用于蛋白质组学分析的多肽混合物等电聚焦分离方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于蛋白质组学分析的多肽混合物等电聚焦分离方法，先将生物样品的总蛋白质混合物全部酶切成较短的肽段混合物，使用肽段等电聚焦缓冲液复溶肽段混合物，再采用上样杯上样方式进行等电聚焦电泳，实现了复杂肽段混合物的有效分离。最后，将各个槽中预分离的多肽混合物取出脱盐用于质谱分析，便能获得比传统方法更多数量的多肽信号、更高的肽段覆盖率和蛋白质鉴定数量。本发明方法精确、高效、费用低，可用于各种生物样品总蛋白质的多维液相色谱-质谱鉴定技术体系，可以替代传统的离子交换色谱预分离方法，实现了对肽段混合物的高效预分离，避免了肽段的丢失。据此，还可建立高覆盖率的蛋白质组表达谱信息。
【专利说明】用于蛋白质组学分析的多肽混合物等电聚焦分离方法
【技术领域】
[0001]本发明属于蛋白质组学【技术领域】，尤其涉及一种用于蛋白质组学分析的多肽混合物等电聚焦分离方法。
【背景技术】
[0002]蛋白质是生物体内关键的结构和功能分子，是生命活动的执行者和生命现象的体现者。蛋白质组是指一种细胞或一种组织内的基因在特定条件下表达的所有蛋白质，对于这些蛋白质的分析和鉴定研究称为蛋白质组学。
[0003]目前，蛋白质组学的研究方法主要有两类，分别是双向电泳(Two-dimensionalpolyacrylamide gel electrophoresis, 2DE)技术和多维液相色谱(Mult1-dimensionalliquid chromatography,MDLC)技术。双向电泳-质谱技术是目前广泛应用的经典蛋白质研究途径，先将复杂的蛋白质混合物进行胶上分离，再将凝胶上的蛋白质斑点切下，用胰蛋白酶进行胶内酶切后，用质谱仪测定肽质量指纹图谱，最后对这些肽数据进行数据检索而鉴定蛋白质信息。至今因其能够独立地分离大量蛋白而广泛用于蛋白质组的定量和分离中，并能够比较和测量出细胞中生理状态、疾病状态时的差异蛋白质。然而，以2DE为基础的蛋白组学研究方法仍有其技术上的局限性，主要表现在以下几方面:
[0004](I)在双向凝胶电泳图谱上，并非每个蛋白点所包含的蛋白量都足以用于鉴定蛋白；
[0005](2)实验的操作繁琐，实验结果的重现性较差；
[0006](3 )对于强酸性蛋白、强碱性蛋白、疏水性蛋白和低丰度蛋白，2D-PAGE尚不能将其很好地检测出来
[0007](4) 2D-PAGE不能在线与质谱连接以达到高效的蛋白分离和鉴定水平。
[0008]鉴于双向凝胶电泳的一些不足，高效液相色谱技术作为其补充方法应运而生，特别是各种模式色谱联用组成的多维色谱分离技术。此方法用胰蛋白酶把蛋白质混合物样品全部酶切成多肽，再利用多维分离技术将肽段细分成多个组分，送入电喷雾质谱中实现鉴定蛋白质的目的。这种技术具备高分辨率、高重现性及能够与质谱良好兼容等特点。
[0009]MDLC中目前较为广泛应用的方法主要是二步正交:即第一维不固定，第二维采用反相液相色谱(RP-LC)直接耦联质谱(2D-LC-MS)。RP-LC因其高效的分离能力、无盐以及便于后续处理而常作为多维分离体系中的最后一维。第一维预分离常用离子交换色谱(1n-Exchange Chromatography, IEC)、体积排阻色谱(Size Exclusion Chromatography,SEC)、亲和色谱(Affinity Chromatography, AC)等模式。然而，多肽混合物在实施第一维分离时，采用这些模式，会随着流动相的洗脱而导致部分多肽丢失，影响到低丰度蛋白质的检出。为了解决肽段丢失的问题，需要对第一维的预分离新方法进行探索。
【发明内容】
[0010]本发明要解决的技术问题是提供一种简便、高效的用于蛋白质组学分析的多肽混合物等电聚焦分离方法，可替代传统的离子交换色谱预分离方法，实现了对肽段混合物的高效预分离，避免了肽段的丢失。
[0011]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:用于蛋白质组学分析的多肽混合物等电聚焦分离方法，先将生物样品的总蛋白质混合物全部酶切成较短的肽段混合物，使用肽段等电聚焦缓冲液复溶肽段混合物，再采用上样杯上样方式进行等电聚焦电泳。
[0012]上述用于蛋白质组学分析的多肽混合物等电聚焦分离方法，包括以下步骤:
[0013](I)取细胞总蛋白质样品100微克，使用40mM碳酸氢铵溶解，分别加入40mM 二硫苏糖醇和IOOmM碘乙酰胺进行还原和烷基化处理后，按质量比25:1加入4微克测序级胰蛋白酶(Trypsin)，在37°C酶解12小时，将所有蛋白质酶切成16-25个氨基酸长度的多肽，得到多肽混合物；
[0014](2)将步骤(I)所得多肽混合物在真空浓缩仪中抽干后，再加入200微升肽段等电聚焦缓冲液复溶；
[0015](3)将步骤(2)中复溶的多肽混合物用于等电聚焦电泳仪电泳，以干胶条和上样杯组合方式上样；
[0016](4)在等电聚焦电泳仪中进行多肽混合物电泳。
[0017]根据权利要求2所述的用于蛋白质组学分析的多肽混合物等电聚焦分离方法，其特征在于:步骤(2)中所述加肽段等电聚焦缓冲液是含有7M尿素的水溶液，并添加
0.5%pH3-10两性电解质缓冲液(IPG buffer)。
[0018]步骤(3)中所述上样是以13cm pH3_10IPG胶条作为聚焦底座，用上样杯压盖胶条形成独立上样口的杯上样方式，胶条上不覆盖石蜡油。
[0019]步骤(4)中电泳参数为①500v，3h ;@ 8000v，4h。
[0020]上述用于蛋白质组学分析的多肽混合物等电聚焦分离方法，还包括以下步骤:
[0021](5)步骤(4)的电泳程序完成后，将上样杯内12个槽中的液体分别取出，转移至新离心管中；
[0022](6)步骤(5)中收集得到的12份预分离多肽溶液使用ZipTip C18脱盐枪头除盐，真空浓缩仪抽干；
[0023](7)步骤(6)中抽干后的多肽使用easy-nLClOOO纳升液相色谱分离，色谱柱为C18毛细管反相分离柱，再次分离后的肽段送入LTQ-Orbitrap质谱中采集信号，进行蛋白质鉴定
[0024]针对多维液相色谱预分离时肽段丢失的问题，发明人建立了一种用于蛋白质组学分析的多肽混合物等电聚焦分离方法，先通过溶液酶解方式将所有蛋白质混合物酶解成肽段混合物，避免蛋白质在后续处理过程中的降解，使用高效而简化肽段等电聚焦缓冲液复溶肽段混合物，以实现肽段的全部溶解；再采用上样杯上样方式，并合理设置等电聚焦电泳参数，实现多肽混合物根据其等电点不同在高压电场作用下自由迁移至上样杯的各个槽中，实现了复杂肽段混合物的有效分离。最后，将各个槽中预分离的多肽混合物取出脱盐用于质谱分析，便能获得比传统方法更多数量的多肽信号、更高的肽段覆盖率和蛋白质鉴定数量。本发明方法精确、高效、费用低，可用于各种生物样品总蛋白质的多维液相色谱-质谱鉴定技术体系，可以替代传统的离子交换色谱预分离方法，实现了对肽段混合物的高效预分离，避免了肽段的丢失。据此，还可建立高覆盖率的蛋白质组表达谱信息。【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1是本发明中上样杯上样方式和等电聚焦原理的示意图，图中:1上样杯架，213cm干胶条(pH3-10)，3上样杯杯盖，4高压等电聚焦。
【具体实施方式】
[0026]实施例1
[0027]以下所用的试剂乙腈、水、甲酸都是色谱纯，购自Sigma-Aldrich试剂公司；质谱级胰蛋白酶购自Promega公司；干胶条和上样杯购自Bio-Rad公司；质谱仪是线性离子讲一静电场轨道讲组合式质谱仪(Thermo LTQ-Orbitrap Elite)。
[0028](I)水牛精子超声波破碎后，加入裂解液(7M尿素、2%CHAPS、0.5%DTT和0.5%PMSF)消化提取总蛋白质，离心去除细胞碎片其他杂质，弃掉下层细胞碎片；
[0029](2)取上述提取的上清液500 μ L，加入1.5mL预冷丙酮沉淀过夜，12000rpm离心Ih,丢弃上清，将沉淀用100 μ L的40mM碳酸氢铵(NH4HCO3)复溶；
[0030](3)分别加入10yL40mM 二硫苏糖醇(DTT)和10 μ LlOOmM碘乙酰胺(IAA)对蛋白质进行还原和烷基化处理；
[0031](4)按1:25的比例,加入4 μ g质谱级胰蛋白酶(Trypsin)至上述蛋白质溶液中，37°C 酶切 12h ；
[0032](5)酶切后肽段真空抽干，使NH4HCO3完全挥发；
[0033](6)在等电聚焦缓冲液(7M尿素、2%CHAPS、0.5%DTT)中按0.5%比例加入两性电解质(IPG Buffer pH3_10，购自 GE Healthcare 公司，货号 17-6004-40)，取 200 μ L 复溶肽段混合物；
[0034](7)使用13cm IPG胶条(pH3_10)作为聚焦底座，在胶条上盖压上样杯，形成独立的、隔离的上样口(如图l_a所示)，胶条上不覆盖石蜡油；
[0035](8)将步骤(6)所述的复溶肽段混合物均匀加入12个上样口中，盖上上样杯盖(如图l_b所示)，此时，肽段混合物均匀的分布于各个上样口内；
[0036](9)执行以下等电聚焦程序:①500v，3h ;@8000v，4h ;在高压电场的作用下，多肽混合物会穿过底层的胶条，根据其等电点的不同，逐步迁移至其合适的上样口内(如图1-c所示)；
[0037](8)电泳结束后，多肽将在各个上样口内重新定位(如图Ι-d所示)，将各个上样口中的液体转移至新EP管中，用于脱盐处理；
[0038](9)将步骤(8)所得溶液浓缩至20yL左右，用微量碳18反相色谱吸附柱(C18ZipTip, Millipore公司)脱盐处理，去除多肽混合液的小分子无机盐和其他杂质；
[0039](10)将步骤(9)得到的脱盐后的12个样品用真空浓缩仪抽干，用反相色谱的A相(2%乙腈+0.1%甲酸水溶液)复溶，用于液质联用分析(LC-MS);色谱柱:C18反相毛细管柱；流动相A:2%乙腈+0.1%甲酸水溶液；流动相B:98%乙腈+0.1%甲酸水溶液。
[0040](11)质谱条件:电喷雾电压1.5kV,采用一级模式、Orbitrap检测全谱,扫描分辨率为60000 ;质量扫描范围是m/z=350-1800 ; 10个LTQ 二级质谱用CID碰撞模式完成，二级扫描分辨率为60000 ;串联质谱CID碰撞能量是35%归一化能量，数据依赖的自动化模式采集信号；采用Xcalibular软件自动进样。
[0041](12)所有的串联质谱数据通过搜索引擎SEQUEST (Protein Discovery软件)进行搜索，检索数据库为牛属(Bovine)数据库，为减少假阳性结果出现，用以上数据库的反库验证。数据库搜索参数设置如下=Trypsin酶切；最大2个漏切位点；一级质谱质量范围IOppm ;二级质谱质量偏差20mmu,可变修饰为:半胱氨酸碘乙酰胺化Carbamidomethyl(+57Da),甲硫氨酸氧化Oxsidation (+15.995Da)、人工确认匹配二级图谱减少错配率。最后鉴定得到蛋白质数量为1148种(部分蛋白质数据如表I所示)。将该方法获得的数据与常规方法(二维液相色谱分离结合质谱分析方法)相比，常规方法在鉴定蛋白质的数量为834种，平均肽段覆盖率为36%，均低于本方法的鉴定蛋白质数量1148种和45%的平均肽段覆盖率。
[0042]表I鉴定得到蛋白质的部分信息
[0043]
【权利要求】
1.一种用于蛋白质组学分析的多肽混合物等电聚焦分离方法，其特征在于:先将生物样品的总蛋白质混合物全部酶切成较短的肽段混合物，使用肽段等电聚焦缓冲液复溶肽段混合物，再采用上样杯上样方式进行等电聚焦电泳。
2.根据权利要求1所述的用于蛋白质组学分析的多肽混合物等电聚焦分离方法，其特征在于包括以下步骤: (1)取细胞总蛋白质样品100微克，使用40mM碳酸氢铵溶解，分别加入40mM二硫苏糖醇和IOOmM碘乙酰胺进行还原和烷基化处理后，按质量比25:1加入4微克测序级胰蛋白酶，在37°C酶解12小时，将所有蛋白质酶切成16-25个氨基酸长度的多肽，得到多肽混合物； (2)将步骤(I)所得多肽混合物在真空浓缩仪中抽干后，再加入200微升肽段等电聚焦缓冲液复溶； (3)将步骤(2)中复溶的多肽混合物用于等电聚焦电泳仪电泳，以干胶条和上样杯组合方式上样； (4 )在等电聚焦电泳仪中进行多肽混合物电泳。
3.根据权利要求2所述的用于蛋白质组学分析的多肽混合物等电聚焦分离方法，其特征在于:步骤(2)中所述加肽段等电聚焦缓冲液是含有7M尿素的水溶液，并添加0.5%pH3-10两性电解质缓冲液。
4.根据权利要求2所述的用于蛋白质组学分析的多肽混合物等电聚焦分离方法，其特征在于:步骤(3)中所述上样是以13cm PH3-10IPG胶条作为聚焦底座，用上样杯压盖胶条形成独立上样口的杯上样方式，胶条上不覆盖石蜡油。
5.根据权利要求2所述的用于蛋白质组学分析的多肽混合物等电聚焦分离方法，其特征在于:步骤(4)中电泳参数为①500v，3h ;@8000v，4h。
6.根据权利要求2所述的用于蛋白质组学分析的多肽混合物等电聚焦分离方法，其特征在于还包括以下步骤: (5)步骤(4)的电泳程序完成后，将上样杯内12个槽中的液体分别取出，转移至新离心管中； (6)步骤(5)中收集得到的12份预分离多肽溶液使用ZipTipC18脱盐枪头除盐，真空浓缩仪抽干； (7)步骤(6)中抽干后的多肽使用easy-nLClOOO纳升液相色谱分离，色谱柱为C18毛细管反相分离柱，再次分离后的肽段送入LTQ-Orbitrap质谱中采集信号，进行蛋白质鉴定。
【文档编号】G01N27/62GK103926301SQ201410153861
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月17日 优先权日:2014年4月17日
【发明者】付强, 岑卫健, 朱平川 申请人:广西大学