是 〇6把、〇61!1、〇611(、〇611^、〇61?或〇611?突变。在其他实施方案中，至少一种另外的肽在除了包 括位置61的区域以外的位置处与RAS蛋白具有至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至 少50 %、至少60 %、至少66 %、至少75%、至少85 %、至少95 %、至少99 %或100 %序列同一 性。在一些实施方案中，至少一种另外的肽在除了包括位置61的区域以外的位置处与SEQ ID N0:13-18和29-32之一具有至少20 %、至少25%、至少30%、至少40%、至少50 %、至少 60 %、至少66%、至少75 %、至少85%、至少95 %、至少99%或100%序列同一性。在一些实施 方案中，存在超过一种另外的RAS蛋白的肽，其包含包括RAS蛋白的位置61的至少8个氨基酸 的区域并且在对应于RAS蛋白的位置61的氨基酸处具有点突变。在这样的实施方案中，具有 位置61突变的肽中的每种具有不同的点突变。
[0182] 在一些实施方案中，肽混合物还包含至少两种RAS蛋白的肽，其各自包含包括RAS 蛋白的位置12或61的至少8个氨基酸的区域。在这样的实施方案中，所述至少两种另外的肽 包含具有包括RAS蛋白的位置12的至少8个氨基酸的区域并且在对应于RAS蛋白的位置12的 氨基酸处具有点突变的至少一种肽，和包含包括RAS蛋白的位置61的至少8个氨基酸的区域 并且在对应于RAS蛋白的位置61的氨基酸处具有点突变的至少一种肽。位置12处的点突变 可以是612六、612(：、6120、6121?、6123或612￥突变中的一种。位置61处的点突变可以是〇6把、 〇61!1、〇611(、〇611^、〇61?或〇611?突变中的一种。包括1^3蛋白的位置12的至少一种肽可以在除 了包括位置12的区域以外的位置处与RAS蛋白具有至少20%、至少25%、至少30%、至少 40%、至少50 %、至少60 %、至少66 %、至少75 %、至少85 %、至少95 %、至少99 %或100 %序 列同一性。在一些实施方案中，包含包括位置12的至少8个氨基酸的区域的至少一种另外的 肽在除了包括位置12的区域以外的位置处与SEQ ID N0:7-12和21-26之一具有至少20%、 至少25 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少66 %、至少75 %、至少85 %、至少 95 %、至少99%或100 %序列同一性。包含包括RAS蛋白的位置61的至少8个氨基酸的区域的 至少一种肽可以在除了包括位置61的区域以外的位置处与RAS蛋白具有至少20%、至少 25 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少66 %、至少75 %、至少85 %、至少95 %、 至少99%或100%序列同一性。在一些实施方案中，包括RAS蛋白的位置61的至少一种另外 的肽在除了包括位置61的区域以外的位置处与SEQ ID N0:13-18和29-32之一具有至少 20 %、至少25 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少66 %、至少75 %、至少85 %、 至少95%、至少99%或100%序列同一性。在本发明的肽混合物中可以预期以上提及的突变 和SEQ ID N0的任意组合。
[0183] 在一些实施方案中，肽混合物由具有G13C突变的肽，具有G13D突变的肽，具有G12A 突变的肽，具有G12C突变的肽，具有G12D突变的肽，具有G12R突变的肽，具有G12S突变的肽 和具有G12V突变的肽组成。在这样的实施方案中，肽混合物由独立地分别在除了包括位置 12或13的区域以外的位置处与SEQ ID勵：1、3、7、8、9、10、11和12具有至少20%、至少25%、 至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少66 %、至少75 %、至少85 %、至少95 %、至少 99%或100%序列同一性的肽组成。在一些实施方案中，肽混合物由独立地分别在除了包括 位置12或13的区域以外的位置处与SEQ ID NO: 19-26具有至少20%、至少25%、至少30%、 至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少66 %、至少75 %、至少85 %、至少95 %、至少99 %或 100%序列同一性的肽组成。当与SEQ ID NO: 19-26具有100%序列同一性时，本发明的该实 施方案在本文中被称为TG02。表4和图2显示优选地存在于TG02中的肽。这些突变在与RAS突 变相关的癌症(肺癌和结直肠癌）中的发生率分别显示在图1、3和4中。用TG02接种小鼠后的 脾细胞增殖测定的结果显示在图9中，并且其显示TG02有效地引起免疫应答。
[0184]在备选的实施方案中，肽混合物由具有G13R突变的肽，具有G13V突变的肽，具有 Q61H突变的肽，具有Q61K突变的肽，具有Q61L突变的肽和具有Q61R突变的肽组成。在这样的 实施方案中，肽混合物由独立地分别在除了包括位置13和61的区域以外的位置处与SEQ ID NO: 2、4、13、14、15和16具有至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、 至少66%、至少75%、至少85%、至少95%、至少99%或100%序列同一性的肽组成。在一些 实施方案中，肽混合物由独立地分别在除了包括位置13或61的区域以外的位置处与SEQ ID NO :27-32具有至少20%、至少25 %、至少30%、至少40 %、至少50 %、至少60%、至少66 %、至 少75%、至少85%、至少95%、至少99%或100%的肽组成。当与SEQ ID N0:27-32具有100% 序列同一性时，本发明的该实施方案在本文中被称为TG03。表5和图2显示TG03的肽。这些突 变在恶性黑素瘤中的发生率显示在图5中。
[0185] 在其他实施方案中，肽混合物由具有G13C突变的肽，具有G13D突变的肽，具有G13R 突变的肽，具有G12A突变的肽，具有G12C突变的肽，具有G12D突变的肽，具有G12R突变的肽， 具有G12S突变的肽和具有G12V突变的肽组成。在这样的实施方案中，肽混合物由独立地分 别在除了包括位置12或13的区域以外的位置处与SEQ ID勵：1、2、3、7、8、9、10、11和12具有 至少20 %、至少25 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少66 %、至少75 %、至少 85 %、至少95%、至少99%或100%序列同一性的肽组成。在一些实施方案中，肽混合物由独 立地分别在除了包括位置12或13的区域以外的位置处与SEQ ID N0:19-27具有至少20%、 至少25 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少66 %、至少75 %、至少85 %、至少 95 %、至少99%或100 %序列同一性的肽组成。利用该实施方案的肽混合物体外刺激PMBC后 的T细胞增殖测定的结果显示在图7中，并且其显示T细胞被该混合物刺激。因此，本发明的 肽混合物有效地引起免疫应答。
[0186] 通常，本发明的肽，在包括位置12、13或61的8个氨基酸的区域内，分别除了在位置 12、13或61处的残基以外，具有与RAS蛋白的相应区域相同的至少6个氨基酸残基。此外，通 常，本发明的肽，在除了包括RAS蛋白的位置12、13或61的区域以外的位置处，独立地分别与 SEQ ID N0:1-32之一具有至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、 至少66%、至少75%、至少85%、至少95%、至少99%或100%。
[0187] 在一些实施方案中，肽混合物由第一、第二、第三肽和第四肽组成，其中第一肽和 第二肽如上所述。第三肽和第四肽中的每种包含包括RAS蛋白的位置13的至少8个氨基酸的 区域，并且第三肽和第四肽中的每种独立地在除了包括位置13的区域以外的位置处与RAS 蛋白具有至少20%、至少25 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少66 %、至少 75 %、至少85%、至少95 %、至少99%或100 %序列同一性。第三肽和第四肽中的每种可以独 立地在除了包括位置13的区域以外的位置处与SEQ ID N0:l-6、19、20、27或28之一具有至 少20 %、至少25 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少66 %、至少75 %、至少 85 %、至少95%、至少99 %或100%序列同一性。第三肽和第四肽中的每种在对应于RAS肽的 位置13的氨基酸处具有点突变，并且第一肽、第二肽、第三肽和第四肽中的每种具有不同于 其他肽的点突变的点突变。在一个实施方案中，第一肽是具有G13R突变的肽，第二肽是具有 G13A突变的肽，第三肽是具有G13S突变的肽并且第四肽是具有G13V突变的肽。
[0188] 在一些实施方案中，在肽混合物中最多有8种不同的肽。在一些实施方案中，在肽 混合物中最多有9种不同的肽。在其他实施方案中，最多有10、12、14或16种不同的肽。在肽 混合物包含至少一种另外的肽而所述至少一种另外的肽包含包括RAS蛋白的位置12的区域 的实施方案中，肽混合物包含1、2、3、4、5或6种肽，所述肽包含包括1^3肽的位置12的至少8 个氨基酸的区域并且在对应于RAS蛋白的位置12的位置处具有点突变。在肽混合物包含至 少一种另外的肽而所述至少一种另外的肽包含包括RAS蛋白的位置61的至少8个氨基酸的 区域的实施方案中，肽混合物包含1、2、3、4、5或6种肽，所述肽包含包括RAS蛋白的位置61的 区域并且在对应于RAS蛋白的位置61的氨基酸处具有点突变，其中所述肽中的每种具有不 同的点突变。
[0189] 在一些实施方案中，包含包括RAS肽的位置13的至少8个氨基酸的区域的肽包含 RAS蛋白的位置1至30。在备选的实施方案中，包含包括RAS蛋白的位置13的至少8个氨基酸 的区域的肽包含RAS蛋白的位置5至21。在另外的实施方案中，对应于RAS蛋白的位置13的氨 基酸在所述肽的C末端。在另外的实施方案中，对应于RAS蛋白的位置13的氨基酸在所述肽 的N末端。通常，具有包括RAS蛋白的位置13的至少8个氨基酸的区域可以由包括位置13在内 的RAS蛋白的任意8个位置组成。例如，具有包括位置13的至少8个氨基酸的区域可以由RAS 蛋白的位置6至位置13、位置7至位置14、位置8至位置15、位置9至位置16、位置10至位置17、 位置11至位置18、位置12至位置19或位置13至位置20的氨基酸组成。
[0190] 在一些实施方案中，包含包括RAS肽的位置12的至少8个氨基酸的区域的肽包含 RAS蛋白的位置1至30。在其他实施方案中，包含包括RAS蛋白的位置12的至少8个氨基酸的 区域的肽包含RAS蛋白的位置5至21。在备选的实施方案中，对应于RAS蛋白的位置12的氨基 酸在所述肽的C末端。在另外的实施方案中，对应于RAS蛋白的位置12的氨基酸在所述肽的N 末端。通常，具有包括RAS蛋白的位置12的至少8个氨基酸的区域可以由包括位置12在内的 RAS蛋白的任意8个位置组成。例如，具有包括位置12的至少8个氨基酸的区域可以由RAS蛋 白的位置5至位置12、位置6至位置13、位置7至位置14、位置8至位置15、位置9至位置16、位 置10至位置17、位置11至位置18或位置12至位置19的氨基酸组成。
[0191] 在一些实施方案中，包含包括RAS肽的位置61的至少8个氨基酸的区域的肽包含 RAS蛋白的位置47至76。在其他实施方案中，包含包括RAS肽的位置61的至少8个氨基酸的区 域的肽包含RAS蛋白的位置53至69。在备选的实施方案中，对应于RAS蛋白的位置61的氨基 酸在所述肽的C末端。在另外的实施方案中，对应于RAS蛋白的位置61的氨基酸在所述肽的N 末端。通常，具有包括RAS蛋白的位置61的至少8个氨基酸的区域可以由包括位置13在内的 RAS蛋白的任意8个位置组成。例如，具有包括位置61的至少8个氨基酸的区域可以由RAS蛋 白的位置54至位置61、位置55至位置62、位置56至位置63、位置57至位置64、位置58至位置 65、位置59至位置66、位置60至位置67或位置61至位置68的氨基酸组成。
[0192] 本发明的肽混合物可以以相等的或不同的比例包含所述肽。在一些实施方案中， 第一肽和第二肽以等比例存在于混合物中，即各种肽包含肽混合物的肽组分的50%。在其 他实施方案中，与第二肽相比，在肽混合物中存在更大比例的第一肽。例如，第一肽可以包 含肽混合物的肽组分的至少55%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。在备选的实 施方案中，与第一肽相比，在肽混合物中存在更大比例的第二肽。例如，第二肽可以包含肽 混合物的肽组分的至少55%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。在包含至少一种 另外的肽的实施方案中，肽以等比例存在于肽混合物的肽组分中。在其他实施方案中，第一 肽、第二肽和至少一种另外的肽以彼此不同的比例存在。例如，第一肽、第二肽和至少一种 另外的肽中的每种可以独立地包含肽混合物的肽组分的至少1 %、至少5%、至少10%、至少 20%至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。
[0193] 备选的实施方案包括包含至少五种RAS蛋白的肽的肽混合物，其中五种肽中的每 种包含包括RAS蛋白的位置13的至少8个氨基酸的区域。所述至少五种肽中的每种独立地在 除了包括位置13的区域以外的位置处与RAS蛋白具有至少20%、至少25%、至少30%、至少 40%、至少50 %、至少60 %、至少66 %、至少75 %、至少85 %、至少95 %、至少99 %或100 %序 列同一性，和/或独立地在除了包括位置13的区域以外的位置处与SEQ ID N0:1-6、19、20、 27和28之一具有至少20%、至少25 %、至少30%、至少40 %、至少50 %、至少60%、至少66 %、 至少75%、至少85%、至少95%、至少99%或100%序列同一1性。所述至少五种肽中的每种在 对应于RAS蛋白的位置13的氨基酸处具有点突变，所述点突变独立地选自G13A、G13C、G13D、 G13R、G13S或G13V突变，并且每种肽的点突变不同于其他肽的点突变。
[0194] 在另一个实施方案中，适于引起免疫应答的肽混合物由六种RAS蛋白的肽组成，其 中每种肽包含包括RAS蛋白的位置12的至少8个氨基酸的区域。所述肽中的每种独立地在除 了包括位置12的区域以外的位置处与RAS蛋白具有至少20%、至少25%、至少30%、至少 40%、至少50 %、至少60 %、至少66 %、至少75 %、至少85 %、至少95 %、至少99 %或100 %序 列同一性，和/或独立地在除了包括位置12的区域以外的位置处与SEQ ID NO:7-12和21-26 之一具有至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少66%、至少 75 %、至少85 %、至少95 %、至少99 %或100 %序列同一性。所述肽中的每种在对应于RAS蛋 白的位置12的氨基酸处具有点突变，所述点突变选自612六、612(：、6120、6121?、6123或612￥突 变，并且每种肽的点突变不同于其他肽的点突变。
[0195] 在另一个实施方案中，适于引起免疫应答的肽混合物由RAS蛋白的第一肽、第二 肽、第三肽和第四肽组成，其中第一肽、第二肽和第三肽中的每种包含包括RAS蛋白的位置 12的至少8个氨基酸的区域，并且RAS蛋白的第四肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8个氨 基酸的区域。第一肽、第二肽、第三肽和第四肽中的每种独立地分别在除了包括位置12或13 的区域以外的位置处与RAS蛋白具有至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、 至少60 %、至少66 %、至少75 %、至少85 %、至少95 %、至少99 %或100 %序列同一性，和/或 独立地分别在除了包括位置12或13的区域以外的位置处分别与SEQIDN0:7-12、21-26、l-6、19、20、27和28之一具有至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、 至少66 %、至少75 %、至少85 %、至少95 %、至少99 %或100 %序列同一性。第一肽、第二肽、 第三肽和第四肽中的每种分别在对应于RAS蛋白的位置12或13的氨基酸处具有点突变。在 一些实施方案中，第一肽是具有G12A突变的肽，第二肽是具有G12R突变的肽，第三肽是具有 G12S突变的肽，并且第四肽是具有G13C突变的肽。
[0196] 在本发明的另一方面，提供适于引起免疫应答的肽，所述肽对应于RAS蛋白的片 段。所述肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8个氨基酸的区域，并且所述至少8个氨基酸的 区域具有不在位置13处的与RAS蛋白的相应区域相同的至少6个氨基酸残基。所述肽在对应 于RAS蛋白的位置13的氨基酸处具有点突变，所述点突变是G13C或G13R突变中的一种。在一 些实施方案中，所述肽具有G13C突变。在其他实施方案中，所述肽具有G13R突变。用这样的 肽刺激T细胞引起增殖反应（图8)，表明根据本发明的该方面的肽能够引起免疫应答。在一 些实施方案中，对应于RAS蛋白的片段并且包含包括RAS蛋白的位置13的至少8个氨基酸的 区域的肽包含不超过30个氨基酸残基。例如，在某些实施方案中，所述肽包含不超过28、26、 24、22、20、18、17、16、14、12、10或8个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含不超过17个氨 基酸。
[0197] 在另外的实施方案中，提供用作疫苗或药物的肽。所述肽对应于RAS蛋白的片段并 且包含至少包括RAS蛋白的位置13的氨基酸的区域。所述至少8个氨基酸的区域具有不在位 置13处的与RAS蛋白的相应区域相同的至少6个氨基酸残基。所述用作疫苗或药物的肽在对 应于RAS蛋白的位置13的氨基酸处具有点突变，所述点突变是G13C或G13R突变之一。
[0198] 本发明的肽是对应于由MHC II分子展示在细胞表面上的RAS蛋白片段的肽。因此， 本发明的肽是这样的肽，其对应于由RAS蛋白的胞内蛋白水解分解产生的蛋白片段，所述片 段之后可以被展示在HLA分子上，并且对于所述片段，个体通常在其T细胞库中具有反应性T 细胞。如图6-8中所示，根据本发明的实施方案的肽混合物和肽引起T细胞增殖反应，同时用 本发明的实施方案的肽混合物接种小鼠引起脾细胞增殖(图9)。
[0199 ]在本发明的另一方面，提供T细胞混合物或T细胞制剂，所述T细胞混合物包含对根 据以上公开的肽混合物之一中的各种肽具有特异性的T细胞，所述T细胞制剂包含对递呈在 MHC分子上时的根据以上公开的肽具有特异性的T细胞。所述T细胞混合物或制剂可以通过 用包含RAS蛋白的第一肽和第二肽的肽混合物或RAS蛋白的肽刺激至少一种反应性T细胞来 制备。例如，在一个实施方案中，T细胞混合物包含多种T细胞，其中第一T细胞和第二T细胞 分别对对应于RAS蛋白的片段的第一肽和第二肽具有特异性，其中每种肽包含包括RAS蛋白 的位置13的至少8个氨基酸的区域，其中第一 T细胞和第二T细胞中的每种对在对应于所述 位置13的肽的氨基酸处的点突变具有特异性，并且第一 T细胞对其具有特异性的点突变不 同于第二T细胞对其具有特异性的点突变。在另一个实施方案中，例如，T细胞制剂包含多种 对对应于RAS蛋白的片段的肽具有特异性的T细胞，其中所述肽包含包括RAS蛋白的位置13 的至少8个氨基酸的区域，其中每种T细胞对对应于所述位置13的肽的氨基酸处的点突变具 有特异性。
[0200]本发明的肽混合物、肽、T细胞混合物和T细胞制剂被用于治疗和/或预防癌症，并 且特别是与RAS癌基因中的突变相关的癌症。癌症可以包括肾上腺癌、自主神经节癌、胆管 癌、骨癌、乳腺癌、中枢神经系统癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、造血器官 (haematopoietic)癌、淋巴癌、肾癌、大肠癌、肝癌、肺癌、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺 癌、唾液腺癌、皮肤癌、小肠癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、上呼吸消化道癌和尿道癌 和恶性黑素瘤，并且本发明的肽混合物、肽、T细胞混合物和T细胞制剂可以用于预防和/或 治疗这些类型的癌症中的超过一种。在一些实施方案中，本发明的肽混合物(其中第一肽和 第二肽之一具有G13C突变）、本发明的肽(其中所述肽具有G13C突变）、T细胞混合物(其中第 一 T细胞和第二T细胞之一对具有G13C突变的肽具有特异性)或T细胞制剂(其中T细胞对具 有G13C突变的肽具有特异性)被用于预防和/或治疗癌症。在这样的实施方案中，优选的是， 所述癌症是结直肠癌、肺癌和胰腺癌中的一种或多种。在另一个实施方案中，本发明的肽混 合物(其中第一肽和第二肽之一具有G13R突变）、本发明的肽(其中所述肽具有G13R突变）、Τ 细胞混合物(其中第一 Τ细胞或第二Τ细胞之一对具有G13R突变的肽具有特异性)或Τ细胞制 剂(其中Τ细胞对具有G13R突变的肽具有特异性)可以用于预防和/或治疗癌症。在这样的实 施方案中，优选的是，所述癌症是恶性黑素瘤。特别地，已经发现，被称为TG02的肽混合物覆 盖99%的与RAS蛋白中的突变相关的癌症，以致其具有广泛用途，而被称为TG03的肽混合物 覆盖14%的与RAS蛋白中的突变相关的癌症。因此，在一个实施方案中，TG02可以被用于预 防和/或治疗癌症。在优选的实施方案中，所述癌症是肺癌、结直肠癌和胰腺癌中的一种或 多种。在另一个实施方案中，TG03可以被用于预防或治疗癌症。在优选的实施方案中，所述 癌症是恶性黑素瘤。
[0201 ]还提供包含上述肽混合物、肽、Τ细胞混合物或Τ细胞制剂的药物组合物。此种药物 组合物还可以包含至少一种药用载体、稀释剂和/或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合 物还包含一种或多种另外的活性成分和/或佐剂。在某些实施方案中，药物组合物还可以包 含一种或多种对相同的疾病适应征具有疗效的成分。在一个实施方案中，本发明的药物组 合物还可以包含一种或多种另外的化疗剂、一种或多种抗体、一种或多种小分子和/或一种 或多种免疫刺激剂(例如，细胞因子）。在一些实施方案中，所述肽混合物或药物组合物可以 与其他形式的免疫疗法联合使用。如图9中所示，利用根据本发明的实施方案的肽混合物进 行接种引起脾细胞增殖，表明本发明的肽能够引起免疫应答。
[0202]已经发现某些类型的癌症与RAS蛋白的某些突变相关，并且更新的发现是G13C和 G13R突变区别性地与癌症相关，以致G13C突变在一些类型的癌症中更常见而G13R突变在另 一些类型的癌症中更常见。因此，有可能使肽混合物、肽、Τ细胞混合物和Τ细胞制剂适于靶 向特定类型的癌症。因此，本发明提供这样的益处，即疫苗和治疗对患者的癌症类型更特 异。这意味着仅需要较少的肽和Τ细胞就可以保证疫苗和/或治疗是有效的，这提供了这样 的益处，即在疫苗和/或治疗中包含较少的无关的肽和/或Τ细胞。这又减少了免疫显性的问 题，因为可以在内部彼此竞争的肽较少。此外，所需的肽和/或Τ细胞的数目减少意味着更便 宜地生产药物和治疗。
[0203]本发明的肽混合物、肽或药物组合物可以通过本领域技术人员已知的任何合适的 递送技术施用于受试者。例如，与其他技术相比，可以通过注射以溶液的形式、以脂质体的 形式或以干燥的形式(例如，以包衣颗粒的形式等)将肽混合物、肽或药物组合物施用于受 试者。在一些实施方案中，可以以，例如，lyg至lg的每种肽，每三天一次、每周一次、每月一 次、每三个月一次、每四个月一次或每六个月一次的量施用所述肽混合物、肽或药物组合 物。
[0204] 本发明的T细胞混合物和T细胞制剂可以通过静脉内注射和/或输注施用，并且可 以以例如1〇6至1〇 12个对肽混合物的肽或肽具有特异性的各种T细胞，每月一次、每两个月一 次、每三个月一次、每六个月一次或每年一次的量施用。优选地，所述剂量每月一次地施用2 至5个月，并且随后以较低的频率施用。
[0205] 如上所提及的，不同类型的癌症与RAS蛋白的不同突变相关的发现意味着疫苗和 治疗可以靶向具体癌症。因此，在本发明的另一方面，提供用于包括癌症的诊断和合适治疗 的选择的方法的肽混合物、肽、T细胞混合物和/或T细胞制剂。所述方法包括以下步骤:a)鉴 定存在于取自患者的样品中的RAS蛋白点突变，和b)选择包含肽的如上所述的肽混合物，选 择如上所述的肽，选择包含对肽具有特异性的T细胞的如上所述的T细胞混合物和/或选择 包含对肽具有特异性的T细胞的如上所述的T细胞制剂，所述肽包含对应于样品中鉴定的至 少一种RAS蛋白点突变的点突变。例如，如果发现取自受试者的样品含有具有G13C突变的 RAS蛋白，则将选择包含肽的肽混合物、肽和/或包含对肽具有特异性的T细胞的T细胞混合 物和/或制剂(所述肽包含G13C突变）。在样品含有例如包含G13C突变和G12R突变的RAS蛋白 的情况中，选择包含含有G13C突变的肽和含有G12R突变的肽的肽混合物和/或包含对包含 G13C突变的肽具有特异性的T细胞和对包含G12R突变的肽具有特异性的T细胞的T细胞混合 物。所述方法还可以包括将包含所选的肽混合物、肽和/或T细胞混合物和/或制剂的药物组 合物施用于患者的步骤。
[0206] 在本发明的另外的方面，提供包括如本文所述的肽混合物、肽、T细胞混合物和/或 T细胞制剂的试剂盒。所述肽混合物、肽、T细胞混合物和/或T细胞制剂可以原样地存在于试 剂盒中，或所述肽混合物、肽、T细胞混合物和/或T细胞制剂可以作为药物制剂存在于试剂 盒中。在一些实施方案中，肽混合物、肽、T细胞混合物和/或T细胞制剂可以被包装在例如小 瓶、瓶、烧瓶中，所述小瓶、瓶、烧瓶可以被进一步包装，例如，被包装在箱子、封套或袋子中。 在一些实施方案中，所述试剂盒包含肽混合物和/或T细胞混合物，其中所述肽和/或T细胞 被提供在分开的容器中，以使得由使用者来混合肽和/或T细胞。
[0207] ^
[0208] 表1. SEQ ID从)：1-6的位置13突变的1^3肽 [0210]表2. SEQ ID N0:7-12的位置 12突变的RAS肽
[0212] 表3. SEQ ID从)：13-18的位置61突变的1^3肽
[0214] 表4. TG02中包含的肽
[0216] 表5. TG03中包含的肽
实施例
[0218] 实施例1
[0219] 在该实施例中，自4名正常人供体收集暗黄覆盖层(buffy coat)(暗黄1、暗黄2、暗 黄3和暗黄4)并在体外培养。利用单个RAS肽或RAS肽的混合物体外刺激PBMC，并进行T细胞 增殖测定。结果显示在图6-8中。
[0220] 越
[0221] 设备/试剂
[0222] -Hettich Rotina 420(半径210)或同等物
[0223] -K0JAIR Silverline Blue Series层流罩或同等物
[0224] -C〇2培养器，Forma Scientific Model 3111 或同等物
[0225] -水浴 37°C
[0226] -K0VA Glasstic载玻片（目录号87144E，Hycor Biomedical Inc，Garden Grove， USA)
[0227] -TopCount，微板闪烁计数器（Packard Instrument Company，Meriden，USA)
[0228] -Cell Harvester Filtermate 196Harvester，（Packard Instrument Company， Meriden?USA)
[0229] -Unifilter GF/C(目录号6_005174，Nerliens Meszansky，0slo，Norway)或同等 物
[0230] -Microscint-0闪烁液（scinti 11ation liquid)(目录号6013611，Nerliens Meszansky，0s lo，Norway)或同等物
[0231 ] -Topseal_A(目录号6005185，Nerliens Meszansky，0slo，Norway)或同等物
[0232] -3H-胸苷（目录号ART178_D，Nerliens Meszansky，0slo，Norway)或同等物
[0233] -CellGro DC培养基（目录号0020801_0500，CellGenix GmbH，Freiburg，Germany) 或同等物
[0234] -RPMI_1640(目录号：E15_840)PAA Labs，Linz，Austria)或同等物
[0235] -二甲亚讽（DMS0)(目录号：D5879-500ML，Sigma-Aldrich Norway AS，Oslo， Norway)或同等物
[0236] -易咳净(Mucomyst)(目录号019249，Meda AS，Asker，Norway)或同等物
[0237] -重组人白介素-2(IL-2, Proleukinl!)，（Chiron Therapeutics，Emeryville，USA) 或同等物
[0238] -4-(2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES)缓冲液1M(目录号Sll-001，Fisher Scientific AS，0slo，Norway)或同等物
[0239] -IL_7(目录号207-IL_025，R&D Systems Europe Ltd，Abingdon，UK)或同等物
[0240] -Gentamucin 40mg/ml(目录号Sanofi Aventis Norge AS，Lysaker，Norway)或同 等物
[0241 ]-人血清白蛋白20%，（目录号SW2G0013，Baxter AS，0slo，Norway)或同等物
[0242] -24孔组织培养板（目录号734-1605，VWR International AS，0slo，Norway)或同 等物
[0243] -96孔圆底微板（目录号734_1797，VWR International AS，0slo，Norway)或同等 物
[0244] -葡萄球菌肠毒素 C型（SEC_3)(目录号CT333，Toxin Technology Inc，Sarasota， USA) 〇
[0245] 用于培养的完全CellGro DC培养基:
[0246] 将以下各项添加至500ml的CellGro DC培养基中达终浓度：
[0247] 庆大霉素50μg/ml (添加630yL的40mg/ml储液至500mL培养基）
[0248] 易咳净1.6mg/ml (添加4mL的200mg/ml储液至500mL培养基）
[0249] HEPES缓冲液0.01M(添加5ml的1M储液至500mL的培养基）
[0250] 丝星
[0251] a.解冻冷冻的PBMC
[0252] 必须在室温进行该过程直至第5点。所有对细胞的开放性操作在直立式层流罩中 进行。
[0253] 1.快速转移小瓶至37 °C水浴，各小瓶具有来自暗黄覆盖层(暗黄1、暗黄2、暗黄3和 暗黄4)的冷冻的PBMC。
[0254] 2.以有规律的间隔（约2-3分钟)手动晃动小瓶并且在尚有些许冰存在时将其从水 浴中移出。
[0255] 3.当所有冰融化后，将lml的CellGro DC培养基逐滴转移至细胞悬液中。
[0256] 4.将细胞悬液转移至盛有20ml的CellGro DC培养基的50ml管中。
[0257] 5.将细胞以500G在室温离心5min。
[0258] 6.将细胞重悬在5ml CellGro DC培养基中。
[0259] 7.使用Biirker小室或K0VA Galsstic载玻片对存活的细胞的数目进行计数并在完 全CellGro DC培养基（见配方）中将细胞浓度调整至2xl06细胞/ml。总细胞数：暗黄l-45x 1〇6,暗黄 2-27·5χ 106,暗黄 3-40·5χ 106,暗黄 4-40·5χ 106 个细胞。
[0260] b.大体积培养以增加 RAS肽反应性T细胞的数目
[0261] 1.将lml解冻的PBMC(2xl06个细胞/ml，在DC培养基中）转移至24孔板的各个孔中。
[0262] 表6.再刺激:利用肽混合物刺激的孔的数目.
[0265] 2.添加20μ1的13C和13R肽中的一种或20μ1 13R和60μ1 TG02-混合物至孔中，终浓 度为每种肽?〇μΜ。
[0266] 3.在加湿的培养器中以37°C/5%C02培养细胞达3天
[0267] 4.第3天:添加终浓度为20iU/ml的重组人白介素-2(rIL-2)(即取1000iU/ml的储 液50μ1)和终浓度为5ng/ml的重组人IL-7 (即取500μg/ml的储液?ομL)至细胞培养物并以37 °C /5 % C02继续温育。如果细胞生长良好，则此步骤是任选的。
[0268] 5.第4-6天:在显微镜下有规律地检查细胞并在需要时分细胞(从各孔中取出500μ 1并用500μ1补充有40iU/ml IL-2和IL-7的新鲜CellGro DC培养基代替）。
[0269] 6.第7-14天:每天检查细胞并将细胞生长缓慢的孔混合在一起。
[0270] (：.1)3天1'细胞增殖测定
[0271 ] 1.将来自步骤b.的大体积培养的T细胞收集、洗涤并计数；
[0272] 表7: T细胞总数
[0274] 2.将5x 104个来自大体积培养的T细胞转移到圆底96孔板的每个孔中。
[0275] 3.将1小瓶在CellGro DC培养基中的的自体PBMC样品解冻。照射PBMC(30Gy)，计数 并添加5x 104个细胞至各孔并用DC培养基调节至200μ1/孔的总体积。
[0276] 4.根据平板布置，一式三份地制备以下样品：
[0277] -阴性对照：
[0278] 仅Τ细胞
[0279] 来自各个时间点的Τ细胞+照射的PBMC
[0280] -阳性对照：
[0281] 来自各个时间点的Τ细胞+照射的PBMC+lμg/ml SEC-3.
[0282] -试验样品：
[0283] 来自各个时间点的T细胞+照射的PBMC(10yM的各种肽）：
[0284] I)用于用13C+13R: 13C+13R混合物或单一 G13C肽刺激的大体积培养物
[0285] II)用于用TG02+13R:TG02+13R、13C+13R混合物或单一 G13C肽刺激的大体积培养 物
[0286] 将细胞在37 °C /5 % C02温育48小时。
[0287] 5.添加 20yL 的 3H-胸苷（3.7x 104Bq)。
[0288] 6.在 37°C/5%C02 温育 17 小时。
[0289] 7 ·使用Filtermate 196Harvester收获细胞至Unifilters并在45 °C干燥滤器直至 完全干燥(通常这在1.5小时后实现，但是这之后在45°C放置的小时数不重要，因此平板可 以在60小时后计数）。
[0290] 8.用粘性覆盖物（与Unifilters-起提供的）覆盖Unifilters的底部并向各孔添 加25μ1微闪烁液。用TopSeal覆盖平板并将滤器放置在TopCount Packard微板闪烁β计数器 中。进入测定向导程序。选择方案/程序3Η胸苷，一式三份。进入报告定义和ASCII文件输出。 在目录下，选择数据文件夹(每个使用者应当具有单独的文件夹）。为要保存的实验文件选 择名称。叠式存储器开启或关闭（如果超过一个平板，使用叠式存储器）。开始测定程序。 [0291 ] ii)大体积培养物的第二次刺激
[0292] 将剩余的细胞（1-2χ106个T细胞/孔）用自体PBMC(1百万个/孔)和肽混合物再刺激 一次(如步骤b.中所述）。
[0293] 表8:刺激-用肽混合物刺激的孔数
[0295] 1.将细胞在加湿的培养器中在37°C/5%C02培养3天(如步骤b.中所述）。
[0296] 2.第17天:添加终浓度为40iU/ml的重组人白介素-2和终浓度为5ng/ml的重组人 IL-7至细胞培养物并且在37 °C/5 %⑶:^继续培育。在显微镜下规律地检查细胞并且在需要 时分细胞。
[0297] 3.第19-21天:从各孔中取出500μ1并且用500μ1补充有40iU/ml IL-2和IL-7的新 鲜CellGro DC培养基代替。
[0298] 4.第22-27天:每天有规律地检查细胞，并且将T细胞生长缓慢的孔混合在一起(如 步骤b.中）。
[0299] ^"天找田胞增殖测定
[0300] 1.将大体积培养物中的T细胞收集、洗涤和计数。
[0301] 表9:细胞总数
[0303] 2.将来自大体积培养物的5x 104个T细胞转移到圆底96孔板的每个孔中。
[0304] 3.将1小瓶在CellGro DC培养基中的自体PBMC样品解冻。照射PBMC(30Gy)，计数并 添加5x 104个细胞至各孔并用DC培养基调节至200μ1/孔的总体积(如步骤c. i)中所述）。 [0305] ii)第27-42天:大体积培养物的第三次刺激
[0306]将剩余的细胞（1-2百万个T细胞/孔）用自体PBM(1百万个/孔)和肽混合物再刺激 一次(如步骤b.中所述）
[0307]表10:刺激-刺激的孔的数目
[0309] e) 3天T细胞增殖测定
[0310] 1.将大体积培养物中的T细胞收集、洗涤并计数。
[0311] 表11:细胞总数
[0313] 2.将来自大体积培养物的5x 104个T细胞转移到圆底96孔板的每个孔中。
[0314] 3.将1小瓶的在CellGro DC培养基中的自体PBMC样品解冻。照射PBMC(30Gy)，计数 并将5x 104个细胞添加至各孔中并用DC培养基调节至200μ1/孔的总体积(如步骤c.i)中所 述)。
[0315]
[0316] 大体积培养物的三轮刺激后的利用肽混合物的T细胞增殖测定的结果分别显示在 表12-14和图6-8中。表12-14显示每次重复的每分钟计数(CPM)，以及每名供体的平均CPM。
[0317] 表12:用由13C和13R肽组成的肽混合物刺激后的每分钟计数(CPM)。在大体积培养 物的三轮体外刺激期间，用TG02+13R肽混合物来刺激供体#3，而用13C+13R肽混合物来刺激 供体#4。
[0319]表 13:用由 13(：、130、12六、12(：、120、121?、125、12￥和131?(即了602+131〇肽组成的肽混 合物进行刺激后的每分钟计数(CPM)。在大体积培养物的三轮体外刺激期间，用TG02+13R肽 混合物来刺激供体#3。
[0322]表14:用13C肽刺激后的每分钟计数(CPM)。在大体积培养物的三轮体外刺激期间， 用TG02+13R肽混合物来刺激供体#3。
[0324] 确认了阳性对照的结果但是由于缩放比例（scaling)的原因其没有被包括在图6-8中。如可见的，肽混合物和单一肽二者都可以引起T细胞增殖，表明所述肽和肽混合物能够 在人中引起免疫应答。
[0325] 实施例2
[0326]在该实施例中，用TG02在皮下重复接种小鼠，以便分析免疫应答。在接种后，收获 脾细胞，并测量脾细胞的增殖性反应。结果显示在图9中。
[0327] 越
[0328] 试验项表征 [0329]名称：TG02
[0330] 产品：TG02 由等量（重量）的 8种不同的肽（12A、12C、12D、12R、12S、12V、13C、13DHi 成
[0331] 批次号：12A:批号 1034804; 12C:批号 1034803;
[0332] 12D:批号 1034801 ;12R:批号 1034802;
[0333] 12S:批号 1034805; 12V:批号 1034800;
[0334] 13C:批号 1050468; 13D:批号 1034806
[0335] 治疗适应证:癌症
[0336] 物理状态:粉末 [0337]颜色：白色
[0338] 纯度:每个小瓶净80mg肽(每种肽净10mg)
[0339] 存储条件：-15 °C--20 °C并且避光
[0340] 有效期限：31.12.2014
[0341]安全预防:常规卫生程序足以保证个人健康和安全。
[0342] 载体1表征
[0343] 名称：ViscoGel
[0344] 批次号：VG14056
[0345] 治疗适应证:癌症
[0346] 物理状态:凝胶颗粒 [0347]颜色:无色
[0348] 水含量:99 %
[0349] 存储条件：2-8 Γ
[0350] 有效期限：01.06.2015
[0351] 安全预防:常规卫生程序足以保证个人健康和安全。
[0352] 载体2表征 ] 该研究中使用的载体2将是注射用水(aqua ad injectionem)。以下列出由供应商 提供的说明：
[0354] 名称:注射用水
[0355] 物理状态:液体
[0356] 存储条件:室温
[0357] 安全预防:常规卫生程序足以保证个人健康和安全。
[0358] 试验项的制备
[0359] 将5ml注射用水添加至一小瓶TG02(80mg)并且轻柔地转动（避免泡沫形成）从而获 得16mg TG02/mL的均质储液。
[0360] 对于第1组的动物(见表12)，用注射器抽取lmL TG02储液并将其与lmL注射用水混 合从而获得8mg/mL的终浓度。
[0361] 对于第2组和第3组的动物（参见表12)，用注射器抽取lml TG02储液并将其与lmL Vi scoGe 1?混合从而获得8mg/mL的终浓度。
[0362] 认为试验项制剂在2-8 Γ稳定达6h。
[0363] 试验体系
[0364] 物种/品系：健康的BALB/c小鼠（完全屏障)BALB/cAnNCrl
[0365] 来源：Charles River，97633Sulzfeld，德国
[0366] 性别:雌性
[0367] 治疗期开始时的年龄:约6-8周龄
[0368] 动物数:30(每组10只动物）
[0369] 动物来源于受控的保持完全屏障的繁育系统（SPF)。根据德国关于动物福利的法 案的第9.2条，第7项(Art.9.2，No.7of the German Act on Animal Welfare)，所述动物的 繁育是出于实验目的。
[0370] 圈养和喂饲条件
[0371] -有空调的房间中的完全屏障。
[0372] -温度：22±3Γ。
[0373] -相对湿度：55 ±10 %。
[0374] -人造光，顺序为12小时亮，12小时暗。
[0375] -换气：10x/小时。
[0376] -自由接近用于大鼠和小鼠的Altromin 1324维持饮食。
[0377] -自由接近自来水，硫酸化至约2.8的pH(饮用水，城市残余物控制、规律间隔的微 生物控制）。
[0378] -将动物以每笼5只动物成组地保持在Altromin锯纤维垫上的IVC笼、II L型、聚砜 笼中。
[0379] -食物、水和垫子的证书在BSL BI0SERVICE处提交。
[0380]-在实验室条件下的足够的适应期(至少5天）。
[0381]动物的分配和识别
[0382]将在给药前显示病理征候的动物从研究中排除。提供来自同一递送的补充动物作 为交换。
[0383]用耳标记给每只动物做标记以用于个体识别。
[0384] 实验过程
[0385] 用3组进行研究，每组包含10只雌性BALB/c小鼠。研究的开始分两天进行，在这两 天每组中的5只动物被处理。因此，将所述组分成部分I和部分II。在不同时间点皮下处理动 物(表⑵。
[0386] 在给药期间，每天准确地观察动物的毒性征候。在最后一次给药后48小时将动物 安乐死，进行宏观检查并且准备脾以用于进一步的分析。
[0387] 剂量
[0388] 在所有组中，在重复的时间点（表15)通过颈背和肩之间的皮下注射来施用试验 项。所有组的施用体积都为〇. lmL(0.80mg TG02)。
[0389] 表15:处理和动物识别
[0390]
[0391] 临床观察
[0392] 在整个24天的处理期期间观察所有动物的临床征候。
[0393] 每天进行至少一次总体临床观察，优选地在每天的同一时间，并且考虑用药后的 预期效应的峰值期。记录动物的健康状况。
[0394] 对每只动物进行包括皮毛、眼睛和粘膜的变化的总体临床观察，优选在每天的同 一时间进行，并且考虑用药后的预期效应的峰值期。同样检查呼吸系统、循环系统、自主和 中枢神经系统和躯体运动活性和行为模式。特别注意观察过敏反应、瘫痪、震颤、抽搐、流 延、腹泻、昏睡、睡眠和昏迷的征候。此外，注意注射位点。
[0395] 病理学-总体验尸
[0396] 最后一次给药后48小时（研究的第24天)通过断颈将动物处死并且对其进行详细 的总体尸检，包括认真地检查身体的外表面、所有孔口以及颅腔、胸腔和腹腔及其内含物。
[0397] 细胞培养和脾细胞刺激
[0398] 将所有动物的脾取出，转移到细胞培养基(补充有10%FCS，100U/mL青霉素，100μ g/mL链霉素，2mM L-谷氨酰胺和50μΜβ-巯基乙醇的RPMI 1640培养基)并在冰上保存。无菌 地进行所有步骤并将细胞保持在冰上。
[0399] 使用细胞过滤器来生成脾细胞的单细胞悬液。在离心（350g，5min，5 ± 3°C )后，将 上清移除并将细胞沉淀重悬在ACK缓冲液中并在室温温育5min。添加10mL细胞培养基。将样 品在试验台上放置5min以使细胞碎片沉淀。将细胞碎片上方的悬液转移到另一个管中并离 心（35(^，511^11，5±3°(：)。将上清移除并将细胞沉淀重悬在1〇1^细胞培养基中。在给细胞计 数后，将0.2Mio细胞接种到96孔板中（180yL/孔；1，1*10 6个细胞/mL)。对于每个脾在每个板 上铺板9个重复样。
[0400] (1)1块板用于在24小时后收集用于细胞因子测量的上清(结果未示）
[0401] (2)1块板用于在48小时后收集用于细胞因子测量的上清(结果未显示）。
[0402] (3)1块板用于增殖测定
[0403] 进行以下刺激：
[0404] -3个重复样:未刺激的（添加20yL细胞培养基）
[0405] -3个重复样：用ΙΟμΜ TG02(8种肽，每种肽的终浓度为ΙΟμΜ，添加在20yL细胞培养 基中）刺激
[0406] -3个重复样：用lyg/200yL ConA(伴刀豆球蛋白A)(将lyg ConA添加在20yL细胞培 养基中）刺激
[0407] 在37°C 和5%C02 孵育 24h(l)、48h(2)或5天(3)。
[0408] 将剩余的细胞离心（35(^，511^11，5±3°(：)，转移至1.511^管中，再次离心（350 8， 5min，5 ± 3 °C)，将上清完全移除，并将细胞沉淀在$-70 °C冷冻。
[0409] (1)在24h后，将相应的板离心（350g，室温)并收集150yL上清并将其在<-70°C冷 冻。
[0410] (2)在48h后，将相应的板离心（350g，室温)并收集150yL上清并将其在彡-70°c冷 冻。
[0411]增殖测定
[0412] ⑶在5天后，将lyCi/孔3H-胸苷添加至样品中，然后将其在37°C和5%C0 2孵育18h。 然后将平板在<-20°C冷冻。
[0413] 在室温将平板解冻。在洗涤收集器后，使用收集器将样品转移至过滤板，之后使用 水进行5个洗涤步骤。将过滤板在室温过夜干燥。将金属箱粘至过滤板的底部并将20yL闪烁 液添加至孔中。室温孵育1小时后，使用TopCount NXT测量样品并计算刺激指数(SIhSIi 刺激的样品的CPM/对照样品的CPM。
[0414] 结果
[0415] 表16和图9显示脾细胞增殖测定的结果。表16显示各重复样的CPM以及每只小鼠的 平均CPM。如可见的，用TG02刺激的脾细胞显示与未刺激的脾细胞相比增加的CPM，表明TG02 引起免疫应答。
[0416] 表16:用TG02刺激后的每分钟计数(CPM).
【主权项】
1. 适于引起免疫应答的肽混合物，其包含第一肽和第二肽，所述第一肽和第二肽各自 对应于RAS蛋白的片段，其中： 所述第一肽和第二肽中的每种包含包括RAS蛋白的位置13的至少8个氨基酸的区域， 所述第一肽和第二肽的所述区域中的每个独立地具有不在所述位置13处的与RAS蛋白 的相应区域相同的至少6个氨基酸残基， 所述第一肽和所述第二肽中的每种在对应于所述位置13的氨基酸处具有点突变，并且 所述第一肽的点突变不同于所述第二肽的点突变。2. 根据权利要求1所述的肽混合物，其中所述点突变中的每个独立地选自G13A、G13C、 G13D、G13R、G13S 或 G13V 突变。3. 根据权利要求1或2所述的肽混合物，其中所述肽混合物还包含： 至少一种另外的肽，所述至少一种另外的肽对应于RAS蛋白的片段，所述RAS蛋白的片 段包含至少8个氨基酸的区域，所述区域包括RAS蛋白的位置12,其中所述至少一种另外的 肽的所述区域中的每个独立地具有不在所述位置12处的与RAS蛋白的相应区域相同的至少 6个氨基酸残基，并且其中在对应于RAS蛋白的位置12的氨基酸处存在点突变;和/或 至少一种另外的肽，所述至少一种另外的肽对应于RAS蛋白的片段，所述RAS蛋白的片 段包含至少8个氨基酸的区域，所述区域包括RAS蛋白的位置61，其中所述至少一种另外的 肽的所述区域中的每个独立地具有不在所述位置61处的与RAS蛋白的相应区域相同的至少 6个氨基酸残基，并且其中在对应于RAS蛋白的位置61的氨基酸处存在点突变。4. 根据权利要求3所述的肽混合物，其中在对应于RAS蛋白的位置12的氨基酸处的点突 变选自612六、612(：、6120、6121?、6123或612￥突变和/或其中在对应于1^3蛋白的位置61的氨 基酸处的点突变选自〇6把、〇61!1、〇611(、〇611^、〇61?或〇611?突变。5. 根据权利要求3所述的肽混合物，其中所述第一肽是具有G13C突变的肽并且所述第 二肽是具有G13D突变的肽，并且其中所述至少一种另外的肽包括： 具有G12A突变的肽， 具有G12C突变的肽， 具有G12D突变的肽， 具有G12R突变的肽， 具有G12S突变的肽，和 具有G12V突变的肽。6. 根据权利要求3所述的肽混合物，其中所述第一肽是具有G13R突变的肽并且所述第 二肽是具有G13V突变的肽，并且其中所述至少一种另外的肽包括： 具有Q61H突变的肽， 具有Q61K突变的肽， 具有Q61L突变的肽，和 具有Q61R突变的肽。7. 适于引起免疫应答的肽混合物，其包含至少五种肽，所述五种肽各自对应于RAS蛋白 的片段，其中： 所述至少五种肽中的每种包含至少8个氨基酸的区域并且包括RAS蛋白的位置13， 所述至少五种肽的所述区域中的每个独立地具有不在所述位置13处的与RAS蛋白的相 应区域相同的至少6个氨基酸残基， 所述肽中的每种在对应于所述位置13的氨基酸处具有点突变，所述点突变选自G13A、 613(：、6130、6131?、6135或613￥突变，并且 每种肽的点突变不同于其他肽的点突变。8. 适于引起免疫应答的肽混合物，其由六种肽组成，所述六种肽各自对应于RAS蛋白的 片段，其中： 每种肽包含至少8个氨基酸的区域，所述区域包括RAS蛋白的位置12， 所述肽的所述区域中的每个独立地具有不在所述位置12处的与RAS蛋白的相应区域相 同的至少6个氨基酸残基， 所述肽中的每种在对应于所述位置12的氨基酸处具有点突变，所述点突变选自G12A、 612(：、6120、6121?、6125或612￥突变，并且 每种肽的点突变不同于其他肽的点突变。9. 适于引起免疫应答的肽混合物，其由六种肽组成，所述六种肽各自对应于RAS蛋白的 片段，其中： 每种肽包含至少8个氨基酸的区域，所述区域包括RAS蛋白的位置61， 所述肽的所述区域中的每个独立地具有不在所述位置61处的与RAS蛋白的相应区域相 同的至少6个氨基酸残基， 所述肽中的每种在对应于所述位置61的氨基酸处具有点突变，所述点突变选自Q61E、 〇61!1、〇611(、〇611^、〇61?或〇611?突变，并且 每种肽的点突变不同于其他肽的点突变。10. 适于引起免疫应答的肽混合物，其由第一肽、第二肽、第三肽和第四肽组成，所述第 一肽、第二肽、第三肽和第四肽各自对应于RAS蛋白的片段，其中： 所述第一肽、第二肽和第三肽中的每种包含至少8个氨基酸的区域，所述区域包括RAS 蛋白的位置12， 所述第四肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8个氨基酸的区域，所述第一肽、第二肽、 第三肽和第四肽的所述区域中的每个分别独立地具有不在所述位置12或13处的与RAS蛋白 的相应区域相同的至少6个氨基酸残基， 所述第一肽、第二肽、第三肽和第四肽中的每种在对应于所述位置12或13的氨基酸处 分别具有点突变，并且 所述第一肽是具有G12A突变的肽， 所述第二肽是具有G12R突变的肽， 所述第三肽是具有G12S突变的肽，并且 所述第四肽是具有G13C突变的肽。11. 用作疫苗或药物并且对应于RAS蛋白的片段的肽，其中： 所述肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8个氨基酸的区域， 所述区域具有不在所述位置13处的与RAS蛋白的相应区域相同的至少6个氨基酸残基， 并且 所述肽在对应于所述位置13的氨基酸处具有G13C或G13R点突变。12. 适于引起免疫应答并且对应于RAS蛋白的片段的肽，其中： 所述肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8个氨基酸的区域， 所述区域具有不在所述位置13处的与RAS蛋白的相应区域相同的至少6个氨基酸残基， 所述肽包含不超过30个氨基酸残基，并且 所述肽在对应于所述位置13的氨基酸处具有G13C或G13R点突变。 13. T细胞混合物，所述T细胞混合物包含对递呈在MHC分子上时的根据权利要求1至10 中任一项所述的肽混合物之一中的各种肽具有特异性的T细胞，或T细胞制剂，所述T细胞制 剂包含对递呈在MHC分子上时的根据权利要求11使用的肽之一或根据权利要求12所述的肽 之一具有特异性的T细胞。14. 药物组合物，其包含权利要求1至10中任一项的肽混合物，根据权利要求11所使用 的肽，根据权利要求12所述的肽或权利要求13的T细胞混合物或T细胞制剂和药用载体、稀 释剂和/或赋形剂。15. 根据权利要求1至10中任一项所述的肽混合物，根据权利要求11所使用的肽，根据 权利要求12所述的肽，根据权利要求13所述的T细胞混合物或T细胞制剂或根据权利要求19 所述的药物组合物，其用于预防和/或治疗癌症。16. 根据权利要求5所述的肽混合物或根据引用权利要求5的权利要求13所述的T细胞 混合物，其用于预防和/或治疗癌症，优选其中所述癌症是结直肠癌、肺癌和/或胰腺癌。17. 根据权利要求6所述的肽混合物或根据引用权利要求6的权利要求13所述的T细胞 混合物，其用于预防和/或治疗恶性黑素瘤。18. 肽混合物、用作疫苗或药物的肽、肽、T细胞混合物、T细胞制剂或药物组合物，其用 于包括以下步骤的方法： i)鉴定存在于取自患者的样品中的RAS蛋白突变； i i)选择包含含有对应于所述样品中鉴定的RAS蛋白突变中的至少一个的点突变的肽 的根据权利要求1-10中任一项所述的肽混合物;或选择包含对应于所述样品中鉴定的RAS 蛋白突变中的至少一个的点突变的根据权利要求11所使用的肽;或选择包含对应于所述样 品中鉴定的RAS蛋白突变中的至少一个的点突变的根据权利要求12所述的肽;或选择包含 对递呈在MHC分子上时包含对应于所述样品中鉴定的RAS蛋白突变中的至少一个的点突变 的肽具有特异性的T细胞的根据权利要求13所述的T细胞混合物或T细胞制剂;或选择根据 权利要求14所述的药物组合物，所述药物组合物包含含有对应于所述样品中鉴定的RAS蛋 白突变中的至少一个的点突变的肽混合物、用作疫苗或药物的肽或肽，或含有对递呈在MHC 分子上时包含对应于所述样品中鉴定的RAS蛋白突变中的至少一个的点突变的肽具有特异 性的T细胞的T细胞混合物或T细胞制剂;和 iii)向所述患者施用所述肽混合物、用作疫苗或药物的肽、肽、T细胞混合物或T细胞制 剂。19. 选择用于向患者施用的肽混合物、用作疫苗或药物的肽、肽、T细胞制剂、T细胞混合 物或药物组合物的方法，所述方法包括： i)鉴定存在于取自患者的样品中的RAS蛋白突变;和 i i)选择包含含有对应于所述样品中鉴定的RAS蛋白突变中的至少一个的点突变的肽 的根据权利要求1-10中任一项所述的肽混合物;或选择包含对应于所述样品中鉴定的RAS 蛋白突变中的至少一个的点突变的根据权利要求11所使用的肽;或选择包含对应于所述样 品中鉴定的RAS蛋白突变中的至少一个的点突变的根据权利要求12所述的肽;或选择包含 对递呈在MHC分子上时包含对应于所述样品中鉴定的RAS蛋白突变中的至少一个的点突变 的肽具有特异性的T细胞的根据权利要求13所述的T细胞混合物或T细胞制剂;或选择根据 权利要求14所述的药物组合物，所述药物组合物包含含有对应于所述样品中鉴定的RAS蛋 白突变中的至少一个的点突变的肽混合物、用作疫苗或药物的肽或肽，或含有对递呈在MHC 分子上时包含对应于所述样品中鉴定的RAS蛋白突变中的至少一个的点突变的肽具有特异 性的T细胞的T细胞混合物或T细胞制剂。
【文档编号】C12N5/0783GK105980403SQ201480074531
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2014年12月9日
【发明人】乔恩·阿蒙·埃里克森
【申请人】塔格瓦克斯公司