本发明涉及酶或微生物的测定或检验方法，具体是一种苯扎氯铵溶液微生物限度检查方法。
背景技术：
苯扎氯铵溶液为氯化二甲基苄基氢胺的混合物，无色或淡黄色的澄清液体，气芳香，味极苦，振摇时能产生大量泡沫，用于手术前皮肤消毒，粘膜和伤口消毒。
苯扎氯铵为阳离子表面活性剂，广谱杀菌剂，对革兰氏阳性细菌作用较强，在制药工程中作为防腐剂使用。由于苯扎氯铵原料抑菌作用大，在设计微生物限度检查方法上存在极大的困难。
技术实现要素：
本发明就是为了解决苯扎氯铵原料抑菌作用大，微生物限度检查困难的问题，所提出的一种苯扎氯铵溶液微生物限度检查方法。
本发明是按照以下技术方案实现的。
一种苯扎氯铵溶液微生物限度检查方法，包括以下步骤：
ⅰ.取苯扎氯铵溶液，加入稀释液，制成1:10供试液；
ⅱ.用无菌吸头吸取1份供试液，加入到50份稀释液中，混匀；
ⅲ.先用少量冲洗液润洗低吸附性滤膜，再采用薄膜过滤法将稀释后供试液全量过滤，用冲洗液分次冲洗滤膜，每次的冲洗量为总冲洗量的1/16；
ⅳ.同法制备两张滤膜，分别贴于两种不同的培养基上，适宜条件培养后，点计菌落数；
ⅴ.阴性对照：采用薄膜过滤法将稀释液进行过滤，菌面朝上贴于培养基上培养。
所述稀释液和冲洗液的成分为蛋白胨干粉和吐温-80，二者的质量份数比为1:1。
所述稀释液和冲洗液的制备方法为：称蛋白胨干粉5份、吐温-805份，溶于1000份水中，调ph使灭菌后的ph值为7.1±0.2，115-121℃高压灭菌15-30分钟。
所述总冲洗量为800ml。
所述培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基；胰酪大豆胨琼脂培养基于30-35℃培养3天，沙氏葡萄糖琼脂培养基于20-25℃培养5天。
所述阴性对照稀释液过滤后，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上，30-35℃培养3天。
本发明获得了如下的有益效果。
本发明有效的解决了苯扎氯铵原料抑菌作用大，微生物限度检查困难的问题。本发明通过前期大量计数方法适用性初筛试验，确定了稀释液、冲洗液以及稀释液、冲洗液的量，且试验结果以“cfu/ml”计算，提高了检测结果的准确性。本发明的试验方法科学，试验结果准确，填补了苯扎氯铵原料微生物限度检查方法的空白，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
一、试验准备：
1．供试品：苯扎氯铵溶液（10%）
2.菌种：
金黄色葡萄球菌（cmcc（b）26003）
铜绿假单胞菌（cmcc（b）10104）
枯草芽孢杆菌（cmcc（b）63501）
白色念珠菌（cmcc（f）98001）
黑曲霉菌（cmcc（f）98003）
以上标准菌株均购自中国药品生物制品检定所或天津市药品检验所。
3．培养基（详见表1）
4．培养基、冲洗液、中和剂配制方法（详见表2）
5．试验仪器（详见表3）
6.菌悬液的制备：
a.增菌：分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，30-35℃恒温箱培养18-24小时；接种白色念珠菌、黑曲霉菌于沙氏葡萄糖琼脂培养基中，20-25℃恒温箱培养，白色念珠菌培养24-48小时，黑曲霉菌5-7天，用3-5ml含0.05%吐温80的0.9%无菌nacl溶液将黑曲霉孢子洗脱，用管口带有无菌脱脂棉的毛细管收集孢子悬液于无菌试管中保存，备用。
b.菌液稀释：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的新鲜培养物用0.9%无菌nacl溶液按10倍稀释，制成试验菌液；试验菌液每毫升含菌量小于100cfu。
c.新制备的菌悬液在室温条件下应在2小时内使用，2-8℃冷藏可保存24小时。
二、试验方法的建立
《中国药典》规定：供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。
方法适用性试验需要证明稀释液、冲洗液本身对试验菌的生长无影响，并且能够明显降低抑菌成分，故需要考察稀释液、冲洗液的毒性和效力。由于季铵盐类的苯扎氯铵溶液对革兰氏阳性菌的杀菌效果明显，对革兰氏阴性菌杀伤力较差，且不能杀灭细菌芽孢和真菌孢子，因此选择金黄色葡萄球菌作为供试液对照组试验菌株。
1.供试液制备
取苯扎氯铵溶液（10%）10ml，用含0.5%吐温-80的0.5%蛋白胨水溶液作为稀释剂，制成1:10供试液。
2.试验操作
2.1试验组
取制备好的供试液10ml加入到500ml含0.5%吐温-80的0.5%蛋白胨水溶液中，混匀，加入小于100cfu的菌液。用含0.5%吐温-80的0.5%蛋白胨水溶液润洗滤膜后，将加入菌液的供试液全量过滤，用800ml同一冲洗液分次冲洗，每次50ml/膜。每一试验菌同法操作。
取下滤膜。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的膜分别贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上，胰酪大豆胨琼脂培养基30-35℃培养3天；白色念珠菌、黑曲霉菌的膜各制备2份，分别贴于胰酪大豆胨琼脂和沙氏葡萄糖琼脂培养基上。胰酪大豆胨琼脂培养基30-35℃培养5天，沙氏葡萄糖琼脂培养基20-25℃培养5天（以下培养条件相同）。
2.2供试液对照组
以制备菌液用的稀释液代替试验菌液，同试验组操作，制备两膜，分别贴于胰酪胨大豆琼脂培养基（tsa）和沙氏葡萄糖琼脂培养基（sda）上，相应温度培养，测定其本底菌数。
2.3菌液对照组
取10ml不含吐温-80的0.5%蛋白胨水溶液代替供试液，加到500ml稀释液中，加入小于100cfu试验菌液，全量过滤，以测定所加菌悬液生菌数。每一试验菌同法操作。
2.4中和剂组
取10ml含0.5%吐温-80的0.5%蛋白胨水溶液代替供试液，同试验组操作，每一试验菌同法操作，以确认其有效性和对微生物的无毒性。
3.方法适用性试验结果（详见表4）
4.结论
以上适用性试验结果表明:各试验组菌落数回收率（即（试验组-供试品对照组）菌落数/菌液组菌落数）在0.5-2范围内；中和剂对照组菌数回收率（中和剂对照组菌落数/菌液组菌落数）在0.5-2范围内。所以该试验方法可以用于该供试品的微生物限度检查。
5.日常微生物限度检查方法确立
取苯扎氯铵溶液（10%）10ml，加入含0.5%吐温-80的0.5%蛋白胨水溶液，制成1:10供试液。用无菌吸头吸取10ml（相当于供试品1ml苯扎氯铵溶液），加入到500ml含0.5%吐温-80的0.5%蛋白胨水溶液中，混匀。先用少量含0.5%吐温-80的0.5%蛋白胨水溶液冲洗液润洗滤膜，再采用薄膜过滤法将供试液全量过滤，用800ml冲洗液分次冲洗，每次50ml。同法制备两张滤膜，分别贴于胰酪大豆胨琼脂培养基中和沙氏葡萄糖琼脂培养基平皿上，胰酪大豆胨琼脂皿30-35℃3天培养；沙氏葡萄糖琼脂皿20-25℃5天培养，点计菌落数。
阴性对照：取稀释液50ml，过滤，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养皿上，30-35℃培养3天，不得有菌生长。