用于瓦螨和蜂中的病毒控制的组合物和方法

用于瓦螨和蜂中的病毒控制的组合物和方法
【专利摘要】公开了用于使用RNA干扰技术在瓦螨和蜂中提供病毒控制的组合物和方法，并且更具体地，公开了通过提供靶向病毒序列的触发多核苷酸对瓦螨和蜂中的病毒感染的预防和治疗。
【专利说明】用于瓦螨和蜂中的病毒控制的组合物和方法
[0001 ] 序列表
[0002]本申请含有已以电子版形式提交且特此以引用的方式整体并入的序列表。2014年 12月2日创建的所述序列表命名为P34159W000_SL. TXT并且大小为12，288字节。
[0003] 领域
[0004] 本实施方案总体涉及使用RNA干扰技术的用于降低蜂对传染病的易感性的组合物 和方法，并且更具体地，涉及使用RNA干扰技术用于在瓦螨载体和蜂中减少病毒载量并抑制 病毒复制。
[0005] 背景
[0006] 蜜蜂，意大利蜜蜂(Apis mellifera)，是作物的有效传粉所需要的，并因此对世界 农业至关重要。蜜蜂还生产重要的经济产品，包括蜂蜜和蜂蜡。蜂群的健康和活力受到许多 寄生虫和病原体的威胁，这些寄生虫和病原体包括病毒、细菌、原生动物和螨虫，它们各自 具有特征性的传播模式。
[0007] -般来说，病毒的传播可以通过两种途径发生:水平传播和垂直传播。在水平传播 中，病毒是在同一代个体间传播，而垂直传播发生在成年个体到他们的后代之间。传播可以 通过多种路径在社会生物体中发生(有关详细综述参见Chen Y P等人(2006)Appl Environ Microbiol. 72(1) :606-11)。最近，蜜蜂病毒的水平传播在蜂群中已有记录，例如，畸翅病毒 (deformed wing virus) (DWV)和克什米尔蜂病毒(Kashmir Bee Virus) (KBV)通过寄生螨 虫狄斯瓦螨(Varroa destructor)的传播，以及在蜜蜂卵和年幼幼虫(不被瓦螨寄生的生命 阶段)中的病毒的一些证据。
[0008]瓦螨(狄斯瓦螨)是管理蜜蜂(意大利蜜蜂)的头号寄生虫，并且是商业养蜂最大的 全球性威胁(Rosenkranz等，2010)。瓦螨寄生蛹和成虫蜂在蛹育雏室中繁殖。螨虫用它们的 嘴巴刺穿外骨骼，并以蜂的血淋巴为食。在外骨骼的这些伤口部位有细菌感染，诸如引起欧 洲幼虫腐臭病的蜂房蜜蜂球菌(Melissococcus pluton)。除了它们的寄生效应之外，瓦螨 被怀疑充当一些蜜蜂病原体的载体，这些蜜蜂病原体包括畸翅病毒(DWV)、克什米尔蜂病毒 (KBV)、急性蜂麻痹病毒(ABPV)和黑蜂王台病毒(BQCV)，并可以削弱它们宿主的免疫系统， 使宿主容易受到感染。已知一些蜂病毒在螨虫中复制，由此显著增加了病毒载量。如果不治 疗瓦螨侵袭，通常会导致群体水平的死亡。
[0009]目前，养蜂人使用大量的方法来控制瓦螨的水平，包括各种化学杀螨剂，其中大多 数已失去效力，并且是有毒的和/或残留在蜂蜡和蜂蜜中。其他方法包括施用草酸或甲酸、 单萜(百里酚)和各种其他管理措施，其结果是高度可变的，包括对治疗群体的毒性。对瓦螨 有抵抗力的蜂的选育，诸如针对导致去除受侵袭幼蜂的卫生行为的选择，在实践上取得了 有限的成功。
[0010]治疗瓦螨侵袭的现行方法被证明是无效的，因为螨虫发展出了对现有杀螨剂的耐 药性。另外，使用这类杀螨剂可能会在供人类消费的蜂蜜中引入有害的化学物质。
[0011] 概述
[0012] 本实施方案涉及用于在瓦螨和蜜蜂中控制病毒载量和/或病毒复制的组合物和方 法。
[0013] 本公开提供了用于在狄斯瓦螨或在蜂群中减少病毒载量或抑制病毒复制的方法， 所述方法包括：向所述狄斯瓦螨或蜂群提供包含有效量的至少一种触发多核苷酸的组合 物，所述触发多核苷酸包含与蜂病毒基因的至少21个连续核苷酸的序列基本上同一或基本 上互补的核酸序列，从而在狄斯瓦螨或在蜂群中降低病毒载量或抑制病毒复制。在一些实 施方案中，所述病毒选自由以下组成的组:急性蜂麻痹病毒(ABPV)、畸翅病毒(DWV)、克什米 尔蜂病毒(KBV)、黑蜂王台病毒(BQCV)、囊状幼虫病病毒(SBV)、慢性蜂麻痹病毒(CPV)、云翅 病毒(CWV)、以色列急性麻痹病毒（IAPV)、无脊椎动物虹彩病毒6型（IIV-6)、狄斯瓦螨病毒 (VDV-1)、Kakugo病毒(KV)和西奈湖病毒(LSV)。
[0014] 本公开还提供了用于向狄斯瓦螨、蜂或蜂群提供的组合物，所述组合物包含有效 量的触发多核苷酸，所述触发多核苷酸包含与蜂病毒基因的至少21个连续核苷酸的序列基 本上同一或基本上互补的核酸序列。在一些实施方案中，所述组合物在狄斯瓦螨、蜂或蜂群 中降低病毒载量或抑制病毒复制。在一些实施方案中，所述组合物增加蜂或蜂群对蜂病毒 引起的疾病的耐受性。
[0015] 在一些实施方案中，所述触发多核苷酸是单链DNA(ssDNA)、单链RNA(ssRNA)、双链 RNA( dsRNA)、双链DNA( dsDNA)或双链DNA-RNA杂合体。
[0016] 在一些实施方案中，所述触发多核苷酸下调病毒基因。在一些实施方案中，所述病 毒基因编码外壳蛋白、RdRp、VPl、VP2或解旋酶。在一些实施方案中，所述触发多核苷酸包含 与选自由SEQ ID ^):1-21组成的组的序列或其片段具有至少约80%、85%、88%、90%、 92%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性或互补性，或具有100%的序列同一性或 互补性的核酸序列。在一些实施方案中，所述触发多核苷酸包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个不 同的触发多核苷酸的混合物，所述触发多核苷酸靶向不同的病毒、或靶向相同病毒的不同 基因、或靶向病毒基因的不同片段。
[0017] 本公开还提供了用于降低蜂群中的病毒载量的方法，所述方法包括:通过向蜂群 寄生虫提供包含有效量的触发多核苷酸的组合物来减少所述寄生虫中的病毒载量，所述触 发多核苷酸包含与蜂病毒基因的至少21个连续核苷酸的序列基本上同一或基本上互补的 核酸序列，从而抑制寄生虫中的病毒复制并降低蜂群中的病毒载量。在一些实施方案中，寄 生虫是狄斯瓦螨。
[0018] 本公开还提供了用于降低蜂对蜂病毒引起的疾病的易感性的方法，所述方法包 括：向蜂寄生虫提供包含有效量的触发多核苷酸的组合物，所述触发多核苷酸包含与蜂病 毒基因的至少21个连续核苷酸的序列基本上同一或基本上互补的核酸序列，从而抑制寄生 虫中的病毒复制并降低蜂对蜂病毒引起的疾病的易感性。在一些实施方案中，疾病是蜂群 装竭失调症(CCD)。在一些实施方案中，寄生虫是狄斯瓦螨。
[0019] 在一些实施方案中，包含有效量的触发多核苷酸的所述组合物是通过喷洒瓦螨、 通过直接饲喂瓦螨、通过直接饲喂蜂群中的蜂或其任何组合来提供。
[0020] 在一些实施方案中，提供了用于降低狄斯瓦螨中的病毒载量的方法。在一些实施 方案中，所述蜂病毒选自由以下组成的组:急性蜂麻痹病毒(ABPV)、畸翅病毒(DWV)、克什米 尔蜂病毒(KBV)、黑蜂王台病毒(BQCV)、囊状幼虫病病毒(SBV)、慢性蜂麻痹病毒(CPV)、云翅 病毒(CWV)、以色列急性麻痹病毒（IAPV)、无脊椎动物虹彩病毒6型（IIV-6)、狄斯瓦螨病毒 (VDV-1)和Kakugo病毒(KV)。根据一些实施方案，提供了包含与蜂病毒基因的至少21个连续 核苷酸的序列基本上同一或基本上互补的核酸序列的触发多核苷酸。根据一些实施方案， 提供了用于下调狄斯瓦螨中的病毒基因的表达的方法。
[0021 ]根据一些实施方案，提供了通过对针对蜂传染性生物体和试剂(诸如DWV、IAPV、急 性蜂麻痹病毒和克什米尔蜂麻痹病毒）的瓦螨应用RNA干扰技术来防止蜂疾病(诸如蜂群衰 竭失调症)的传播的方法和组合物。
[0022] 根据本发明的一些实施方案，提供了用于增加蜂对蜂病毒引起的疾病的耐受性的 方法，所述方法包括向瓦螨提供有效量的触发多核苷酸，所述触发多核苷酸包含与蜂病毒 基因基本上同一或基本上互补的核酸序列，从而减少瓦螨中的病毒载量并增加蜂对蜂病毒 引起的疾病的耐受性。在一些实施方案中，所述核酸与蜂病毒基因的至少21个连续核苷酸 的序列基本上同一或基本上互补。
[0023] 根据本发明的一些实施方案，提供了用于增加蜂群对蜂病毒引起的疾病的耐受性 的方法，所述方法包括向瓦螨提供有效量的触发多核苷酸，所述触发多核苷酸包含与蜂病 毒基因基本上同一或基本上互补的核酸序列，从而减少瓦螨中的病毒载量并增加蜂群对蜂 病毒引起的疾病的耐受性。在一些实施方案中，所述核酸与蜂病毒基因的至少21个连续核 苷酸的序列基本上同一或基本上互补。
[0024] 在一个方面，本公开提供了用于降低狄斯瓦螨中的病毒载量的方法，所述方法包 括：向狄斯瓦螨提供或施用包含有效量的触发多核苷酸的组合物，所述触发多核苷酸包含 与蜂病毒序列基本上同一或基本上互补的核酸序列，从而抑制狄斯瓦螨中的病毒复制。在 一些实施方案中，所述蜂病毒序列是蜂病毒基因的至少21个连续核苷酸的序列。
[0025] 在一个方面，本公开提供了降低蜂群中的病毒载量的方法，所述方法包括:通过向 蜂群寄生虫提供包含有效量的触发多核苷酸的组合物来减少所述寄生虫中的病毒载量，所 述触发多核苷酸包含与病毒序列基本上同一或基本上互补的核酸序列，从而抑制寄生虫中 的病毒复制并降低蜂群中的病毒载量。在一些实施方案中，寄生虫是狄斯瓦螨。在一些实施 方案中，蜂病毒序列是蜂病毒基因的至少21个连续核苷酸的序列。
[0026] 在一个方面，本公开提供了用于降低狄斯瓦螨中的病毒复制的方法，所述方法包 括：向狄斯瓦螨施用包含有效量的至少一种触发多核苷酸的组合物，所述触发多核苷酸包 含下调狄斯瓦螨中的蜂病毒基因表达的核酸序列，从而降低狄斯瓦螨中的病毒复制。在一 些实施方案中，所述核酸序列是与病毒基因或其片段基本上同一或基本上互补的触发多核 苷酸。在一些实施方案中，所述核酸序列与蜂病毒基因的至少21个连续核苷酸的序列基本 上同一或基本上互补。
[0027] 在一个方面，本公开提供了降低蜂群中的病毒复制的方法，所述方法包括:通过向 蜂群寄生虫提供包含有效量的触发多核苷酸的组合物来减少所述寄生虫中的病毒复制，所 述触发多核苷酸包含与蜂病毒序列基本上同一或基本上互补的核酸序列，从而抑制寄生虫 中的病毒复制并降低蜂群中的病毒表达。在一些实施方案中，寄生虫是狄斯瓦螨。在一些实 施方案中，蜂病毒序列是蜂病毒基因的至少21个连续核苷酸的序列。
[0028] 在一个方面，本公开提供了用于降低蜂对蜂病毒引起的疾病的易感性的方法，所 述方法包括：向蜂寄生虫提供包含有效量的触发多核苷酸的组合物，所述触发多核苷酸包 含与蜂病毒序列基本上同一或基本上互补的核酸序列，从而抑制寄生虫中的病毒复制并降 低蜂对蜂病毒引起的疾病的易感性。在一些实施方案中，寄生虫是狄斯瓦螨。在一些实施方 案中，疾病是蜂群衰竭失调症(CCD)。在一些实施方案中，蜂病毒序列是蜂病毒基因的至少 21个连续核苷酸的序列。
[0029 ]根据本发明的一些实施方案，蜂是蜜蜂。
[0030]根据本发明的一些实施方案，蜜蜂是采集蜂。
[0031 ]根据本发明的一些实施方案，蜜蜂是巢蜂。
[0032] 几个实施方案涉及包含有效量的一种或多种触发多核苷酸的组合物，所述触发多 核苷酸包含与蜂病毒基因的至少21个连续核苷酸的序列基本上同一或基本上互补的核酸 序列。在一些实施方案中，所述病毒选自由以下组成的组：急性蜂麻痹病毒(ABPV)、畸翅病 毒(DWV)、克什米尔蜂病毒(KBV)、黑蜂王台病毒(BQCV)、囊状幼虫病病毒(SBV)、慢性蜂麻痹 病毒(CPV)、云翅病毒(CWV)、以色列急性麻痹病毒（IAPV)、无脊椎动物虹彩病毒6型（IIV-6)、狄斯瓦螨病毒(VDV-1)、Kakugo病毒(KV)和西奈湖病毒(LSV)。在一些实施方案中，病毒 是IAPV。在一些实施方案中，病毒是DWV。在一些实施方案中，所述病毒基因编码外壳蛋白、 RdRp、VPl、VP2或解旋酶。在一些实施方案中，所述触发多核苷酸包含与选自由SEQIDN0: 1-21组成的组的序列或其片段具有至少约80%、85%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、 98 %或99 %的序列同一性或互补性，或具有100 %的序列同一性或互补性的核酸序列。在一 些实施方案中，所述触发多核苷酸包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个不同的触发多核苷酸的混 合物，所述触发多核苷酸靶向不同的病毒、或靶向相同病毒的不同基因、或靶向病毒基因的 不同片段。在一些实施方案中，所述组合物包含包括与DWV序列具有至少约80 %、85 %、 88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性或互补性，或具有100%的序 列同一性或互补性的核酸序列的一种或多种触发多核苷酸;和包括与IAPV序列具有至少约 80%、85%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99% 的序列同一性或互补性，或具有 100%的序列同一性或互补性的核酸序列的一种或多种触发多核苷酸。几个实施方案涉及 包含有效量的一种或多种触发多核苷酸的组合物，所述触发多核苷酸包含与选自由SEQ ID 吣：11、13、14、17和18组成的组的核酸序列具有至少约80%、85%、88%、90%、92%、95%、 96%、97%、98%或99%的序列同一性或互补性，或具有100%的序列同一性或互补性的核 酸序列。几个实施方案涉及包含有效量的一种或多种触发多核苷酸的组合物，所述触发多 核苷酸包含与选自由SEQ ID N0:12、15、16、19和20组成的组的核酸序列具有至少约80%、 85%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99% 的序列同一性或互补性，或具有 100% 的序列同一性或互补性的核酸序列。在一些实施方案中，所述触发多核苷酸是单链DNA (ssDNA)、单链 RNA(ssRNA)、双链 RNA(dsRNA)、双链 DNA(dsDNA)或双链 DNA-RNA 杂合体。在一 些实施方案中，所述组合物包含一种或多种触发多核苷酸和一种或多种赋形剂。在一些实 施方案中，所述赋形剂包括选自糖、溶剂、蛋白质、蜂食物和其任何组合的一种或多种物质。 在一些实施方案中，所述糖选自果糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、半乳糖、核糖和其任何组 合。在一些实施方案中，所述蜂食物选自蜂蜜、花粉、乳清酵母(Wheast)、大豆粉、酵母、酵母 产品和其任何组合。在一些实施方案中，所述组合物是选自由液体蜂可摄取组合物和固体 蜂可摄取组合物组成的组的蜂可摄取组合物。在一些实施方案中，液体蜂可摄取组合物为 糖浆。在一些实施方案中，固体蜂可摄取组合物为粉饼或干混合物。
[0033] 附图简述
[0034]图1绘不了 一些蜂病毒的系统发育树。
[0035]图2A绘示了示出用蜂病毒触发混合物处理后的瓦螨的存活率的图。
[0036] 图2B绘示了示出在瓦螨直接饲喂实验中，通过Q-PCR测定的处理后72h瓦螨中的 DWV水平的图。
[0037] 图3绘示了示出在每100只蜂不同（0-3或4-62)的瓦螨计数中，蜂中DWV水平对瓦螨 中DWV水平的图。
[0038] 图4绘示了示出在用dsRNA触发物混合物(MIX)、非特异性dsRNA(SCR)或没有dsRNA (对照(CON))饲喂蜂4天、8天和14天之后，蜂中DWV复制的图。
[0039]图5A绘示了示出在瓦螨直接饲喂实验中，通过(>antiGenex测定的处理后3天的 瓦螨中DWV水平的图。
[0040] 图5B绘示了示出在瓦螨直接饲喂实验中，通过C^iiantiGene"测定的处理后72h瓦 螨中IAPV水平的图。
[0041] 图6A绘示了示出通过QuamiGeneK测定的蜂处理后4天的蜜蜂中DWV表达的图。
[0042] 图6B绘示了示出通过QuantiGene"测定的蜂处理后4天的蜜蜂中DWV复制的图。 [0043]图7A绘示了示出通S'QuantiGene?测定的蜂处理后4天的蜜蜂中IAPV表达的图。 [0044]图7B绘示了示出通过QuantiGene 1(测定的蜂处理后4天的蜜蜂中IAPV复制的图。
[0045]图8绘示了示出通过:QuantiGenek测定的蜂处理后4天的蜜蜂中LSV表达的图。
[0046] 详述
[0047] 除非另外定义，否则本文所用的技术性和科学性术语具有与本领域中技术人员通 常所理解的相同意思。本领域的技术人员将了解很多方法可以在本公开的实践中使用。实 际上，本公开决不限于所述方法和材料。本文中引用的任何参考文献均以全文引用方式并 入本文。出于本公开的目的，下文定义以下术语。
[0048] 如本文所使用，术语"约"是指± 10 %。
[0049] 因此，除非上下文另外明确指出，否则如在本文中使用，单数形式"一个(种)"和 "所述"包括多个指示物。例如，术语"一种化合物"或"至少一种化合物"可以包括多种化合 物，包括其混合物。
[0050] 除非另外规定，否则本说明书文本中的核酸序列当从左向右阅读时是以5'至3'方 向给出。应当理解，在本申请中公开的任何序列识别号（SEQ ID N0)根据SEQ ID N0被提及 的语境，可以指DNA序列或RNA序列，即使该SEQ ID NO只以DNA序列格式或RNA序列的格式被 表达。此外，如本领域的普通技术人员已知的，核酸序列的公开也公开了其反向互补的序 列，因为一者必然限定另一者。如果术语是以单数形式提供，那么本
【发明人】也预期由所述术 语的复数形式描述的本发明的方面。
[0051 ]蜂易受大量的病毒感染。到目前为止，已经鉴定了24种蜂病毒。大部分是正链RNA 病毒，其含有RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)。已经鉴定出具有两种主要结构形式的两个蜂病 毒系统发育家族。参见图1。使用QuamiGene l:分析针对9种不同的蜂病毒筛查美国的蜂现 场样品显示了畸翅病毒(DWV)、狄斯瓦螨病毒(VDV-1)、以色列急性麻痹病毒（IAPV)、急性蜂 麻痹病毒(ABPV)和克什米尔蜂病毒(KBV)的高流行率。西奈湖病毒(LSV)，包括西奈湖病毒-l(LSV-l)和西奈湖病毒-2(LSV-2)，是在蜂箱中发现的其他病毒。已证明通过下调特定的病 毒基因产物进行的病毒感染的治疗可以成功地消除蜂中病毒引发的感染(参见美国专利公 开2009/0118214)。本发明人现在公开了用于治疗瓦螨和蜂中的病毒感染的方法和组合物。 本发明人还公开了通过降低寄生瓦螨的病毒载量进行的蜂病毒感染的治疗。
[0052]根据一些实施方案，RNA干扰技术用于降低狄斯瓦螨和蜂中的病毒载量。瓦螨寄生 蛹和成虫蜂在蛹育雏室中繁殖。螨虫用它们的嘴巴刺穿外骨骼，并以蜂的血淋巴为食。施用 给所述蜂以治疗瓦螨侵袭的多核苷酸试剂出现在蜂的血淋巴中，从而可以为螨虫所用（参 见美国专利公开2012/0258646)。
[0053]在本公开的几个实施方案中，RNA干扰技术用于降低狄斯瓦螨和蜂中的病毒复制。 在本公开的几个实施方案中，RNA干扰技术用于减少或阻止蜂病毒从蜂或蜂幼虫到以蜂或 蜂幼虫为食的狄斯瓦螨的传播。在本公开的几个实施方案中，RNA干扰技术用于减少或阻止 蜂病毒从狄斯瓦螨到螨虫寄生的蜂或蜂幼虫的传播。
[0054]在本公开的一些实施方案中，RNA干扰技术用于降低蜂中的病毒载量。在一些实施 方案中，RNA干扰技术用于降低蜂群中的病毒载量。
[0055] 在本公开的一些实施方案中，RNA干扰技术用于降低蜂中的病毒复制。在一些实施 方案中，RNA干扰技术用于降低蜂群中的病毒复制。
[0056] RNA干扰是指由小RNA介导的在动物体内的序列特异性转录后基因沉默的过程。在 植物中的对应过程通常被称为转录后基因沉默或RNA沉默，并且在真菌中也被称为静息 (quelling)。虽然不受限于任何特定的理论，转录后基因沉默的过程被认为是用于阻止外 来基因表达的进化保守的细胞防御机制，并且通常由不同植物区系和门所共享。免遭外来 基因表达的所述保护可能已响应于源于病毒性感染或转位子元件通过特异性破坏同源单 链RNA或病毒基因组RNA的细胞反应随机整合至宿主基因组中的双链RNA(dsRNA)产生而进 化。在根据本公开的方面，核酸组合物导致靶生物体中的RNA干扰。在某些方面，当存在于宿 主生物体蜂或蜂幼虫中时，核酸组合物导致狄斯瓦螨中的RNA干扰。
[0057]短语"狄斯瓦螨"是指攻击东方蜜蜂(Apis cerana)和意大利蜜蜂的外部寄生螨 虫。所述螨虫可以在成虫期从蜂中取食，或在幼虫期处于蜜蜂育雏室内。
[0058]在本公开的一些实施方案中，蜂病毒选自由以下组成的组：急性蜂麻痹病毒 (ABPV)、畸翅病毒(DWV)、克什米尔蜂病毒(KBV)、黑蜂王台病毒（BQCV)、囊状幼虫病病毒 (SBV)、慢性蜂麻痹病毒(CPV)、云翅病毒(CWV)、以色列急性麻痹病毒(IAPV)、无脊椎动物虹 彩病毒6型（IIV-6)、狄斯瓦螨病毒(VDV-1)、Kakugo病毒(KV)和西奈湖病毒(LSV)。
[0059]在本公开的一些实施方案中，蜂病毒是正链RNA病毒。在一些实施方案中，蜂病毒 是负链RNA病毒。在一些实施方案中，蜂病毒是DWV。在一些实施方案中，蜂病毒是IAPV。在一 些实施方案中，蜂病毒是LSV。
[0060]如本文所用，"病毒载量"、"病毒水平"和"病毒表达"的测量是指蜂病毒序列的有 义链的检测，并且其在本公开中可互换使用。许多检测方法在本领域中是已知的，包括但不 限于，定量PCR(Q-PCR)和puantiGeiie' 1测定。在一些实施方案中，病毒载量或病毒表达测 量为平均荧光强度(MFI)，并用看家基因的MFI标准化来表示在蜂、蜂群或瓦螨中病毒的存 在。在一些实施方案中，病毒载量是活性病毒感染的严重性的量度。
[0061] 如本文所用，"病毒复制"的测量是指蜂病毒序列的负链的检测。在一些实施方案 中，病毒复制测量为平均荧光强度(MFI)，并用看家基因的MFI标准化来表示在蜂、蜂群或瓦 螨中病毒的复制。在一些实施方案中，病毒复制是活性病毒感染的严重性的量度。
[0062] 如本文所用，术语"病毒滴度"是指样品中的病毒的浓度。在一些实施方案中，通过 病毒滴度来测量病毒载量。用于计算病毒滴度的许多方法在本领域中是已知的，并且它们 包含在本申请中。
[0063] 如本文所用，术语"宿主"或"宿主生物体"是指居住了寄生虫并为寄生虫提供营养 的生物体。"寄生虫"是与宿主生物体有非相互共生关系并以宿主生物体为代价受益的生物 体。在一些实施方案中，宿主生物体是蜂。在一些实施方案中，寄生虫是瓦螨。
[0064] 如本文所用，术语"蜂"是指成年蜂及其蛹细胞。根据一个方面，蜂在蜂箱中。成年 蜂被定义为几种有翼的、身体有毛的、通常有刺的膜翅目（Hymenoptera)蜜蜂总科 (Apoidea)的昆虫任意一种，包括独居物种和社会物种并且特征在于用于收集花蜜和花粉 的刺吸式口器和咀嚼式口器。蜂物种的实例包括但不限于蜜蜂属(Apis)、熊蜂属(Bombus)、 无刺蜂属(Trigona)、壁蜂属(Osmia)等。在一个方面，蜂包括但不限于熊蜂(欧洲熊蜂）、蜜 蜂（意大利蜜蜂）（包括采集蜂和巢蜂)和东方蜜蜂。本公开提供并且包括，用于治疗作为宿 主或作为寄生虫的昆虫的方法和组合物。
[0065] 根据一个方面，蜂是蜂群的部分。术语"蜂群"是指包括数十只到通常数万只合作 筑巢、收集食物和育雏饲养的蜂的一群蜂。一个蜂群通常有一只蜂王，其余的蜂是"工蜂" (雌性)或"雄蜂"（雄性）。蜂群的社会结构是由蜂王和工蜂维护，并依赖于有效的沟通系统。 工蜂等级内的劳动分工主要取决于蜂的年龄，但是会随着蜂群的需要而变化。繁殖和蜂群 能力取决于蜂王、食物贮存的数量和工蜂力量的大小。蜜蜂也可以被分类为："巢蜂"，通常 是工蜂一生中的第一部分，在此期间"巢蜂"在蜂巢内执行任务;和"采集蜂"，工蜂一生中的 后半部分，在此期间"采集蜂"从蜂巢外定位和收集花粉和花蜜，并将花粉或花蜜带入蜂巢 中食用和贮存。本公开提供并且包括，用于治疗昆虫群体的方法和组合物。
[0066] 如本文所用，术语"寄生虫"是指以其他宿主、生物体为代价直接受益的成年和不 成熟的生物体形式，例如以宿主的血液或体液为食、生活在宿主生物体细胞的细胞内或生 活在宿主生物体的体内。本公开提供并且包括，用于治疗寄生虫的方法和组合物。在一个方 面，寄生虫是狄斯瓦螨。
[0067]如本文所用，短语"RNA沉默"是指RNA分子介导的一组调节机制（例如，RNA干扰 (RNAi)、转录基因沉默(TGS)、转录后基因沉默(PTGS)、静息、共抑制和翻译抑制），其导致对 应病毒基因的表达抑制或"沉默"。RNA沉默已在许多类型的生物体观察到，包括植物、动物 和真菌。在本公开的方面，核酸组合物提供RNA沉默。在某些方面，所述核酸组合物提供蜂寄 生虫中病毒基因的沉默。
[0068]本公开提供了用于在狄斯瓦螨或在蜂群中减少病毒载量或抑制病毒复制的方法， 所述方法包括：向所述狄斯瓦螨或蜂群提供包含有效量的至少一种触发多核苷酸的组合 物，所述触发多核苷酸包含与蜂病毒基因的至少21个连续核苷酸的序列基本上同一或基本 上互补的核酸序列，从而在狄斯瓦螨或在蜂群中降低病毒载量或抑制病毒复制。在一些实 施方案中，所述病毒选自由以下组成的组:急性蜂麻痹病毒(ABPV)、畸翅病毒(DWV)、克什米 尔蜂病毒(KBV)、黑蜂王台病毒(BQCV)、囊状幼虫病病毒(SBV)、慢性蜂麻痹病毒(CPV)、云翅 病毒(CWV)、以色列急性麻痹病毒（IAPV)、无脊椎动物虹彩病毒6型（IIV-6)、狄斯瓦螨病毒 (VDV-1)、Kakugo病毒(KV)和西奈湖病毒(LSV)。
[0069] 本公开还提供了用于向狄斯瓦螨、蜂或蜂群提供的组合物，所述组合物包含有效 量的触发多核苷酸，所述触发多核苷酸包含与蜂病毒基因的至少21个连续核苷酸的序列基 本上同一或基本上互补的核酸序列。在一些实施方案中，所述组合物在狄斯瓦螨、蜂或蜂群 中降低病毒载量或抑制病毒复制。在一些实施方案中，所述组合物增加蜂或蜂群对蜂病毒 引起的疾病的耐受性。
[0070] 在一些实施方案中，所述触发多核苷酸是单链DNA(ssDNA)、单链RNA(ssRNA)、双链 RNA( dsRNA)、双链DNA( dsDNA)或双链DNA-RNA杂合体。
[0071 ]在一些实施方案中，所述触发多核苷酸下调病毒基因。在一些实施方案中，所述病 毒基因编码外壳蛋白、RdRp、VPl、VP2或解旋酶。在一些实施方案中，所述触发多核苷酸包含 与选自由SEQ ID ^):1-21组成的组的序列或其片段具有至少约80%、85%、88%、90%、 92%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性或互补性，或具有100%的序列同一性或 互补性的核酸序列。在一些实施方案中，所述触发多核苷酸包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个不 同的触发多核苷酸的混合物，所述触发多核苷酸靶向不同的病毒、或靶向相同病毒的不同 基因、或靶向病毒基因的不同片段。
[0072] 本公开还提供了用于降低蜂群中的病毒载量的方法，所述方法包括:通过向蜂群 寄生虫提供包含有效量的触发多核苷酸的组合物来减少所述寄生虫中的病毒载量，所述触 发多核苷酸包含与蜂病毒基因的至少21个连续核苷酸的序列基本上同一或基本上互补的 核酸序列，从而抑制寄生虫中的病毒复制并降低蜂群中的病毒载量。在一些实施方案中，所 述寄生虫是狄斯瓦螨。
[0073] 本公开还提供了用于降低蜂对蜂病毒引起的疾病的易感性的方法，所述方法包 括：向蜂寄生虫提供包含有效量的触发多核苷酸的组合物，所述触发多核苷酸包含与蜂病 毒基因的至少21个连续核苷酸的序列基本上同一或基本上互补的核酸序列，从而抑制寄生 虫中的病毒复制并降低蜂对蜂病毒引起的疾病的易感性。在一些实施方案中，疾病是蜂群 装竭失调症(CCD)。在一些实施方案中，寄生虫是狄斯瓦螨。
[0074] 在一些实施方案中，包含有效量的触发多核苷酸的所述组合物是通过喷洒瓦螨、 通过直接饲喂瓦螨、通过直接饲喂蜂群中的蜂或其任何组合来提供。
[0075] 在一个方面，本公开提供了用于在狄斯瓦螨中减少病毒载量或抑制病毒复制的方 法，所述方法包括：向狄斯瓦螨提供包含有效量的触发多核苷酸的组合物，所述触发多核苷 酸包含与病毒序列基本上同一或基本上互补的核酸序列，从而在狄斯瓦螨中抑制病毒复制 或减少病毒载量。
[0076] 在一个方面，本公开提供了用于在蜂或蜂群中减少病毒载量或抑制病毒复制的方 法，所述方法包括：向蜂或蜂群提供包含有效量的触发多核苷酸的组合物，所述触发多核苷 酸包含与病毒序列基本上同一或基本上互补的核酸序列，从而在蜂或蜂群中抑制病毒复制 或减少病毒载量。
[0077] 在一个方面，本公开提供了在蜂或蜂群中减少病毒载量或抑制病毒复制的方法， 所述方法包括:通过向蜂或蜂群寄生虫提供包含有效量的触发多核苷酸的组合物来减少所 述寄生虫中的病毒载量或抑制病毒复制，所述触发多核苷酸包含与病毒序列基本上同一或 基本上互补的核酸序列，从而抑制寄生虫中的病毒复制并降低蜂群中的病毒载量。在一些 实施方案中，所述寄生虫是狄斯瓦螨。
[0078] 在一个方面，本公开提供了用于在狄斯瓦螨中减少病毒载量或抑制病毒复制的方 法，所述方法包括：向狄斯瓦螨施用包含有效量的至少一种触发多核苷酸的组合物，所述触 发多核苷酸包含下调狄斯瓦螨中的病毒基因表达的核酸序列，从而在狄斯瓦螨中降低病毒 载量或抑制病毒复制。在一些实施方案中，所述核酸序列是与病毒基因或其片段基本上同 一或基本上互补的触发多核苷酸。
[0079] 在一个方面，本公开提供了用于在蜂群中减少病毒载量或抑制病毒复制的方法， 所述方法包括:通过向蜂群寄生虫提供包含有效量的触发多核苷酸的组合物来减少所述寄 生虫中的病毒载量或抑制病毒复制，所述触发多核苷酸包含与病毒序列基本上同一或基本 上互补的核酸序列，从而抑制寄生虫中的病毒复制并降低蜂群中的病毒表达。在一些实施 方案中，所述寄生虫是狄斯瓦螨。
[0080] 在一个方面，本公开提供了用于降低蜂对蜂病毒引起的疾病的易感性的方法，所 述方法包括：向蜂寄生虫提供包含有效量的触发多核苷酸的组合物，所述触发多核苷酸包 含与病毒序列基本上同一或基本上互补的核酸序列，从而抑制寄生虫中的病毒复制并降低 蜂对蜂病毒引起的疾病的易感性。在一些实施方案中，寄生虫是狄斯瓦螨。在一些实施方案 中，疾病是蜂群衰竭失调症(CCD)。
[0081] 如本文所用，术语"触发物"或"触发多核苷酸"是指一种生物活性的多核苷酸分 子，其与靶基因或由靶基因表达的RNA的多核苷酸序列或其片段基本上同源或互补，并且起 作用来抑制靶基因的表达或产生敲低表型。触发多核苷酸能够抑制或"沉默"靶基因的表 达。触发多核苷酸通常与其"靶序列"相关地进行描述。触发多核苷酸可以是单链DNA (ssDNA)、单链RNA(ssRNA)、双链RNA(dsRNA)、双链DNA(dsDNA)或双链DNA/RNA杂合体。触发 多核苷酸可以包括天然存在的核苷酸、经修饰的核苷酸、核苷酸类似物或其任何组合。在一 些实施方案中，触发多核苷酸可以合并在更大的多核苷酸内，例如合并在pri-miRNA分子 内。在一些实施方案中，触发多核苷酸可以加工成小干扰RNA(siRNA)。在一个方面，触发多 核苷酸能够抑制病毒基因的表达。在另一个方面，触发多核苷酸能够被用于抑制病毒基因 的表达并从而减少宿主生物体的病毒载量的方法中。在某些方面，所述病毒基因是DWV、 VDV-1、IAPV、ABPV、KBV或LSV基因，并且所述宿主生物体是狄斯瓦螨。
[0082] 如本文所用，术语"祀序列"或"祀基因"是指出现在触发多核苷酸被引导针对的基 因或基因产物中的核苷酸序列。在本上下文中，术语"基因"是指基因组序列中的可定位的 区域，对应于遗传的单位，其包括调节区（诸如启动子、增强子）、5'非翻译区、内含子区、3' 非翻译区、转录区和在植物基因组中作为天然基因或转基因存在的其他功能序列区域。根 据情况，术语靶序列或靶基因可以指被靶向用于抑制的基因或基因产物的全长核苷酸序 列，或被靶向用于抑制的基因或基因产物的部分核苷酸序列。
[0083] 如本文所用，术语"来源于"是指可从特定的指定来源或物种获得的指定核苷酸序 列，即使不一定直接来自所述指定来源或物种。
[0084] 如本文所用，术语"序列"、"核苷酸序列"或"多核苷酸序列"是指DNA分子、RNA分子 或其部分的核苷酸序列。
[0085] 术语"多核苷酸"是指由核苷酸间键连接的单核苷酸的任何聚合物。多核苷酸可以 由天然存在的核糖核苷酸、天然存在的脱氧核糖核苷酸、天然存在的核苷酸的类似物（例 如，天然存在的核苷酸的对映体形式)或它们的任何组合构成。如果多核苷酸是单链的，那 么其长度可以核苷酸的数量的方式进行描述。如果多核苷酸是双链的，那么其长度可以碱 基对的数量的方式进行描述。
[0086]如本文所用，术语"不可转录的多核苷酸"是指不包含完整的聚合酶II转录单位的 多核苷酸。
[0087]术语"基因表达"是指经由RNA聚合酶的酶促作用通过基因转录将基因组DNA编码 的遗传信息转化成RNA (例如，mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)并且通过mRNA的翻译转化成蛋白质 的过程。基因表达可在此过程中的许多阶段加以调控。
[0088]在本文所述的实施方案中，病毒序列被选择作为触发多核苷酸的靶标。在一些实 施方案中，靶序列因为包含低G/C含量而被选择，因为与G/C含量高于55 %的那些相比，低G/ C含量的序列已经被证明在介导基因沉默中更有效。在一些实施方案中，沿着靶基因的长度 选择几个靶位点。
[0089]在一些实施方案中，所述触发多核苷酸包含与病毒基因或其片段基本上互补或基 本上同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述触发多核苷酸包含与蜂病毒基因的至少 21个连续核苷酸的序列基本上互补或基本上同一的核酸。在一些实施方案中，所述触发多 核苷酸包含与蜂病毒基因的至少 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个连续核 苷酸的序列基本上互补或基本上同一的核酸。在一些实施方案中，所述病毒基因编码外壳 蛋白、RdRp、病毒蛋白1 (VP1)、VP2或解旋酶。在一些实施方案中，所述触发多核苷酸包含与 DWV或IAPV基因或其片段基本上互补或基本上同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述 触发多核苷酸包含与LSV基因或其片段基本上互补或基本上同一的核苷酸序列。在一些实 施方案中，所述触发多核苷酸包含与急性蜂麻痹基因或其片段基本上互补或基本上同一的 核苷酸序列。在一些实施方案中，所述触发多核苷酸包含与克什米尔蜂病毒基因或其片段 基本上互补或基本上同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述触发多核苷酸包含与黑 蜂王台病毒基因或其片段基本上互补或基本上同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，所 述触发多核苷酸包含与慢性蜂麻痹病毒基因或其片段基本上互补或基本上同一的核苷酸 序列。在一些实施方案中，所述触发多核苷酸包含与云翅病毒基因或其片段基本上互补或 基本上同一的核苷酸序列。
[0090] 多蜂病原体序列可以设计成包括适于产生有效针对多于一种蜂病毒的触发多核 苷酸的序列。此类多蜂病原体dsRNA可以是长或短变种，并且可以包括对应于一类蜂病毒的 同源序列的序列。此外，可以设计多个序列包括相同蜂病原体的两种或更多种dsRNA序列。
[0091] "基本上同一"或"基本上互补"意指生物活性多核苷酸触发物(或双链多核苷酸或 其部分的至少一条链、或单链多核苷酸的部分)在生理条件下与内源性基因、从其转录的 RNA或其片段杂交，从而实现内源性基因的调控或抑制。例如，在一些实施方案中，与靶基因 或由靶基因转录的 RNA 中的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、 53、54、55、56、57、58、59、60或更多连续核苷酸的序列相比，生物活性多核苷酸触发物具有 100% 的序列同一性或至少约 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、 97、98或99%的序列同一性。在一些实施方案中，与靶基因或由靶基因转录的RNA中的10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或 更多连续核苷酸的序列相比，生物活性多核苷酸触发物具有100 %的序列互补性或至少约 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或 99% 的序列互补性。在 一些实施方案中，生物活性多核苷酸触发物与给定靶基因（基因的编码或非编码序列）的一 个等位基因或一个家族成员具有100%的序列同一性或互补性。在一些实施方案中，生物活 性多核苷酸触发物与给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有至少约80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的序列同一性或互补性。在一些实 施方案中，生物活性多核苷酸触发物与给定靶基因的多个等位基因或家族成员具有100% 的序列同一性或互补性。
[0092]如本文所用，当从5'至3'读取的核酸序列之一的每个核苷酸与从3'至5'读取时的 另一个序列的每个核苷酸互补时，可称所述核酸序列分子表现出"完全互补性"。与参考核 苷酸序列完全互补的核苷酸序列将表现出与参考核苷酸序列的反向互补序列同一的序列。 [0093]应当理解，本公开的触发多核苷酸，例如dsRNA，不必限于仅含有天然核苷酸的那 些分子，而是还包括化学修饰的核苷酸和非核苷酸。本公开的触发多核苷酸试剂也可以包 括碱基修饰或取代。如本文所用，"未修饰的"或"天然的"碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟 嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的碱基包括但不限于 其他合成和天然碱基，诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其 他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶）、4_硫尿 嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫烷基、8-羟基和其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤基(特 别是5-溴）、5_三氟甲基和其他5-取代尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺 嘌呤。另外的碱基包括公开于美国专利号3,687,808中的那些、公开于The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,第858-859页，Kroschwitz，J.I·编 著John Wiley&Sons，1990中的那些、由Englisch等，Angewandte Chemie，International Edition, 1991,613公开的那些以及由Sanghvi，Y.S.，第15章 ，Antisense Research and Applications，第289-2页，Crooke，S · T ·和Lebleu，B ·编著，CRC Press，1993公开的那些。此 类碱基特别适用于增强本公开的低聚化合物的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮 杂嘧啶以及N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔 基胞嘧啶。已显示5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2°(：(3 &1^^1￥5等 (1993)Antisense Research and Applications，CRC Press,Boca Raton 276-278)，并且 是目前优选的碱基取代，尤其是当与2'-0_甲氧基乙基糖修饰结合时。
[0094]本公开的触发多核苷酸在合成之后可任选地进行纯化。例如，多核苷酸可以通过 用溶剂或树脂萃取、沉淀、电泳、色谱或其组合从混合物中纯化。可替代地，触发多核苷酸可 以在不纯化或者最低纯化下使用以避免由样品加工造成的损失。触发多核苷酸可以被干燥 存储或溶解在水溶液中。所述溶液可以含有缓冲剂或盐，以促进双螺旋链的退火和/或稳 定。
[0095] 如本文所用，术语"同源性"和"同一性"当涉及核酸使用时，描述两个或更多个核 苷酸序列之间的相似程度。两序列间的"序列同一性"百分比通过在比较窗比较两个最优对 准的序列来确定，这样相比于参考序列（其不包含添加或缺失），比较窗中的序列部分可包 含添加或缺失（即空位），以用于两个序列的最优比对。所述百分比是通过以下进行计算:确 定两个序列中出现同一的核酸碱基或氨基酸残基的位置数以得到匹配位置数，用匹配位置 数除以比较窗口中的位置总数，并且将结果乘以100而得到序列同一性百分比。与参考序列 相比较时每个位置都同一的序列可称是与参考序列同一，反之亦然。可以使用任何合适的 计算机程序来执行两个或更多个序列的比对。例如，广泛使用和接受的用于执行序列比对 的计算机程序是CLUSTALW vl.6(Thompson等Nucl.Acids Res. ,22:4673-4680,1994)。
[0096] 如本文所用，"对照生物体"是指不包含触发多核苷酸或其他提供病毒感染或病毒 复制对照的核酸的生物体。对照生物体通常来自与治疗生物体相同的物种，并且处于在相 同的生长条件生长的相同发育阶段。类似地，"对照群体"意指不包含触发多核苷酸或其他 提供病毒感染或病毒复制对照的核酸的生物体群体。对照生物体群体通常来自与治疗生物 体群体相同的物种，并且处于在相同的生长条件生长的相同发育阶段。
[0097]如本文所用，术语"治疗"包括病状的消除、基本上抑制、减慢或逆转其进展，基本 上改善病状的临床或美学症状，或基本上预防病状的临床或美学症状的出现。在根据本公 开内容的一个方面，组合物可以用于治疗生物体或生物体群体的病毒感染。在一个方面， dsRNA组合物可以用于治疗宿主生物体或寄生虫的病毒感染。在一个方面，宿主生物体是 蜂，并且寄生虫是螨虫狄斯瓦螨。在一个方面，本公开提供了用于治疗蜂群衰竭失调症 (CCD)的方法。
[0098]如本文所用，术语"改善"、"改善的"、"增加"和"增加的"是指相比于对照生物体或 群体，以至少约2%、至少约3 %、至少约4%、至少约5 %、至少约10 %、至少约15 %、至少约 20 %、至少约25 %、至少约30 %、至少约35 %、至少约40 %、至少约45 %、至少约50 %、至少约 60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或更多增加的生物体或群体的总数，增加的生 物体或群体的生产率(例如，增加的蜂蜜产量），增加的生物体或群体的生长率，或增加的繁 殖率。本公开提供了通过提供抗病毒组合物改善生物体或群体的健康的方法。
[0099]如本文所用，在一些实施方案中"病毒载量"，也称为"病毒负荷"、"病毒滴度"、"病 毒水平"或"病毒表达"，是病毒感染的严重性的量度，并且可以通过估计被感染的生物体、 有关的体液或受影响的群体中病毒的量进行计算。它也可以通过估计或测量被感染的生物 体、有关的体液或受影响的群体中蜂病毒序列的有义链的量进行计算。
[0100] 如本文所用，试剂(诸如蛋白质或mRNA)水平的"减少"意指，相对于缺少能够减少 所述试剂的触发多核苷酸(例如dsRNA分子)的生物体或群体而言水平减少。也如本文所用， 关于病毒载量的"减少"意指，相对于缺少能够降低病毒载量的核酸或其他dsRNA分子的生 物体或群体而言病毒载量减少。本公开提供了并且包括，用于减少病毒蛋白或病毒基因表 达水平和减少病毒载量的方法和组合物。本公开也提供了用于降低瓦螨或蜂中的病毒复制 水平的方法和组合物。
[0101] 如本文所用，术语试剂(诸如蛋白质或mRNA)水平的"至少部分减少"意指，相对于 缺少能够减少所述试剂的触发多核苷酸(例如dsRNA分子)的生物体或群体而言水平减少至 少25%。也如本文所用，关于病毒载量的"至少部分减少"意指，相对于缺少能够降低病毒载 量的核酸或其他dsRNA分子的生物体或群体而言水平减少至少25%。本公开提供了并且包 括，用于至少部分减少病毒蛋白或病毒基因表达水平和至少部分减少病毒载量的方法和组 合物。
[0102] 如本文所用，试剂(诸如蛋白质或mRNA)水平的"实质减少"意指，相对于缺少能够 减少所述试剂的触发多核苷酸(例如dsRNA分子)的生物体或群体而言水平减少，其中所述 试剂水平的减少是至少75%。也如本文所用，关于病毒载量的"实质减少"意指，相对于缺少 能够降低病毒载量的核酸或其他dsRNA分子的生物体或群体而言病毒载量减少至少75%。 本公开提供了并且包括，用于实质减少病毒蛋白或病毒基因表达水平和实质减少病毒载量 的方法和组合物。
[0103] 如本文所用，试剂(诸如蛋白质或mRNA)的"有效消除"是相对于缺少能够减少所述 试剂的触发多核苷酸(例如dsRNA分子）的生物体或群体而言的，其中所述试剂水平的减少 大于95%。触发多核苷酸，优选dsRNA分子，优选能够提供至少部分减少、更优选实质减少或 最优选有效消除另外的试剂，诸如病毒蛋白或病毒基因的表达，或病毒，其中所述试剂使宿 主基因的表达水平基本上不受影响、实质上不受影响或部分不受影响。也如本文所用，关于 病毒载量的"有效消除"意指，相对于缺少能够减少病毒蛋白、病毒基因表达或病毒载量的 核酸或其他dsRNA分子的生物体或群体而言病毒载量减少至少95%。本公开提供了并且包 括，用于有效消除病毒蛋白或病毒基因表达和有效消除病毒感染的方法和组合物。
[0104]如本文所用，术语"抑制"、"压制"和"下调"当涉及核酸分子在生物体中的表达或 活性时，在本文中等同地使用，并且意指使用本公开的方法后，所述核酸分子在生物体或群 体的细胞中的表达或活性的水平低于使用所述方法前其在生物体或群体的细胞中的表达 或活性，或低于缺少本公开的核酸分子对照生物体或群体。本公开提供了并且包括，用于在 生物体或群体中抑制、压制和下调病毒蛋白或病毒基因表达水平以及抑制、压制和下调病 毒感染水平的方法和组合物。本公开还提供了用于在生物体或群体中抑制、压制和下调病 毒复制水平的方法和组合物。在一些实施方案中，所述生物体是瓦螨。在一些实施方案中， 所述生物体是蜂。在一些实施方案中，所述群体是蜂群。
[0105] 如本文所用的术语"抑制"、"压制"和"下调"是同义词，并且在本文中意指靶向核 酸分子的表达或活性更低，优选显著更低。也如本文所用，关于病毒感染或病毒载量的"抑 制"、"压制"和"下调"意指，相对于缺少能够降低病毒基因表达的核酸或其他dsRNA分子的 生物体或群体而言感染水平或病毒载量更低，优选显著更低。本公开提供了并且包括，用于 抑制、压制和下调病毒蛋白或病毒基因的表达或活性以及抑制、压制和下调病毒感染性的 方法和组合物。
[0106] 在一些实施方案中，所述触发多核苷酸是单链DNA(ssDNA)、单链RNA(ssRNA)、双链 RNA(dsRNA)、双链DNA(dsDNA)或双链DNA-RNA杂合体。在一些实施方案中，所述触发多核苷 酸是dsRNA。
[0107] 在一些实施方案中，所述触发多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO: 1-21组成的组的 序列或其片段具有至少约 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性，或具有 100% 的序列同 一性的核酸序列。在一些实施方案中，所述触发多核苷酸包含与选自由SEQ ID N0:1-21组 成的组的序列或其片段具有至少约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99% 的序列互补性，或具有 100%的序列互补性的核酸序列。在一些实施方案中，所述触发多核苷酸组合物包含与由选 自 SEQ ID 吣：1-21的序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、 56、57、58、59或60个连续核苷酸组成的序列基本上同一或基本上互补的核酸序列。
[0108] 在某些方面，本公开提供了dsRNA组合物，其包含与选自由SEQ ID NO:1-21组成的 组的序列或其片段具有至少约 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性或序列互补性的 核苷酸序列。在某些方面，所述dsRNA组合物包含与选自SEQ ID NO :1-21的序列或其片段具 有100%同一性或互补性的核苷酸序列。在另一个方面，本公开提供了编码至少一种dsRNA 前体的DNA，其包含与选自由SEQ ID NO: 1-21组成的组的序列或其片段具有100%同一性或 互补性，或与选自由SEQ ID N0:1-21组成的组的序列或其片段具有至少约80%、81 %、 82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%或99%的序列同一性或序列互补性的核苷酸序列。在又一方面，本公开提供了编 码至少一种dsRNA前体的重组DNA，其包含选自由SEQ ID N0:1-21或其片段组成的组的核苷 酸序列、异源启动子和转录终止子序列。在另一个方面，本公开提供了编码至少一种dsRNA 前体的重组DNA，其包含与选自由SEQ ID NO: 1-21组成的组的序列或其片段具有至少约 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95 %、96 %、97 %、98 %或99 %的序列同一性或序列互补性的核苷酸序列，并且还包含异源 启动子和转录终止子。
[0109]在几个实施方案中，本公开提供了包含至少一种触发多核苷酸的组合物。在一些 实施方案中，所述组合物包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的触发多核苷酸的混合物。 在一些实施方案中，所述组合物包含2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的触发多核苷酸的混合 物。在一些实施方案中，所述触发多核苷酸可以靶向不同的病毒。在一些实施方案中，所述 触发多核苷酸可以靶向同一病毒的不同基因。在一些实施方案中，所述触发多核苷酸可以 靶向病毒序列或病毒基因的不同片段。
[0110]应该理解的是，所述触发多核苷酸，例如dsRNA，可以以各种各样的方式递送到害 虫或寄生虫。根据一个方面，所述触发多核苷酸直接递送到寄生虫(例如，通过喷洒螨虫侵 袭的蜂房）。触发多核苷酸或编码触发多核苷酸的构建体可以通过扩散进入螨虫的体内。在 另一个方面，触发多核苷酸通过宿主生物体间接地递送(例如，通过向蜂提供包含触发多核 苷酸的蜂食物）。在一个方面，寄生虫是狄斯瓦螨。在一个方面，宿主生物体是蜂。
[0111] 应当理解，由于许多寄生虫使用它们的嘴刺穿宿主节肢动物的外骨骼并以节肢动 物的血淋巴为食，本公开设想递送本公开的触发多核苷酸(例如dsRNA)至宿主节肢动物，由 此使触发多核苷酸呈现在宿主节肢动物的血淋巴中从而为寄生虫可用。因此，根据另一个 方面，核酸试剂间接地递送到寄生虫(例如经由宿主蜂递送到螨虫）。在某些方面，害虫或寄 生虫是狄斯瓦螨，并且宿主节肢动物是蜂。
[0112] 根据一个方面，触发多核苷酸(例如dsRNA)通过喷洒递送到被侵袭的宿主。触发多 核苷酸（例如dsRNA)或编码触发多核苷酸的构建体可以通过扩散进入宿主的体内。在某些 方面，害虫或寄生虫是狄斯瓦螨，并且宿主节肢动物是蜂。
[0113] 根据另一方面，触发多核苷酸(例如dsRNA)通过宿主的食物递送到宿主。本发明人 认为在摄取本公开的触发多核苷酸之后，触发多核苷酸可以呈现在例如宿主节肢动物的宿 主血淋巴中，从而为寄生虫(例如瓦螨)可用。
[0114] 在一个方面，本公开的多核苷酸可以在体外合成，并添加到食物中。例如双链RNA 可以通过在基因片段的末端添加两个相反的启动子(例如T7启动子)合成，其中紧靠基因5' 端放置启动子，并且在相反取向上紧靠基因片段的3'端放置启动子。然后，所述dsRNA可以 用T7RNA聚合酶体外转录。
[0115] 根据本公开的方面用于合成dsRNA的序列的非限制性实例在SEQ ID N0:1-21中提 供。这些序列的全长或片段可以用作模板。
[0116] 本申请提供并公开了包含触发多核苷酸和赋形剂物质的组合物。在一个方面，赋 形剂可以是一种或多种非活性成分的组合。在一些方面，赋形剂包含糖。糖的实例包括己 糖、二糖、三糖和更高级的糖。赋形剂糖包括，例如，果糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、半乳 糖、核糖。在其他方面，赋形剂包含糖和溶剂。在其他方面，赋形剂包含蛋白质。在一个方面， 蛋白质是大豆蛋白。在其他方面，赋形剂是花粉。在根据本公开的方面，赋形剂是蜂食物。
[0117] 在一些实施方案中，赋形剂包括选自糖、溶剂、蛋白质、蜂食物和其任何组合的一 种或多种物质。在一些实施方案中，糖选自果糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、半乳糖、核糖 和其任何组合。在一些实施方案中，蜂食物选自蜂蜜、花粉、乳清酵母、大豆粉、酵母、酵母产 品和其任何组合。
[0118] 蜂饲喂是养蜂者中常见的做法，用于提供营养和其他，例如，补充需求。蜂通常以 蜂蜜和花粉为食，但已知也摄取非天然饲料。蜂可以被饲喂各种食物，包括但不限于，乳清 酵母（生长在低脂干酪（cottage cheese)上的乳制品酵母）、大豆粉、酵母(例如啤酒酵母 (brewer's yeast)、圆酵母(torula yeast))和单独或组合地饲喂的酵母制品，以及作为蜂 巢内的干混合物或湿饼或者作为蜂巢外敞开式饲喂器中的干混合物饲喂的大豆粉。糖或糖 浆也是可用的。在饲喂给蜂的补充物中加入10至12%的花粉改善适口性。加入25至％的花 粉提高蜂用于生命活动所需的必需营养物的质量和数量。甘蔗或甜菜糖、异构化玉米糖浆 和50型糖浆是蜜蜂的自然饮食中蜂蜜的令人满意的替代品。后两种只能作为液体供应给 蜂。可通过例如下列方法中的任一种将液体饲料供应给蜂巢内的蜂:靠摩擦拧紧盖子的桶 (friction-top pail)、育卵室内的蜂房、柜式饲喂器、boardman饲喂器等。可通过在倒置的 内罩上放置一镑或两镑来饲喂干糖。水的供应必须是蜂一直都可获取的。在一个方面，设想 了其中存在漂浮的支持物(例如木片、软木塞或塑料海绵）的盘或托盘。蜂的补充饲料的详 述可在例如由 Standifer 等 1977,标题为"Supplemental Feeding of Honey Bee Colonies"的USDA出版物（USDA，Agriculture Information Bulletin Νο·413)中找到。
[0119] 在一些实施方案中，蜂饲喂包括向宿主蜂提供选自由液体蜂可摄取组合物和固体 蜂可摄取组合物组成的组的蜂可摄取组合物。
[0120]在根据本公开的方面，触发多核苷酸（例如dsRNA)与赋形剂组合。在一个方面，触 发多核苷酸(例如dsRNA)可以以触发多核苷酸与赋形剂的一定比率提供。在一个方面，比率 是1份触发多核苷酸对4份赋形剂。在一个方面，触发多核苷酸与赋形剂的比率是1:1、1: 2、 1:5或1:10。在其他方面，触发多核苷酸与赋形剂的比率是1:20、1 :25、1:30、1:40或更多。在 一个方面，触发多核苷酸与赋形剂的比率是1:50。在根据本公开的方面，比率可以被确定为 体积对体积比（v/v)、重量:重量比(w/w)或重量:体积比(w/v)。在某些方面，比率可以被表 达为体积对体积比（V/V)、重量:重量比(w/w)或重量:体积比(w/v)。
[0121] 在根据本公开的方面，组合物可以包含与赋形剂组合的一定重量的触发多核苷酸 (例如dsRNA)。在一个方面，触发多核苷酸占组合物总重量的一定百分比。在一个方面，触发 多核苷酸按重量计占组合物的约0.1%。在一个方面，触发多核苷酸按重量计占组合物的约 0.2 %。在一个方面，触发多核苷酸按重量计占组合物的约0.3 %。在另一个方面，触发多核 苷酸按重量计占组合物的约0.4%。在一个方面，触发多核苷酸按重量计占组合物的多达 0.5 %。在一个方面，触发多核苷酸按重量计占组合物的多达0.6 %。在一个方面，触发多核 苷酸按重量计占组合物的多达0.7%。在一个方面，触发多核苷酸按重量计占组合物的多达 0.8%。在另一个方面，触发多核苷酸按重量计占组合物的多达1.0%。在其他方面，触发多 核苷酸按重量计占组合物的多达1.5%。在另外其他方面，触发多核苷酸按重量计占组合物 的多达2.0%，或者2.5%。
[0122] 本公开提供了并且包括具有按重量计0.1 %至5 %的触发多核苷酸的组合物。在其 他方面，组合物包含按重量计0.1至4%、0.1至3%、0.1至2%、0.1至1%、0.1至2%、0.1至 3 %或0.1至4 %的触发多核苷酸。在一个方面，组合物包含按重量计0.2 %至5 %的触发多核 苷酸。在其他方面，组合物包含按重量计〇. 2至4%、0.2至3%、0.2至2%、0.2至1 %、0.2至 2%、0.2至3%或0.2至4%的触发多核苷酸。在其他方面，组合物包含多达1 %、多达2%、多 达3%、多达4%或多达5%的触发多核苷酸。在其他方面，组合物包含多达7.5%、多达10% 或多达15%的触发多核苷酸。
[0123] 本公开提供了并且包括具有0.01至20mg/ml的触发多核苷酸的组合物。在一些方 面，组合物包含0.01至0 · lmg/ml、0 · 01至1 · Omg/ml、0 · 01至2 .Omg/ml、0 · 01至2 · 5mg/ml、0 · 01 至5mg/ml、0 · 01至10mg/ml、0.01至15mg/ml或0 · 01至20mg/ml的触发多核苷酸。在一些方面， 组合物包含0 · 1 至1 · 〇mg/ml、0 · 1至2 · Omg/ml、0 · 1至2 · 5mg/ml、0 · 1 至5mg/ml、0 · 1 至10mg/ml、 0· 1至15mg/ml或0· 1至20mg/ml的触发多核苷酸。在某些方面，组合物包含至少0.01μg/ml触 发多核苷酸。在某些方面，组合物包含至少〇. lμg/ml触发多核苷酸。在某些其他方面，组合 物包含至少l.〇μg/ml触发多核苷酸。在另外其他方面，组合物包含至少10μg/ml触发多核苷 酸。在另外其他方面，组合物包含至少15μg/ml触发多核苷酸。在另外其他方面，组合物包含 至少20μg/ml触发多核苷酸。在一个方面，组合物包含0.01至0.5mg/ml触发多核苷酸。在一 个方面，组合物包含0.5至10mg/ml触发多核苷酸。在一些方面，组合物包含0.5至1.0mg/ml、 0·5至2·0mg/ml、0·5至2·5mg/ml、0·5至5mg/ml、0·5至10mg/ml、0·5至15mg/ml或0·5至20mg/ ml的触发多核苷酸。在一个方面，组合物包含1.0至10mg/ml触发多核苷酸。在其他方面，组 合物包含0 · 01至0 · 02mg/ml、0 · 02至0 · 03mg/ml、0 · 03至0 · 04mg/ml、0 · 04至0 · 05mg/ml、0 · 05 至0·06mg/ml、0·06至0·07mg/ml、0·07至0·08mg/ml、0·08至0·09mg/ml、0·09至0·lmg/ml、 0.1至0.2mg/ml、0.2至0.3mg/ml、0.3至0.4mg/ml、0.4至0.5mg/ml、0.5至0.6mg/ml、0.6至 0·7mg/ml、0·7至0·8mg/ml、0·8至0·9mg/ml、0·9至1·0mg/ml、1·0至2·0mg/ml、1·0至2·5mg/ ml、2·0至3·0mg/ml、3·0至4·0mg/ml、4·0至5·0mg/ml、5·0至6·0mg/ml、6·0至7·0mg/ml、7·0 至8·0mg/ml、8·0至9·0mg/ml、9·0至10·0mg/ml、10·0至12·0mg/ml、12·0至13·0mg/ml、13·0 至14·0mg/ml、14·0至15·0mg/ml、15·0至16·0mg/ml、16·0至17·0mg/ml、17·0至18·0mg/ml、 18·0至19·Omg/ml、19·0至20·Omg/ml、1·0至5mg/ml、1·0至lOmg/ml、1·0至15mg/ml或1·0至 20mg/ml触发多核苷酸。在一些方面，组合物包含约0. lug/ml、约0.2ug/ml、约0.5ug/ml、约 1.Oug/ml、约2.0ug/ml、约5.0ug/ml、约10ug/ml、约0.02mg/ml、约0.05mg/ml、约0·lmg/ml、 约0·125mg/ml、约0·2mg/ml、约0·25mg/ml、约0·3mg/ml、约0·4mg/ml、约0·5mg/ml、约0·6mg/ mUtO.Tmg/mUtO.Smg/mUtO.gmg/mUtl.Omg/mUtl.Smg/mUtS.Omg/mUtS.Smg/ 1111、约3.〇11^/1111、约3.511^/1111、约4.〇11^/1111、约4.511^/1111、约5.〇11^/1111、约5.511^/1111、约6.〇11^/ 1111、约6.511^/1111、约7.〇11^/1111、约7.511^/1111、约8.〇11^/1111、约8.511^/1111、约9.〇11^/1111、约9.511^/ ml、约10mg/ml、约1lmg/ml、约12mg/ml、约13mg/ml、约14mg/ml、约15mg/ml、约16mg/ml、约 17mg/ml、约 18mg/ml、约 19mg/ml 或约20mg/ml 触发多核苷酸。
[0124] 在一些方面，组合物包含每蜂群约lmg至约2000mg触发多核苷酸。在某些方面，组 合物包含每蜂群约lmg至约100mg、约lmg至约200mg、约lmg至约300mg、约lmg至约400mg、约 lmg至约500mg、约lmg至约600mg、约lmg至约700mg、约lmg至约800mg、约lmg至约900mg、约 lmg至约 lOOOmg、约 lmg至约 1200mg、约 lmg至约 1500mg、约 lmg至约 1800mg、约 10mg至约 100mg、约 10mg 至约200mg、约 10mg 至约300mg、约 10mg 至约 400mg、约 10mg 至约500mg、约 10mg 至约 600mg、约 10mg 至约700mg、约 10mg 至约800mg、约 10mg 至约900mg、约 10mg 至约 lOOOmg、约 10mg至约1200mg、约10mg至约1500mg、约10mg至约1800mg或约10mg至约2000mg触发多核昔 酸。在其他方面，组合物包含每蜂群约lmg、约5mg、约10mg、约15mg、约20mg、约25mg、约30mg、 约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约lOOmg、约125mg、约 15〇11^、约17511^、约20〇11^、约25〇11^、约30〇11^、约35〇11^、约40〇11^、约45〇11^、约50〇11^、约 550mg、约600mg、约650mg、约700mg、约750mg、约800mg、约850mg、约900mg、约950mg、约 lOOOmg、约llOOmg、约1200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、约1600mg、约1700mg、约 1800mg、约1900mg或约2000mg触发多核苷酸。
[0125] 本公开提供了并且包括，用于降低生物体的病毒载量的方法。在一些实施方案中， 生物体是寄生虫。在一个方面，病毒载量是指每单个宿主的病毒数量。在一个方面，病毒载 量是指每100个宿主生物体的平均病毒数量。在一个方面，病毒载量是指每寄生虫宿主群体 的病毒数量。在另一个方面，病毒载量是通过测量宿主(例如蜂或瓦螨）中的病毒表达来确 定。在根据本公开的方面，寄生虫是狄斯瓦螨，且宿主是蜜蜂意大利蜜蜂。
[0126] 在一个方面，降低病毒感染的方法包括向寄生虫以其为食的宿主生物体提供有效 量的触发(例如dsRNA)组合物。在另一个方面，降低病毒感染的方法包括直接向寄生虫生物 体提供有效量的触发(例如dsRNA)组合物。在根据本公开的方面，寄生虫是狄斯瓦螨，且宿 主是蜜蜂意大利蜜蜂。本公开的有效量的组合物会在一段时间内导致宿主和/或寄生虫中 的病毒感染降低。在一个方面，在提供有效量的触发(例如dsRNA)组合物的一天之内或两天 之内可以测量病毒感染的降低。在一个方面，可以在两天后测量病毒感染。在一个方面，可 以在3天后测量病毒感染。在其他方面，可以在4天后、5天后、6天后、7天后、1周后、2周后、3 周后或1月后测量病毒感染。在另一个方面，可以多于一次地测量病毒感染，例如，每天、每2 天、每3天、每4天、每5天、每6天、每7天、每周、每两周、每三周、一周一次、一周两次、一周三 次、一月一次、一月两次或一月三次。在根据本公开的某些方面，可以测量病毒感染的降低 并将其与未处理的对照宿主生物体、寄生虫或群体比较。在根据本公开的方面，寄生虫是狄 斯瓦螨，且宿主是蜜蜂意大利蜜蜂。
[0127] 在一个方面，降低病毒复制的方法包括向寄生虫以其为食的宿主生物体提供有效 量的触发(例如dsRNA)组合物。在另一个方面，降低病毒复制的方法包括直接向寄生虫生物 体提供有效量的触发(例如dsRNA)组合物。在根据本公开的方面，寄生虫是狄斯瓦螨，且宿 主是蜜蜂意大利蜜蜂。本公开的有效量的组合物会在一段时间内导致宿主和/或寄生虫中 的病毒基因表达降低。在一个方面，在提供有效量的触发(例如dsRNA)组合物的一天之内或 两天之内可以测量病毒基因表达的降低。在一个方面，可以在两天后测量病毒复制。在一个 方面，可以在3天后测量病毒复制。在其他方面，可以在4天后、5天后、6天后、7天后、或1周 后、2周后、3周后或1月后测量病毒复制。在另一个方面，可以多于一次地测量病毒复制，例 如，每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天、每7天、每周、每两周、每三周、一周一次、一周 两次、一周三次、一月一次、一月两次或一月三次。在根据本公开的某些方面，可以测量病毒 复制的降低并将其与未处理的对照宿主生物体、寄生虫或群体比较。在根据本公开的方面， 寄生虫是狄斯瓦螨，且宿主是蜜蜂意大利蜜蜂。
[0128] 在一个方面，降低病毒载量的方法包括向寄生虫以其为食的宿主生物体提供有效 量的触发(例如dsRNA)组合物。在另一个方面，降低病毒载量的方法包括直接向寄生虫生物 体提供有效量的触发(例如dsRNA)组合物。在根据本公开的方面，寄生虫是狄斯瓦螨，且宿 主是蜜蜂意大利蜜蜂。本公开的有效量的组合物会在一段时间内导致宿主和/或寄生虫中 的病毒载量降低。在一个方面，在提供有效量的触发(例如dsRNA)组合物的一天之内或两天 之内测量病毒载量的降低。在一个方面，可以在两天后测量病毒载量。在一个方面，可以在3 天后测量病毒载量。在其他方面，可以在4天后、5天后、6天后、7天后、1周后、2周后、3周后或 1月后测量病毒载量。在另一个方面，可以多于一次地测量病毒载量，例如，每天、每2天、每3 天、每4天、每5天、每6天、每7天、每周、每两周、每三周、一月一次、一月两次或一月三次。在 根据本公开的某些方面，可以测量病毒载量的降低并将其与未处理的对照宿主生物体、寄 生虫或群体比较。在根据本公开的方面，寄生虫是狄斯瓦螨，且宿主是蜜蜂意大利蜜蜂。
[0129] 在根据本公开的一些方面，在一段时间后病毒载量的降低或病毒感染的降低意味 着病毒滴度的降低。在一个方面，病毒滴度在测量之间降低约10%、20%、30%或更多。在另 一个方面，病毒滴度在测量之间降低约40%或更多。在另一个方面，病毒滴度在测量之间降 低约50%或更多。在另一个方面，病毒滴度在测量之间降低约60%或更多。在另一个方面， 病毒滴度在测量之间降低约70%或更多。在另一个方面，病毒滴度在测量之间降低约80% 或更多。在另一个方面，病毒滴度在测量之间降低约90%或更多。在一些实施方案中，与未 提供触发多核苷酸的宿主生物体或寄生虫中的病毒滴度相比，提供了有效量的触发多核苷 酸的宿主生物体或寄生虫中的病毒滴度降低至少约1〇%、20%、30%、40%、50%、60%、 70%、80%或90%。在一些实施方案中，在提供触发多核苷酸1天内、2天内、2天后、3天后、4 天后、5天后、6天后、7天后、或1周后、2周后、3周后或1月后测量病毒滴度。在一些实施方案 中，多于一次地测量病毒滴度。在一些实施方案中，每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每6 天、每7天、每周、每两周、每三周、一月一次、一月两次或一月三次测量病毒滴度。在一个方 面，宿主生物体是蜂。在一个方面，寄生虫是狄斯瓦螨。
[0130] 在根据本公开的一些方面，在一段时间后病毒载量的降低或病毒感染的降低意味 着病毒表达的降低。在一个方面，病毒表达在测量之间降低约10%、20%、30%或更多。在另 一个方面，病毒表达在测量之间降低约40 %或更多。在另一个方面，病毒表达在测量之间降 低约50 %或更多。在另一个方面，病毒表达在测量之间降低约60 %或更多。在另一个方面， 病毒表达在测量之间降低约70%或更多。在另一个方面，病毒表达在测量之间降低约80% 或更多。在另一个方面，病毒表达在测量之间降低约90%或更多。在一些实施方案中，与未 提供触发多核苷酸的宿主生物体或寄生虫中的病毒表达相比，提供了有效量的触发多核苷 酸的宿主生物体或寄生虫中的病毒表达降低至少约1〇%、20%、30%、40%、50%、60%、 70%、80%或90%。在一些实施方案中，在提供触发多核苷酸1天内、2天内、2天后、3天后、4 天后、5天后、6天后、7天后、或1周后、2周后、3周后或1月后测量病毒表达。在一些实施方案 中，多于一次地测量病毒表达。在一些实施方案中，每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每6 天、每7天、每周、每两周、每三周、一月一次、一月两次或一月三次测量病毒表达。在一个方 面，宿主生物体是蜂。在一个方面，寄生虫是狄斯瓦螨。
[0131 ]在根据本公开的一些方面，在一段时间后病毒载量的降低或病毒感染的降低意味 着病毒复制的降低。在一个方面，病毒复制在测量之间降低约10%、20%、30%或更多。在另 一个方面，病毒复制在测量之间降低约40%或更多。在另一个方面，病毒复制在测量之间降 低约50%或更多。在另一个方面，病毒复制在测量之间降低约60%或更多。在另一个方面， 病毒复制在测量之间降低约70%或更多。在另一个方面，病毒复制在测量之间降低约80% 或更多。在另一个方面，病毒复制在测量之间降低约90%或更多。在一些实施方案中，与未 提供触发多核苷酸的宿主生物体或寄生虫中的病毒复制相比，提供了有效量的触发多核苷 酸的宿主生物体或寄生虫中的病毒复制降低至少约10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、 70%、80%或90%。在一些实施方案中，在提供触发多核苷酸1天内、2天内、2天后、3天后、4 天后、5天后、6天后、7天后、或1周后、2周后、3周后或1月后测量病毒复制。在一些实施方案 中，多于一次地测量病毒复制。在一些实施方案中，每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每6 天、每7天、每周、每两周、每三周、一月一次、一月两次或一月三次测量病毒复制。在一个方 面，宿主生物体是蜂。在一个方面，寄生虫是狄斯瓦螨。
[0132] 在根据本公开的方面，在一段时间后病毒载量的降低导致蜂死亡率的降低。在一 个方面，蜂死亡率在测量之间降低10 %、20 %、30 %或更多。在另一个方面，蜂死亡率在测量 之间降低40%或更多。在另一个方面，蜂死亡率在测量之间降低50%或更多。在另一个方 面，蜂死亡率在测量之间降低60%或更多。在另一个方面，蜂死亡率在测量之间降低70%或 更多。在另一个方面，蜂死亡率在测量之间降低80 %或更多。在另一个方面，蜂死亡率在测 量之间降低90%或更多。在一些实施方案中，与未提供触发多核苷酸的蜂群中蜂死亡率相 比，提供了有效量的触发多核苷酸的蜂群中蜂死亡率降低至少约10%、20%、30%、40%、 50%、60%、70%、80%或90%。在一些实施方案中，在提供触发多核苷酸1天内、2天内、2天 后、3天后、4天后、5天后、6天后、7天后、或1周后、2周后、3周后或1月后测量蜂死亡率。在一 些实施方案中，多于一次地测量蜂死亡率。在一些实施方案中，每天、每2天、每3天、每4天、 每5天、每6天、每7天、每周、每两周、每三周、一月一次、一月两次或一月三次测量蜂死亡率。
[0133] 在根据本公开的方面，有效量的触发多核苷酸(例如dsRNA)可以周期性地或连续 地提供。在一个方面，有效量的触发(例如dsRNA)组合物可以一天一次、两次或三次提供。在 一个方面，有效量的触发(例如dsRNA)组合物可以一天一次提供。在一个方面，有效量的触 发（例如dsRNA)组合物可以每隔一天一次或多次提供。在一个方面，有效量的触发（例如 dsRNA)组合物可以每两天、每三天、每四天、每五天、每六天或一周一次提供。在一个方面， 有效量的触发(例如dsRNA)组合物可以连续提供给有需要的生物体，例如通过提供连续的 食物来源。在一个方面，有效量的触发(例如dsRNA)组合物可以作为蜂可摄取的组合物连续 提供。在一个方面，有效量的触发(例如dsRNA)组合物可以提供给宿主生物体。在另一个方 面，有效量的触发（例如dsRNA)组合物可以直接提供给寄生虫生物体。在根据本公开的方 面，寄生虫是狄斯瓦螨，且宿主是蜜蜂意大利蜜蜂。
[0134] 本公开提供了用于减少蜜蜂群的病毒载量的方法，所述方法包括向蜂群提供有效 量的触发(例如dsRNA)组合物。本公开的有效量的触发多核苷酸组合物会在一段时间内导 致病毒基因表达和病毒复制的降低。在一个方面，在提供有效量的触发(例如dsRNA)组合物 的一天之内或两天之内测量病毒复制或病毒表达的降低。在一个方面，可以在两天后测量 病毒复制或病毒表达的降低。在一个方面，可以在3天后测量病毒复制或病毒表达的降低。 在其他方面，可以在4天后、5天后、6天后、7天后、1周后、2周后、3周后或1月后测量病毒复制 或病毒表达的降低。在另一个方面，可以多于一次地测量病毒复制或病毒表达的降低，例 如，每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天、每7天、每周、每两周、每三周、一月一次、一月 两次或一月三次。在根据本公开的某些方面，可以测量病毒复制或病毒表达的降低并将其 与未处理的对照宿主生物体、寄生虫或群体比较。
[0135] 在一个方面，本公开提供了用于减少蜂对病毒感染的易感性的方法和组合物。在 其他方面，本公开提供了用于预防蜂群的病毒感染的方法和组合物。在另一个方面，本公开 提供了用于减少由狄斯瓦螨传播的蜜蜂的病毒感染的方法。
[0136] 以下实施例出于说明的目的而呈现并且不应该解释为限制。
[0137] 实施例1
[0138] 为了测试靶向瓦螨中蜂病毒的dsRNA的效果，将螨虫放置在补充有dsRNA触发物混 合物的饮食板上。与瓦螨基因没有超过19个碱基对(bp)的序列同一性的非特异性dsRNA用 作非特异性对照（SCRAM;SEQIDN0 :24)。收集瓦螨，提取RNA，并使用定量逆转录PCR(Q-PCR)分析DWV或IAPV的表达。
[0139] 实验过程：
[0140]首先，制备如下表1的人工饮食：
[0141]表1:人工饮食成分
[0143] 在一个实验中，dsRNA触发物混合物包含来自以下dsRNA序列的SEQIDN0:l-10的 混合物：
[0144] 表2:瓦螨直接饲喂测定中使用的dsRNA触发物序列
[0148] 板冷却后，每板上放置15只瓦螨。然后将板用吸水纸、石蜡膜密封并在29°C的保温 箱中孵育72KLB琼脂处理72h后，对死的/活的螨虫计数。如图2A所示，没有观察到蜂病毒触 发物混合物对瓦螨死亡率的影响。
[0149] 将活的和死的瓦螨都收集起来用于RNA提取，并且通过Q-PCR或quantiGene? Plex 2.0(4€€711161：1^1的1^^测定平台）分析蜂病毒水平和复制。图213示出了在用蜂病毒触 发物混合物处理后72h，与对照相比，通过Q-PCR分析的瓦螨中DWV水平下降。
[0150] 实施例2
[0151] 为了测试靶向蜂病毒的dsRNA对小型蜂箱环境中的蜜蜂和瓦螨的病毒载量（IAPV 或DWV)的效果，将蜜蜂放置在补充有一种或多种靶向蜂病毒的dsRNA触发物(例如，SEQ ID NO: 1-10和21)的饮食中。与瓦螨基因没有超过19bp的序列同一性的非特异性dsRNA用作非 特异性对照（SCRAM;例如SEQ ID N0:22、23或24)。空白对照不含dsRNA。
[0152] 鉴定出具有高病毒载量和瓦螨载量的蜂箱。然后，用来自所鉴定出的高瓦螨和高 病毒载量蜂箱的400-600只蜂(2杯(cup))、巢础框和蜂王在带有少量护卫蜂的王台中组装 小型蜂箱。所述王台用糖果密封。在装填蜂箱的同时，收集零时间的蜂和瓦螨的样品（每个 蜂巢的1杯蜂）。将样品冷冻(_70°C)，从冷冻杯收集瓦螨，并且准备蜂和瓦螨样品用于Q-PCR 或QuantiGene 分析。在初始时间点确定蜜蜂和瓦螨中的病毒载量。
[0153]对小型蜂箱饲喂66%的蔗糖溶液和蛋白质糕，并放置在暗盖下的干净房屋中24小 时以改善蜂王的居住。蜂王居住后，将暗盖去除，并给蜂饲喂含有靶向多种蜂病毒的dsRNA 混合物(浓度为lyg/蜂至l〇yg/蜂)的糖溶液。
[0154] 收集蜂样品，每4-5天每蜂箱10只蜂。使用QG(Af f ymetr iX的1 ex 2.0 RNA测定平台）分析所收集的蜂以确定病毒载量。与饲喂补充了非特异性dsRNA的饮食 的蜂相比，饲喂靶向蜂病毒的dsRNA的蜂病毒载量有所减少。
[0155] 每4-5天从每个蜂箱使用糖摇机收集瓦螨:从每个小型蜂箱取一杯蜂，并且将两匙 糖粉放入带有冲孔封口器的容器中。晃动并上下颠倒杯-瓦螨从封口器的孔中掉落而蜂留 在杯中。将蜂重新放回小型蜂箱中，并使用QG(Affymetrix的QuantiGene KPlex 2.0 RNA 测定平台）分析瓦螨以确定病毒载量。与从饲喂补充了非特异性dsRNA的饮食的蜂中收集的 瓦螨相比，从饲喂靶向蜂病毒的dsRNA的蜂中收集的瓦螨病毒载量有所减少。
[0156] 对冷冻蜜蜂或瓦螨样品的总裂解物执行(定量的不基于扩增的核酸 检测分析）以测量病毒表达和病毒复制。用于QuantiGeneKPlex 2.0测定的寡核苷酸探针 由Affymetrix设计和供应，其中使用蜂病毒序列的有义链作为模板或负链用于复制病毒。 看家基因探针从意大利蜜蜂肌动蛋白、核糖体蛋白亚基5(RPS5)和核糖体蛋白49(RP49)的 序列设计。QuantiGeiie^HlJ定根据生产商的说明书（Affymetrix，Inc ·，User Manual， 2010)进行，其中在样品与寡核苷酸探针杂交前添加了热变性步骤。将20yL体积的样品与5μ 1所供应的探针组在PCR微板的孔中混合，接着用热循环仪在95°C下加热5分钟。经热处理的 样品保持在46°C直到使用。将25μ1的样品转移至Affymetrix杂交板用于过夜杂交。从热循 环仪中去除所述板之前，将75μ1含剩余组分的杂交缓冲液添加到每个样品孔。然后从热循 环仪中去除PCR微板，并且将每孔的内容物(~100μΙ)转移到杂交板(Affymetrix)的对应孔 中用于过夜杂交。信号放大后，在Luminex 200机器(Luminex Corporation)上捕获每个样 品的平均荧光强度(MFI)。
[0157] 实施例3
[0158] 为了测试靶向DWV或IAPV的dsRNA在蜜蜂和瓦螨中的效果，将蜜蜂置于补充有选自 靶向DWV的SEQIDN0 :5-9和靶向IAPV的SEQIDN0:l-4和10的dsRNA触发物混合物的饮食 中。与瓦螨基因没有超过19bp的序列同一性的非特异性dsRNA用作对照（SCRAM; SEQ ID N0: 22 或 23)。
[0159] 鉴定出具有高病毒载量和瓦螨载量的蜂箱。图3示出了瓦螨载量和DWV水平的样品 定量。然后，用来自所鉴定出的高瓦螨和高病毒载量蜂箱的400-600只蜂(2杯）、巢础框和蜂 王在带有少量护卫蜂的王台中组装小型蜂箱。所述王台用糖果密封。
[0160]对小型蜂箱饲喂66%的蔗糖溶液和蛋白质糕，并放置在暗盖下的干净房屋中24小 时以改善蜂王的居住。驯化2天后，对蜂以lyg/蜂至1 〇yg/蜂的浓度饲喂仅糖溶液(C0N)、含 有非特异性对照dsRNA的糖溶液(SCR)或含有靶向多种蜂病毒的dsRNA混合物(SEQ ID N0: 1-10;MIX)的糖溶液。
[0161] 蜂箱感染后，每4-5天从每个蜂箱收集10只蜂。如实施例2中所述，通过 QuantiGenZ分析所收集的蜂，以平均荧光强度(MFI)确定病毒复制。
[0162] 图4示出了与饲喂仅糖溶液(C0N)或补充了非特异性dsRNA的饮食(SCR)的蜂相比， 所有饲喂靶向病毒的dsRNA混合物(MIX)的蜂中的DWV复制有所降低。在蜂中处理后4、8和14 天，使用QuantiGene 15分析测量DWV病毒的复制。结果显示，从第8天起，DWV的复制在两个 对照(C0N和SCR)中增加，但是在用靶向病毒的dsRNA混合物(MIX)处理的蜂中不增加，这表 明所述靶向病毒的dsRNA混合物在抑制病毒复制中是有效的。
[0163] 实施例4
[0164] 这是如实施例1中所述的瓦螨直接饲喂实验的另一个实例。为了测试靶向瓦螨中 蜂病毒的dsRNA的效果，将螨虫放置在补充有dsRNA触发物混合物的饮食板上。与瓦螨基因 没有超过19bp的序列同一性的非特异性dsRNA用作非特异性对照（SEQ ID N0: 22或23)。空 白对照不含dsRNA。收集瓦螨，提取RNA，并用QuantiGene"^析Plex 2.0(Affymetrix的 RNA测定平台）分析DWV或IAPV的表达。
[0165] 实验过程：
[0166] 首先，制备如下表3的人工饮食：
[0167] 表3:人工饮食成分
[0169] 所述dsRNA触发物混合物包含SEQ ID从):2-6和8-10(每种125以8/1111)的混合物。
[0170] 板冷却后，每板上放置15只瓦螨。然后将板用吸水纸、石蜡膜密封并在29°C的保温 箱中孵育72h。收集活的瓦螨用于RNA提取，并且通过QuantiGene?Plex 2.0(Affymet;rix 的RNA测定平台）分析蜂病毒水平和复制。
[0171] 图5A示出了在用蜂病毒触发物混合物处理后72h，与空白对照和非特异性dsRNA相 比，瓦螨中DWV水平下降。类似地，图5B示出了在用蜂病毒触发物混合物处理后72h，与空白 对照和非特异性dsRNA相比，瓦螨中IAPV水平下降。
[0172] 实施例5
[0173] 为了测试靶向蜂病毒的dsRNA对蜂盒环境(实验室条件）中的蜜蜂的DWV病毒载量 和复制的效果，将蜜蜂从野外商业蜂箱中取出并放置在蜂盒中，所述蜂盒被饲喂补充了选 自靶向 DMV的 SEQ ID N0:5、6、8和9中（T1 = SEQ ID N0:5、T2 = SEQ ID N0:6、T3 = SEQ ID NO:8和T4 = SEQ ID NO:9)的单独的dsRNA触发物或这些dsRNA触发物的混合物的66%的糖 浆。与蜜蜂基因没有超过19bp的序列同一性的非特异性d SRNA(SEQIDN0:22或23)用作非 特异性对照。空白对照不含dsRNA。
[0174] 鉴定出具有高病毒载量的蜂箱。然后用来自所鉴定出的高病毒载量的5只蜂组装 蜂盒。在装填蜂盒的同时，收集零时间的蜂样品。将样品冷冻(_70°C)。在初始时间点确定蜜 蜂中的病毒载量。
[0175] 给蜂盒饲喂66%的蔗糖溶液。驯化2天后，对蜂饲喂含有单独的或混合的靶向DMV 的dsRNA(lyg/蜂至10yg/蜂的浓度）、含有非特异性dsRNA对照或不含dsRNA的糖溶液。另外3 天后，再次对蜂饲喂相同的糖溶液。
[0176] 第二次处理4天和10天后，从每个处理组收集24只蜂。通过QuamiGene?Plex 2.0分析所收集的蜂以确定病毒载量和病毒复制。
[0177] 图6A示出了相比于两个对照，dsRNA触发物混合物和单独的触发物对抑制蜂中的 DWV载量均有效，其中T1和T4展示出更大的效果。图6B示出对蜂中的DWV复制类似的效果，也 是T1和T4示出更大的效果。
[0178] 实施例6
[0179] 为了测试靶向蜂病毒的dsRNA对蜂盒环境(实验室条件）中的蜜蜂的IAPV病毒载量 和复制的效果，将蜜蜂从野外商业蜂箱中取出并放置在蜂盒中，所述蜂盒被饲喂补充了选 自靶向 IAPV 的 SEQ ID N0:2-4 和 10 中（T5 = SEQ ID N0:2、T6 = SEQ ID N0:3、T7 = SEQ ID N0:4和T8 = SEQ ID NO: 10)的单独的dsRNA触发物或这些dsRNA触发物的混合物的66%的糖 浆。与蜜蜂基因没有超过19bp的序列同一性的非特异性d SRNA(SEQIDN0:22或23)用作非 特异性对照。空白对照不含dsRNA。
[0180] 鉴定出具有高病毒载量的蜂箱。然后用来自所鉴定出的高病毒载量的5只蜂组装 蜂盒。在装填蜂盒的同时，收集零时间的蜂样品。将样品冷冻(_70°C)。在初始时间点确定蜜 蜂中的病毒载量。
[0181] 给蜂盒饲喂66 %的蔗糖溶液。驯化2天后，对蜂饲喂含有单独的或混合的靶向DMV 的dsRNA(lyg/蜂至10yg/蜂的浓度）、含有非特异性dsRNA对照或不含dsRNA的糖溶液。另外3 天后，再次对蜂饲喂相同的糖溶液。
[0182] 第二次处理4天和10天后，从每个处理组收集24只蜂。通过QuantiGene>lex 2.0分析所收集的蜂以确定病毒载量和病毒复制。
[0183] 图7A示出了与对照相比，T5和T6有效抑制IAPV载量。图7B示出了与被饲喂补充了 非特异性dsRNA的饮食的蜂相比，除混合物和T8之外，在被饲喂靶向IAPV序列的dsRNA的所 有蜂中病毒复制都受到抑制。
[0184] 实施例7
[0185] 为了测试靶向蜂病毒的dsRNA对蜂盒环境(实验室条件）中的蜜蜂的LSV病毒载量 和复制的效果，将蜜蜂从野外商业蜂箱中取出并放置在蜂盒中，所述蜂盒被饲喂补充了选 自SEQ ID N0:11-20中的五种dsRNA触发物混合物的66%的糖浆。测试了两种dsRNA触发物 混合物。包含SEQIDN0:11、13、14、17和18的混合物A，和包含SEQIDN0:12、15、16、19和20 的混合物B，具有以下dsRNA序列：
[0186] 表4:靶向LSV的dsRNA触发物序列
[0190] 与蜜蜂基因没有超过19bp的序列同一性的非特异性dsRNA(SEQ ID N0:22或23)用 作对照。空白对照不含dsRNA。
[0191] 鉴定出具有高病毒载量的蜂箱。然后用来自所鉴定出的高病毒载量的5只蜂组装 蜂盒。在装填蜂盒的同时，收集零时间的蜂样品。将样品冷冻(_70°C)。在初始时间点确定蜜 蜂中的病毒载量。
[0192] 给蜂盒饲喂66 %的蔗糖溶液。驯化2天后，对蜂饲喂含有单独的或混合的靶向DMV 的dsRNA(lyg/蜂至10yg/蜂的浓度）、含有非特异性dsRNA对照或不含dsRNA的糖溶液。另外3 天后，再次对蜂饲喂相同的糖溶液。
[0193] 第二次处理4天和10天后，从每个处理组收集24只蜂。通过QuantiGeneK'Plex 2.0分析所收集的蜂以确定病毒载量。
[0194] 图8示出了与对照相比，混合物A和混合物B都有效地抑制LSV载量，其中混合物B展 示出更大的效果。与被饲喂补充了非特异性dsRNA的饮食的蜂箱相比，被饲喂补充了靶向 LSV序列的dsRNA的饮食的蜂箱中LSV载量有所降低。
【主权项】
1. 一种用于在狄斯瓦螨中减少病毒载量或抑制病毒复制的方法，所述方法包括：向所 述狄斯瓦螨施用包含有效量的至少一种触发多核苷酸的组合物，所述触发多核苷酸包含下 调所述狄斯瓦螨中的蜂病毒基因表达的核酸序列，从而在所述狄斯瓦螨中降低病毒载量或 抑制病毒复制。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述施用是通过将所述有效量的所述至少一种触 发多核苷酸饲喂给宿主蜂来实现的。3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述饲喂包括向所述宿主蜂提供选自由液体蜂可 摄取组合物和固体蜂可摄取组合物组成的组的蜂可摄取组合物。4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述宿主蜂是蜜蜂。5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述蜜蜂是采集蜂或巢蜂。6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种触发多核苷酸包含2、3、4、5、6、7、8、9 或10种不同的触发多核苷酸的混合物。7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述不同的触发多核苷酸靶向不同的病毒、或靶向 相同病毒的不同基因、或靶向病毒基因的不同片段。8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述病毒选自由急性蜂麻痹病毒(ABPV)、畸翅病毒 (DWV)、克什米尔蜂病毒(KBV)、黑蜂王台病毒(BQCV)、囊状幼虫病病毒(SBV)、慢性蜂麻痹病 毒(CPV)、云翅病毒(CWV)、以色列急性麻痹病毒（IAPV)、无脊椎动物虹彩病毒6型（IIV-6)、 狄斯瓦螨病毒(VDV-1)和Kakugo病毒(KV)组成的组。9. 根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种触发多核苷酸与所述蜂病毒基因的 至少21个连续核苷酸的序列基本上同一或基本上互补。10. 根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种触发多核苷酸包含与选自由SEQ ID 勵:1-21组成的组的序列具有至少约80%、85%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或 99%的序列同一性或互补性，或具有100%的序列同一性或互补性的核酸序列。11. 一种用于减少蜂对蜂病毒引起的疾病的易感性的方法，所述方法包括：向所述蜂的 寄生虫提供包含有效量的触发多核苷酸的组合物，所述触发多核苷酸包含与蜂病毒基因的 至少21个连续核苷酸的序列基本上同一或基本上互补的核酸序列，从而抑制所述寄生虫中 的病毒复制并降低所述蜂对所述蜂病毒引起的疾病的易感性。12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述蜂是蜜蜂。13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述蜜蜂是采集蜂或巢蜂。14. 根据权利要求11所述的方法，其中所述寄生虫是狄斯瓦螨。15. 根据权利要求11所述的方法，其中所述触发多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:1_ 10和21组成的组的序列具有至少约80%、85%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或 99%的序列同一性或互补性，或具有100%的序列同一性或互补性的核酸序列。16. 根据权利要求11所述的方法，其中所述蜂病毒选自由急性蜂麻痹病毒(ABPV)、畸翅 病毒(DWV)、克什米尔蜂病毒(KBV)、黑蜂王台病毒(BQCV)、囊状幼虫病病毒(SBV)、慢性蜂麻 痹病毒(CPV)、云翅病毒(CWV)、以色列急性麻痹病毒（IAPV)、无脊椎动物虹彩病毒6型（IIV-6)、狄斯瓦螨病毒(VDV-1)和Kakugo病毒(KV)组成的组。17. 根据权利要求11所述的方法，其中所述疾病是蜂群衰竭失调症(CCD)。18. -种用于降低瓦螨中的病毒载量的方法，所述方法包括:对所述瓦螨施用包含有效 量的触发多核苷酸的组合物，所述触发多核苷酸包含与蜂病毒基因的至少21个连续核苷酸 的序列基本上同一或基本上互补的核酸序列，从而抑制所述瓦螨中的病毒复制。19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述组合物包含2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的 触发多核苷酸的混合物。20. 根据权利要求18所述的方法，其中所述触发多核苷酸是单链DNA(ssDNA)、单链RNA (ssRNA)、双链RNA(dsRNA)、双链DNA(dsDNA)或双链DNA-RNA杂合体。21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述触发多核苷酸是dsRNA。22. 根据权利要求18所述的方法，其中所述触发多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:1-10和21组成的组的序列具有至少约80%、85%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或 99%的序列同一性或互补性，或具有100%的序列同一性或互补性的核酸序列。23. 根据权利要求18所述的方法，其中所述蜂病毒选自由急性蜂麻痹病毒(ABPV)、畸翅 病毒(DWV)、克什米尔蜂病毒(KBV)、黑蜂王台病毒(BQCV)、囊状幼虫病病毒(SBV)、慢性蜂麻 痹病毒(CPV)、云翅病毒(CWV)、以色列急性麻痹病毒（IAPV)、无脊椎动物虹彩病毒6型（IIV-6)、狄斯瓦螨病毒(VDV-1)和Kakugo病毒(KV)组成的组。24. 根据权利要求18所述的方法，其中所述施用是通过对所述狄斯瓦螨喷洒包含所述 触发多核苷酸的所述组合物，或通过直接对所述狄斯瓦螨饲喂包含所述触发多核苷酸的所 述组合物来实现的。25. 根据权利要求18所述的方法，其中所述施用是通过在节肢动物血淋巴中提供包含 所述触发多核苷酸的所述组合物来实现的。26. 根据权利要求25所述的方法，其中所述节肢动物是蜂。27. 根据权利要求26所述的方法，其中所述蜂是蜜蜂。28. 根据权利要求18所述的方法，其中所述组合物包含按重量计0.1%至5%的触发多 核苷酸。29. 根据权利要求18所述的方法，其中所述组合物包含按重量计多达1 %、2%、3%、 4%、5%、7.5%、10%或15%的触发多核苷酸。30. 根据权利要求18所述的方法，其中所述组合物包含0.01至20mg/ml的触发多核苷 酸。31. 根据权利要求18所述的方法，其中所述组合物还包含赋形剂。32. 根据权利要求31所述的方法，其中所述赋形剂包括选自糖、溶剂、蛋白质、蜂食物和 其任何组合的一种或多种物质。33. 根据权利要求32所述的方法，其中所述糖选自果糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、半 乳糖、核糖和其任何组合。34. 根据权利要求31所述的方法，其中所述蛋白质为大豆蛋白。35. 根据权利要求31所述的方法，其中所述蜂食物选自蜂蜜、花粉、乳清酵母、大豆粉、 酵母、酵母产品和其任何组合。36. 根据权利要求18所述的方法，其中所述组合物一天一次、一天两次、一天三次、每隔 一天一次或多次、每两天、每三天或每周一次提供。37. 根据权利要求18所述的方法，其中所述组合物作为蜂可摄取组合物连续提供。38. 根据权利要求18所述的方法，其中所述病毒载量通过测量病毒滴度定量。39. 根据权利要求38所述的方法，其中所述病毒滴度在施用包含所述触发多核苷酸的 所述组合物的1天内、1天后、2天后、3天后、4天后、5天后或1周后测量。40. 根据权利要求38所述的方法，其中多于一次地测量所述病毒滴度。41. 根据权利要求40所述的方法，其中每3天、每5天、每周或每月一次测量所述病毒滴 度。42. 根据权利要求38所述的方法，其中所述病毒滴度与未用所述触发多核苷酸处理时 相比降低 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或更多。43. 根据权利要求18所述的方法，其中通过测量病毒表达定量所述病毒载量。44. 根据权利要求44所述的方法，其中所述病毒表达在施用包含所述触发多核苷酸的 所述组合物的1天内、1天后、2天后、3天后、4天后、5天后或1周后测量。45. 根据权利要求44所述的方法，其中多于一次地测量所述病毒表达。46. 根据权利要求45所述的方法，其中每3天、每5天、每周或每月一次测量所述病毒表 达。47. 根据权利要求44所述的方法，其中所述病毒表达与未用所述触发多核苷酸处理时 相比降低 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或更多。48. 根据权利要求26所述的方法，其中所述瓦螨中的所述病毒载量降低导致蜂死亡率 的降低。49. 根据权利要求48所述的方法，其中所述蜂死亡率在施用包含所述触发多核苷酸的 所述组合物的1天内、1天后、2天后、3天后、4天后、5天后或1周后测量。50. 根据权利要求48所述的方法，其中蜂死亡率与未用所述触发多核苷酸处理时相比 降低 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或更多。51. 根据权利要求18所述的方法，其中所述病毒复制的抑制在施用包含所述触发多核 苷酸的所述组合物的1天内、1天后、2天后、3天后、4天后、5天后或1周后测量。52. 根据权利要求18所述的方法，其中多于一次地测量所述病毒复制的所述抑制。53. 根据权利要求52所述的方法，其中每3天、每5天、每周或每月一次测量所述病毒复 制的所述抑制。54. 根据权利要求18所述的方法，其中所述病毒复制与未用所述触发多核苷酸处理时 相比降低 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或更多。55. -种用于在蜂群中减少病毒载量或抑制病毒复制的方法，所述方法包括:通过向所 述蜂群的寄生虫提供包含有效量的触发多核苷酸的组合物来减少所述寄生虫中的病毒载 量或抑制病毒复制，所述触发多核苷酸包含与蜂病毒基因的至少21个连续核苷酸的序列基 本上同一或基本上互补的核酸序列，从而抑制所述寄生虫中的病毒复制并降低所述蜂群中 的所述病毒载量。56. 根据权利要求55所述的方法，其中所述寄生虫是狄斯瓦螨。57. 根据权利要求55所述的方法，其中所述触发多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:1_ 10和21组成的组的序列具有至少约80%、85%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或 99%的序列同一性或互补性，或具有100%的序列同一性或互补性的核酸序列。58. 根据权利要求55所述的方法，其中所述病毒选自由急性蜂麻痹病毒(ABPV)、畸翅病 毒(DWV)、克什米尔蜂病毒(KBV)、黑蜂王台病毒(BQCV)、囊状幼虫病病毒(SBV)、慢性蜂麻痹 病毒(CPV)、云翅病毒(CWV)、以色列急性麻痹病毒（IAPV)、无脊椎动物虹彩病毒6型（IIV-6)、狄斯瓦螨病毒(VDV-1)和Kakugo病毒(KV)组成的组。59. -种用于在蜂群中减少病毒载量或抑制病毒复制的方法，所述方法包括：向所述蜂 群提供包含有效量的触发多核苷酸的组合物，所述触发多核苷酸包含与蜂病毒基因的至少 21个连续核苷酸的序列基本上同一或基本上互补的核酸序列，从而在所述蜂群中减少病毒 载量或抑制病毒复制。60. 根据权利要求59所述的方法，其中所述病毒选自由急性蜂麻痹病毒(ABPV)、畸翅病 毒(DWV)、克什米尔蜂病毒(KBV)、黑蜂王台病毒(BQCV)、囊状幼虫病病毒(SBV)、慢性蜂麻痹 病毒(CPV)、云翅病毒(CWV)、以色列急性麻痹病毒（IAPV)、无脊椎动物虹彩病毒6型（IIV-6)、狄斯瓦螨病毒(VDV-1)、Kakugo病毒(KV)和西奈湖病毒(LSV)组成的组。61. 根据权利要求59所述的方法，其中所述触发多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:1_ 21 组成的组的序列具有至少约 80%、85%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性或互补性，或具有100 %的序列同一性或互补性的核酸序列。62. -种用于在蜂中减少病毒载量或抑制病毒复制的方法，所述方法包括：向所述蜂提 供包含有效量的触发多核苷酸的组合物，所述触发多核苷酸包含与蜂病毒基因的至少21个 连续核苷酸的序列基本上同一或基本上互补的核酸序列，从而在所述蜂中减少病毒载量或 抑制病毒复制。63. 根据权利要求62所述的方法，其中所述蜂病毒选自由急性蜂麻痹病毒(ABPV)、畸翅 病毒(DWV)、克什米尔蜂病毒(KBV)、黑蜂王台病毒(BQCV)、囊状幼虫病病毒(SBV)、慢性蜂麻 痹病毒(CPV)、云翅病毒(CWV)、以色列急性麻痹病毒（IAPV)、无脊椎动物虹彩病毒6型（IIV-6)、狄斯瓦螨病毒(VDV-1)、Kakugo病毒(KV)和西奈湖病毒(LSV)组成的组。64. 根据权利要求62所述的方法，其中所述触发多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO: 1-21 组成的组的序列具有至少约 80%、85%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性或互补性，或具有100 %的序列同一性或互补性的核酸序列。65. -种用于增加蜂或蜂群对蜂病毒引起的疾病的耐受性的方法，所述方法包括：向瓦 螨提供包含有效量的触发多核苷酸的组合物，所述触发多核苷酸包含与蜂病毒基因的至少 21个连续核苷酸的序列基本上同一或基本上互补的核酸序列，从而减少所述瓦螨中的病毒 载量并增加所述蜂群对所述蜂病毒引起的疾病的耐受性。66. -种用于增加蜂或蜂群对蜂病毒引起的疾病的耐受性的方法，所述方法包括：向所 述蜂或蜂群提供包含有效量的触发多核苷酸的组合物，所述触发多核苷酸包含与蜂病毒基 因的至少21个连续核苷酸的序列基本上同一或基本上互补的核酸序列，从而增加所述蜂群 对所述蜂病毒引起的疾病的耐受性。67. -种用于向狄斯瓦螨、蜂或蜂群提供的组合物，所述组合物包含有效量的触发多核 苷酸，所述触发多核苷酸包含与蜂病毒基因的至少21个连续核苷酸的序列基本上同一或基 本上互补的核酸序列。68. 根据权利要求67所述的组合物，其中所述触发多核苷酸是单链DNA(ssDNA)、单链 RNA(ssRNA)、双链RNA(dsRNA)、双链DNA(dsDNA)或双链DNA-RNA杂合体。69. 根据权利要求68所述的方法，其中所述触发多核苷酸是dsRNA。70. 根据权利要求67所述的组合物，其中所述触发多核苷酸下调所述蜂病毒基因的表 达。71. 根据权利要求67所述的组合物，其中所述组合物降低所述瓦螨、所述蜂或所述蜂群 中的病毒载量。72. 根据权利要求67所述的组合物，其中所述组合物抑制所述瓦螨、所述蜂或所述蜂群 中的病毒复制。73. 根据权利要求67所述的组合物，其中所述组合物增加蜂或蜂群对所述蜂病毒引起 的疾病的耐受性。74. 根据权利要求67所述的组合物，其中所述蜂病毒选自由急性蜂麻痹病毒(ABPV)、畸 翅病毒(DWV)、克什米尔蜂病毒(KBV)、黑蜂王台病毒(BQCV)、囊状幼虫病病毒(SBV)、慢性蜂 麻痹病毒（CPV)、云翅病毒（CWV)、以色列急性麻痹病毒（IAPV)、无脊椎动物虹彩病毒6型 (IIV-6)、狄斯瓦螨病毒(VDV-l)、Kakugo病毒(KV)和西奈湖病毒(LSV)组成的组。75. 根据权利要求67所述的组合物，其中所述触发多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO: 1-10 和 21 组成的组的序列具有至少约 80%、85%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98% 或99 %的序列同一性或互补性，或具有100 %的序列同一性或互补性的核酸序列。76. 根据权利要求67所述的组合物，其中所述触发多核苷酸包含至少2、3、4、5、6、7、8、9 或10种不同的触发多核苷酸的混合物。77. 根据权利要求76所述的组合物，其中所述不同的触发多核苷酸靶向不同的病毒、或 靶向相同病毒的不同基因、或靶向病毒基因的不同片段。78. 根据权利要求67所述的组合物，其中所述组合物包含约lmg至约2000mg的所述触发 多核苷酸。79. 根据权利要求67所述的组合物，其中所述组合物包含约0.0 lmg/ml至约20mg/ml的 所述触发多核苷酸。80. 根据权利要求67所述的组合物，其中所述组合物还包含赋形剂。81. 根据权利要求67所述的组合物，其中所述组合物是蜂可摄取组合物。
【文档编号】C07K14/435GK105980399SQ201480074838
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2014年12月9日
【发明人】M·格莱特-基尔马诺维茨, Y·戈拉尼
【申请人】比欧洛吉科斯公司