琥珀酸的新型微生物生产者和琥珀酸的纯化的制作方法
【专利说明】琥珀酸的新型微生物生产者和琥珀酸的纯化
[0001] 本申请为2010年2月12日提交的，发明名称为"琥珀酸的新型微生物生产者和琥 珀酸的纯化"的PCT申请PCT/EP2010/051798的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段 的日期为2011年8月16日，申请号为201080007963. 4。
[0002] 本发明涉及能够利用甘油作为碳源发酵生产琥珀酸的细菌菌株，其中所述菌株是 经过遗传修饰的，使其包含下调的内源性丙酮酸-甲酸-裂解酶活性，并涉及利用此类微生 物生产有机酸，特别是琥珀酸的方法。
[0003] 发明背景
[0004] 从生物质发酵生产琥珀酸（SA)已引起了广泛关注，因为所述酸是合成树脂的重 要成分，或者是其他有价值的低分子化学化合物的来源，特别是四氢呋喃（THF)、1，4- 丁二 醇（BDO)、γ-丁内酯（GBL)和吡咯烷酮（TO-A-2006/066839)。
[0005] Lee等（2002a)描述了从牛的瘤胃分离的SA生产菌。所述细菌是不动的、不形成 芽孢的、嗜中温和嗜二氧化碳的革兰氏阴性的杆状或球杆菌。基于16S rRNA序列的系统发 生学分析和生理学分析表明所述菌株属于曼海姆菌（Mannheimia)属，作为新种，被称为产 瑭?白酸曼海姆菌（Mannheimia succiniciproducens)MBEL55E。在 100% CO2条件下，它在 6. 0-7. 5的pH范围内生长良好，并以2:1:1的恒定比例生产SA、乙酸和甲酸。当CO2饱和条 件下，用葡萄糖作为碳源，无氧培养产琥珀酸曼海姆菌MBEL55E时，在孵育7. 5h里，消耗了 19. 8g/L的葡萄糖，产生了 13. 3g/L的SA。此外，在该微生物中，通过突变/删除代谢基因， 改善了 SA的生产。乳酸脱氢酶IdhA、丙酮酸-甲酸-裂解酶pFIB、磷酸转乙酰基酶pta和 乙酸激酶ackA基因的组合突变/删除导致菌株将碳转化为SA的产量（YP/S)为0. 6g SA/ g添加的碳源。生产SA的时空产量为1.8g/升/h (Lee，2006)。
[0006] Lin等，2005描述了在Idh和PfI基因中都携带突变的大肠杆菌的变体菌株，称为 SB202。然而，该菌株的特征是生长缓慢，且在无氧条件下不能完全发酵糖类。失活的Idh 和Pfl导致碳流动被限制于丙酮酸节点，导致丙酮酸作为主要产物积累。在该方面，发现基 于碳源的琥?白酸的碳产量（YP/S)低于0. 15g/g SA/碳。
[0007] Sanchez等，2005描述了在Idh、adhE、ack-pta和icIR基因中携带突变的大肠杆 菌菌株。在这些实验中，细胞有氧的生长在复杂培养基上，在有氧条件下收获、浓缩和用碳 源孵育。在这些用于将碳水化合物直接转化为SA的特定条件下，发现碳产量YP/S为0. 98 至I. 13g SA/g碳源，时空产量为0. 79g/l h SA。在好氧转化阶段前的生物量生产的碳利用 明确的不包括在该计算中，且未进行进一步描述。
[0008] Hong和Lee (2001)描述了在Idh和pfl基因中携带突变的大肠杆菌菌株。这些 菌株确能从碳水化合物发酵中生产SA，然而，伴随缓慢的碳水化合物利用和从碳水化合 物碳源葡萄糖的低的SA时空和碳产量（YP/S)。此外，产生琥珀酸、乙酸和乳酸的比例为 1:0. 034:1. 6。在该分析中，与未突变的亲本菌株相比，在Idh和pfl基因中携带突变的菌 株的生长是迟缓的。
[0009] Zhu等，2005描述了在pfl基因中突变的E. coli菌株，其不产生琥珀酸，但产生乳 酸，当在以葡萄糖为惟一底物的条件下生长时，表现出低下的生长。
[0010] 然而，生物产琥珀酸曼海姆菌的重要缺陷是它不能代谢甘油，而甘油作为三酰 基甘油（TAG)的组分是便于获得的，例如作为生物柴油生产的酯基转移反应中的副产品 (Dharmadi 等，2006)。
[0011] 科学文献中已描述了从甘油发酵生产SA (Lee等，2001 ;Dharmadi等，2006)，并且 甘油获得了比普通糖类如葡萄糖更高的产量（生产的SA的质量/消耗的原材料的质量） (Lee等，2001)。然而，用甘油获得的时空产量显著低于葡萄糖（0. 14vs. LOg SA/[L h])。
[0012] 仅在少数情况下描述了将甘油无氧代谢成发酵产物。E. COli能够在非常特定的 条件下发酵甘油，例如酸性PH，避免积累发酵氢气，以及恰当的培养基组成（Dharmadi等， 2006, Yazdani和Gonzalez 2007)。许多微生物能够在存在外部电子受体的条件下代谢 甘油（呼吸代谢），极少数能够发酵代谢甘油（即，在缺少电子受体的条件下）。在肠杆 菌科的若干个种中，已详细的研宄了甘油的发酵代谢，例如弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii)和肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)。这些生物体中的甘油异化作用 与它们合成高度还原的产物1，3-丙二醇（1，3-PD0)的能力是严格相关的（Dharmadi等， 2006)。已报道了使用产瑭泊酸厌氧螺菌（Anaerobiospirillum succiniciproducens)将甘 油转化为SA (Lee等，2001)。该研宄证实，使用甘油作为碳源可以生产SA并极少形成副产 物乙酸，因而有利于SA的纯化。通过间歇性添加甘油和酵母提取物，获得最高产量，该对策 获得约19g/L SA的产量。然而应注意，酵母提取物中存在进行甘油发酵所需的未鉴定的营 养组分。然而，由于糖类比多元醇甘油更低的还原状态，糖类理论上应该以比甘油显著更低 的产量转化为SA。发现在生产SA的厌氧性生物体中，糖类与甘油的组合是有作用的（Lee 等，2001)，但没有达到超过29g/L的SA滴度。此外，发现碳产量YP/S仅为92 %，而SA/AA 比为4. 9:1。最多仅4g/L甘油转化为琥珀酸。
[0013] 由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPG)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK)和丙酮酸 羧化酶（PycA)催化的草酰乙酸的羧化反应利用H〇V作为〇} 2源（Peters-Wendisch，PG等， 1996, 1998)。因此，碳酸氢盐来源例如NaHC03、KHC03、NH4HC0 3等可用于发酵和培养基质，以 改善底物至SA的代谢中HCCV的利用度。迄今为止的现有技术中尚未发现从葡萄糖生产SA 依赖于添加 HC03_。
[0014] 厌氧生物体的生物质生产受从发酵通路生产的ATP量的限制。厌氧生物体中的甘 油的生物量产量低于糖类的，例如己糖如葡萄糖、果糖，戊糖如木糖、阿拉伯糖或二糖例如 鹿糖或麦芽糖（Lee 等，2001，Dharmadi 2007) 〇
[0015] 早期的专利申请PCT/EP2008/006714公开了这样的细菌菌株，其属于巴斯德氏 菌科（Pasteurellaceae)的成员，从瘤胃中原始分离，并能够利用甘油作为碳源，来源于 它的变体和突变菌株保留了所述能力，特别是以保藏编号DSM 18541 (ID 06-614)保藏在 DSMZ (德意志微生物保藏中心，D-38124不伦瑞克，因霍芬路7B，德国）中的命名为DDl的 细菌菌株，具有生产琥珀酸的能力，来源于它的变体和突变菌株至少保留了所述生产琥珀 酸的能力，该申请的内容通过引用整合到本文中。根据Kuhner等，2010的分类，DDl菌株属 于 Basfia succiniciproducens 种，巴斯德氏菌科。
[0016] 因此，需要新型的细菌菌株，其具有从甘油生产有机酸，特别是SA的能力。特别的 是，此类菌株应该以高生产力从甘油生产所述酸类，尤其是可以使用不进行在先纯化、例如 来自生物柴油生产的粗制甘油。本发明的目标是提供此类新型菌株和生产方法。
[0017] 发明概沐
[0018] 本发明人分离了名为DDl的细菌菌株，令人惊讶的通过突变所述菌株解决了所述 目标，使得PFL蛋白质的活性下降，而使得所述菌株具有理想的代谢特征。因而，提供了能 够利用甘油作为碳源发酵生产琥珀酸的新型细菌菌株，其中所述菌株是经过遗传修饰的， 使得其包含下调的内源性PFL酶活性。
[0019] 本发明人令人惊讶的发现此类突变的细菌菌株具有理想的代谢特征，在SA发酵 中表现出极大改善的技术表现。 附图简介
[0020] 图1描述了质粒pSacB(SEQ ID N0:3)的示意图。
[0021] 图 2 描述了质粒 pSacB(Apfl) (SEQ ID N0:4)的示意图。
[0022] 图 3 描述了质粒 pSacB(AIdh) (SEQ ID N0:5)的示意图。
[0023] 发明详沐
[0024] a)特定术语的一般定义：
[0025] 本文使用的术语"细菌细胞"指原核生物体，即，细菌。细菌可以基于它们的生物 化学、微生物学特性及其形态学来分类。这些分类标准是本领域普遍已知的。
[0026] 术语"酸"（如本文所指的有机单羧酸或二羧酸，即乳酸和SA)理解为最广泛的含 义，并且也涵盖了它的盐，例如碱金属盐、如Na和K盐，或碱土金属盐，如Mg和Ca盐，或铝 盐；或所述酸的酸酐。
[0027] 两条序列之间的"同一性"或"同源性"意指在所比对序列的完整长度上的残基的 同一性，例如在生物信息学软件包EMBOSS (版本5. 0. 0,http://emboss, sourceforge. net/ what/)中的程序needle的帮助下计算的同一性（对于较相似的序列），使用默认参数为：
[0028] gapopen(打开1个空位的罚分）：10. 0
[0029] gapextend(延伸空位的罚分）：0· 5
[0030] datafile (软件包中包括的打分矩阵文件）！EDNAFUL
[0031] 术语"含有编码具有活性减少的丙酮酸-甲酸-裂解酶的突变基因的细菌菌株" 涵盖了具有减少的活性或者甚至不可检测的PEL活性的修饰的细菌细胞。用于检测和确定 PFL活性的罚分可见于Knappe等，1990和Knappe 1993及其中的参考文献中。此外，术语 涵盖了当相比表现出生理学丙酮酸-甲酸-裂解酶活性的细菌细胞时，具有显著降低的PFL 活性的细菌细胞。通过本领域技术人员普遍已知的统计学方法，可以确定降低是否是显著 的。PFL活性缺陷的细菌细胞可以天然的存在，即由于自发突变。可以通过各种技术来修饰 细菌细胞至缺少或具有显著降低的PFL活性。优选的，此类细菌细胞时、是通过化学处理或 辐射可获得的。为此目的，通过例如诱变的化学试剂、X射线或UV光处理细菌细胞。在随 后的步骤中，选择这些缺少PFL或至少具有降低的PFL活性的细菌细胞。细菌细胞还可通 过同源重组技术获得，所述技术的目标是突变、断裂或切除细菌细胞基因组中的PFL，或者 导入将导致编码具有减少活性的蛋白质的突变基因的突变。下文描述了重组的优选技术， 特别是用于导入突变或删除序列的。
[0032] 上文的定义还适用于编码本文提及的另一种酶的、待调节的其他基因，特别是所 述调节指其活性是减少的、消失的或关闭的。
[0033] 术语"减少的活性"包括例如所述遗传操作的（例如，遗传改造的）微生物的基因 产物（例如，丙酮酸-甲酸-裂解酶（ΡΠ )、乳酸脱氢酶（Idh)或其他）的表达处于比操作 微生物前的表达更低的水平。遗传操作可以包括但不限于改变或修饰与特定基因表达相关 的调控序列或位点（例如，通过去除强启动子、诱导型启动子或多重启动子）、修饰特定基 因的染色体位置、改变与特定基因相邻的核酸序列如在启动子区域的序列，包括对启动子 活性重要的调控序列、核糖体结合位点或转录终止子、减少特定基因的拷贝数、修饰涉及特 定基因转录和/或特定基因产物的翻译的蛋白质（例如，调控蛋白、抑制子、增强子、转录激 活子等），或者任何其他的常规手段，来降低现有技术中常规的特定基因的减少的表达（包 括但不限于使用反义核酸分子，或者其他的敲除或阻断表达靶蛋白的方法）。
[0034] 特别的是，可以操作基因使得从宿主生物体的染色体中删除一个或多个核苷 酸。还可以通过导入一个或多个基因突变，来获得活性减少的基因产物，例如丙酮酸-甲 酸-裂解酶分子，其中上市突变导致基因产物的活性减少。活性减少可以是将酶活性降低 了多50%的非突变或未改变的酶