用于微生物的分离、表征和/或鉴定的分离装置的制作方法

专利名称：用于微生物的分离、表征和/或鉴定的分离装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于分离微生物的分离装置。具体而言，本发明的装置可以用于分离微生物从而进行表征和/或鉴定。
背景技术：
生物学流体中病原微生物的检测应该在尽可能最短的时间内进行，尤其是在败血症的情况下，对于该病症尽管医生可利用的抗生素范围广泛，但是其死亡率仍然保持较高。 生物学活性剂(诸如微生物)在患者体液尤其是血液中的存在，一般采用血培养瓶进行检测。血流感染与高的发病率和死亡率有关，然而当前的诊断方法，即培养后进行生物化学鉴定和抗生素敏感性测试，可能要花费几天时间来进行。通常，基于临床症状开始进行经验疗法，而只有当初始疗法无效时，试验结果才会影响临床决策。在阳性血液培养结果之后的最初几个小时内、优选在1个小时内表征血液感染的能力将会显著地提高所提供的诊断信息的临床相关性。已经提出了分子扩增方法来填补这方面的需要，但是对于这种方法仍然存在严重的挑战。阳性血液培养液自身代表具有用于各种快速、鉴定(ID)试验的潜能的天然扩增的微生物种群。为了提供稳健的结果，传统的自动化表型ID试验(诸如Vitek 、Phoenix 和 Microscan 系统)或手动表型试验(诸如API)都要求微生物处于合适的生长阶段并且无干扰培养基和血液产物。这些系统采用了在平板培养基上从阳性肉汤中生长18 M小时的菌落。然而，为了获得更快的结果，一些实验室已经报道了采用这些系统以及从阳性血液培养瓶中分离的微生物。这些直接获自培养瓶的测试并不适用于所有微生物(例如，革兰氏阳性球菌)，未经试厂商验证，并且一般要花费3 8小时才能提供结果。迫切需要更快速且更广泛的特异性测试，以便在阳性培养结果之后的最初几个小时内、优选1小时内为医师提供临床上相关的结果。光学光谱学方法诸如内荧光(IF)、红外光谱法(FTIR)或拉曼光谱法，以及质谱方法诸如MALDI-T0F，都具有实现非常快速地鉴定微生物的潜能，但是可能会遇到在液体微生物培养基中和临床样品诸如血液或其组合中存在的许多高度荧光和吸收性化合物的干扰。 直接从阳性血液培养液中回收微生物的最常用的方法是两步差速离心和在血清分离器管中的离心。然而，这些方法具有一些缺点。所得的微生物制剂经常包含污染性的红血细胞、 血小板、脂质微粒、血浆酶和细胞碎片，这些都可以导致传统表型ID测试结果变差。这些方法也是非常劳动密集型的并且由于能够使潜在危险的病原体在空气中暴露于使用者的步骤而是不安全的。仍需要从血液培养液和其它无这些干扰物质并与快速鉴定技术相容的复
3杂样品中分离微生物的简单、安全且可靠的方法。

发明内容
本发明涉及可以用于从包含或疑似包含微生物的样品中分离微生物的分离装置或容器。根据本发明，分离装置可以用于分离或粒化未知微生物以及随后对分离的样品或颗粒进行探询从而表征和/或鉴定未知微生物。在一个方面，本发明涉及用于分离和鉴定微生物的容器，所述容器包含(a)具有宽内径的上部分；(b)具有窄内径的下部分；和 (C)在容器的底部、顶部和/或一个或多个侧面上的光学窗口，所述光学窗口能透过至少一部分的近红外光光谱、可见光光谱/或紫外光光谱。可选地，该容器可以另外具有连接宽内径的上部分和窄内径的下部分的中间楔形部分。在另一个方面，本发明涉及一次性(任意使用)的分离装置，包含(a)圆柱形容器，其包含具有纵轴的主体，该主体界定了沿着所述轴取向的并具有第一端和第二端的细长内部毛细管，该主体进一步界定了连接至毛细管第一端的储液池；(b)其中接近毛细管第二端的主体由光学透明材料制成；(C)用于能够进入储液池从而允许流体样品分散在该储液池内的储液池的盖子。可选地，圆柱形容器可以包含储液池内的密度缓冲垫层。该容器可以另外具有连接储液池和毛细管的楔形部分。在本发明的一个实施方式中，以本文中所述的方式在位于分离装置或容器中的毛细管的底部分离或粒化微生物剂。可以对分离或粒化的微生物剂进行探询从而表征和/或鉴定微生物剂。在另一个实施方式中，可以将分离装置密封，例如，可以对装置进行气密式密封。 这些装置在处理潜在的感染剂时可以提供安全优势。在其它可能的实施方式中，这种分离装置可以提供获得分离的、离析的或粒化的微生物样品的工具，由此允许将样品在探询或其它测试之前从分离装置中移出。


图1是根据本发明的一个实施方式的分离装置的透视图。图2是图1的分离装置的横截面视图。图3是根据本发明的另一个实施方式的分离装置的透视图。图4是图3中所示分离装置的顶部分的横截面视图。图5是图3中所示分离装置的底部分的横截面视图。该分离装置的底部分安装在图4的分离装置的顶部分的下端。图6是图3的分离装置的横截面视图，显示了在分离装置的毛细管部分中的分离的微生物剂(例如，离心后的颗粒)。图7是图3分离装置的底部分的另一个实施方式的横截面视图。如所示，该实施方式具有两个通至邻近窄侧壁的锯齿状相对侧面，由此允许从分离装置的侧面对毛细管部分中的分离的微生物剂进行探询。
图8示意性地示出了图6的分离装置中的浓缩微生物剂经由探询模块通过管子底部进行探询。图9是本发明分离装置的又一个可选实施方式的透视图。图10是图9的分离装置的横截面视图。图11是本发明分离装置的可选盖子的透视图。图12显示了根据本发明的一个实施方式的分离装置的照片。根据本发明，在照片中清晰可见的是溶胞样品、密度缓冲垫层和微生物颗粒。
具体实施例方式本发明可以以不同的形式体现并且不应该解释为仅限于本文中所阐述的实施方式。相反，提供这些实施方式以便使本公开是更全面和完整的，并将向本领域的技术人员充分表达本发明的范围。例如，可以将有关一个实施方式示出的特征结合到其它实施方式中， 以及可以将有关具体实施方式
示出的特征从该实施方式中删除。另外，依据本公开，在本文中提出的对实施方式的各种变通和添加对于本领域的技术人员是显而易见的，所述的各种变通和添加没有偏离本发明。用于分离、表征和/或鉴定微生物的方法已经公开在以下共同受让的美国专利申请中(1)于2009年10月30日提交的序列号为，标题为“Method for the Isolation and Identification of Microorganisms” ；(2)于 2009 年 10 月 30 日提交的序列号为―，标 IS为“Method for Separation, Isolation and/or Identification of Microorganisms using Spectroscopy”；(3)于2009年10月30日提交的序列号为―，标题为“Method for Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms using Mass Spectrometry” ；和(4)于2009年10月30日提交的序列号为―，标题为“Method for Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms using Raman Spectroscopy".将这些申请结合于本文中作为参考。简而言之，这些发明公开了用于离析、表征和/或鉴定样品中的微生物的方法。方法实现了比现有技术更快速地分离、表征和/或鉴定微生物，从而产生更快速的诊断(例如，在患有或疑似患有败血症的受试者中)并鉴定受污染物质(例如，食品和药物)。在这些方法和其他表征和/或鉴定微生物的方法中，提供用于后续表征和/或鉴定程序的分离的、离析的或粒化的微生物样品经常是必要的。本发明公开了可以用于从样品中分离、离析或粒化微生物的分离装置。例如，本发明的分离装置可以用于从液体培养物(例如，血液培养物)中粒化微生物(例如，通过离心)。然后可以对微生物颗粒进行一个或多个探询步骤以提供用于表征和/或鉴定微生物的测定结果。在一个实施方式中，可以实施探询步骤，同时分离的、离析的或粒化的微生物样品保留在分离装置中。例如，密封的分离装置(例如，气密式密封装置)可以用于制备分离的、 离析的或粒化的微生物样品，随后，可以对分离的、离析的或粒化的微生物样品进行非侵入式的探询技术以提供能够表征和/或鉴定微生物的数据或测定结果。在另一个实施方式中，在探询之前可以将分离的、离析的或粒化的微生物样品从分离装置中移出。例如，分离的、离析的或粒化的微生物可以再悬浮于适当的缓冲溶液中并从该装置或容器中移出(例如，通过移液管)。在另一个实施方式中，如本文中所公开的，分离装置或容器可以包含能够从分离装置或容器上拆卸或断开的下部分(即，可拆卸的下部分)。在操作中，该下部分可以从分离装置或容器断开以提供获取其中的分离的或离析的微生物的机会。一般而言，本发明的分离装置或容器可以是用于从包含或疑似包含微生物的测试样品中分离、离析或粒化微生物的任何装置或容器。例如，这种分离装置或容器可以包含单块或多块主体和封盖或盖子。装置的主体可以模塑制成、吹塑制成或采用本领域众所周知的其他技术形成。一般而言，可以使用任何已知的塑料、玻璃或透明材料等用于分离装置。 将要形成的分离装置在一个末端具有开口，从而提供进入该装置或容器的内部的通道用于装载和/或卸载测试样品。在实施方式中，分离装置或容器包含圆柱形主体，该主体在一端是封闭的而在对面一端是开口的。通常，封盖或盖子可以采用任何已知的机制来封闭或另外密封该装置或容器的内部以与外部环境隔绝。例如，封盖或盖子可以是卡扣型的盖子，其连接到装置或容器的主体上并且可以卡扣到装置或容器的开口的上方以封闭或密封该装置的内部与外部环境隔绝。可选地，封盖可以是螺纹盖，其能够螺旋拧到该装置或容器上以封闭该装置/容器。如本领域内众所周知的，盖子可以在其内壁上具有螺纹，该螺纹可以丝扣到或螺旋拧到位于装置或容器外壁上的螺纹上。在一个实施方式中，盖子可以在其内表面上包含一个或多个橡胶0型环，如本领域内众所周知的。一个或多个0型环的应用提供了密封(例如，气密式密封)。在另一个可能的实施方式中，如图11中所示，封盖或盖子100 可以具有能够例如被针等刺穿的可刺穿隔膜104，从而实现将测试样品输送到密封的装置或容器中。可刺穿隔膜104的应用可以在处理潜在感染剂时为使用者或技术员提供安全优势并能够使鉴定方法自动化。可刺穿隔膜104还确保装置或容器保持密封(例如，气密式密封)，并因此为分离装置提供保护避免可能的污染。在本发明的分离装置或容器中可以进行分离、离析或粒化的测试样品，包括其中存在或生长或可能疑似存在或生长微生物的临床和非临床样品，以及常规或不定期测试微生物存在的物质样品。例如，测试样品可以是来自临床或非临床试样样品的培养物的培养液。可以进行培养并随后经过分离技术分离、离析或粒化其中所含的微生物的典型试样样品，可以包括，血液、血清、血浆、血液部分、关节液、尿液、精液、唾液、粪便、脑脊髓液、胃内容物、阴道分泌物、组织勻浆、骨髓抽取液、骨勻浆、痰、抽吸物、拭子和拭子渣液 (rinsates)、其他体液，等等。在一个实施方式中，如本文中进一步所述的，分离装置或容器可以应用密度缓冲垫层用于从测试样品中分离、离析或粒化微生物。如本文中所用的术语“密度缓冲垫层”是指整体上具有均勻密度的溶液。所用的密度缓冲垫层在本文中进一步描述。例如，可以将已知包含或可能包含微生物的测试样品装载到容纳于该装置或容器内的密度缓冲垫层的上方，并将该装置的容器离心以离析或粒化微生物。根据该实施方式，分离装置或容器将具有足以容纳密度缓冲垫层和样品的容积。在一个实施方式中，该容器放入或可以被放入离心机转子中。容器的容积可以是约0. Iml至约25ml，例如约Iml至约15ml，例如，约1. 5ml 至约8ml。如果分离在微量规模上进行，则容器的容积可以是约2μ 1至约100 μ 1，例如，约 5 μ 1至约50 μ L0在一些实施方式中，如在本文中更详细讨论的，分离装置或容器可以预先载入密度缓冲垫层。在一些实施方式中，在将样品放置或铺层在顶部之前可以在密度缓冲垫层的顶部放置中间层(液体或固体)以便防止密度缓冲垫层和样品之间的任何混合。例如，可以将薄膜放置于预先包装的密度缓冲垫层的上方以防止密度缓冲垫层与随后加入的测试样品发生混合。在又一个实施方式中，分离装置或容器可以预先载入密度缓冲垫层并随后预先载入溶胞溶液。所用的溶胞溶液公开在本文中所讨论的共同受让的美国专利申请中。根据该实施方式，可以使用薄膜来分离密度缓冲垫层和溶胞溶液，从而防止发生混合。在一个实施方式中，装置或容器具有容纳测试样品和大部分密度缓冲垫层的宽直径的上内腔室或储液池，和用于收集分离的、离析的或粒化的微生物且具有窄直径的下内腔室或毛细管。上内腔室或储液池可以具有约0. 32至约0. 40英寸，例如约0. 34至约0. 38 英寸，例如约0.36英寸的内径。对于微量分离，内径可以甚至更小。例如，窄部分的内径可以是约0. 001至约0. 04英寸，例如约0. 002至约0. 01英寸。下内腔室或毛细管可以具有约0. 04至约0. 12英寸，例如约0. 06至约0. 10英寸，例如约0. 08英寸的内径。在另一个实施方式中，装置或容器是一次性的分离装置，包含管状容器，该管状容器包含具有纵轴的主体，该主体界定了沿着该轴取向的具有第一端和第二端的细长的内部毛细管，该主体进一步界定了连接到毛细管的第一端的储液池。在该实施方式的一个方面， 接近毛细管的第二端的主体由光学透明材料制成。为储液池提供可拆卸的封盖或盖子并使进入储液池成为可能，从而允许将流体样品分散到储液池中。可选地，可以将密度缓冲垫层预先包装到设备或容器中。分离装置或容器也可以具有连接上内腔室或储液池和下内腔室或毛细管的中间楔形部分。中间楔形部分的内侧壁在上内腔室或储液池与下内腔室或毛细管之间可以逐渐缩小，或可以缩小直径。楔形部分的内侧壁可以具有约20至约70度，例如约30至约60度的角度。在一个实施方式中，下面的窄部分小于容器总高度的一半，例如，小于容器总高度的约 40%、30%、20%或 10%。在某些实施方式中，对容器进行设计以使分离的、离析的或粒化的微生物在分离之后可以很容易地手动或以自动的方式从容器中回收(从而使技术人员不会暴露于容器的内容物)。例如，容器可以包含可拆卸的部分或脱离部分，该部分包含颗粒并可以与容器的其余部分分开。在另一个实施方式中，容器包含用于在分离之后获取颗粒的工具，诸如一个或多个用于插入注射器或其它采样装置或用于将颗粒引出的孔道或可穿透的表面。在一个实施方式中，容器可以是管，例如离心管。在另一个实施方式中，容器可以是小片或卡片。 在一个实施方式中，该容器是独立容器，即，用于分离单个样品的装置。容器可以包含光学窗口，通过该光学窗口探询能够进行。光学窗口可以在容器的底部、顶部和/或侧面上。窗口可以由任何透光(例如，至少一部分的近红外光(OTR ； 700nm-1400nm)、紫外光(UV ； 190nm-400nm)和 / 或可见光(VIS ；400nm-700nm)光谱)的材料构成。合适的材料的实例包括但不限于，丙烯酸树脂、甲基丙烯酸酯、石英、熔凝硅石、蓝宝石、环状烯烃共聚物(COC)和/或环烯烃聚合物(COP)(例如，Zeonex (Zeonex , San
Diego，CA))。在一个实施方式中，整个容器由光学窗口材料制成。在另一个实施方式中，该容器可以由两个或多个独立部件，诸如用于光学窗口的光学UV-VIS-OTR透明组件和构成容器的其余部分的其他材料(例如，低成本标准成型塑料)制成(例如，模塑制成)。在一个实施方式中，光学窗口足够薄以允许进行光谱探询，这将取决于窗口的材料。在另一个实施方式中，光学窗口是尽可能薄的以减少对探询的干扰。例如，窗口可以具有小于约0.20 英寸，例如小于约0. 15,0. 10或0. 05英寸的厚度。现在参照附图，将会对本发明的分离装置或容器的几种可能的设计结构进行进一步例证。分离装置的一个可能的实施方式在图1 2中示出。如图1和图2中所示，分离装置2包含一般具有圆柱形状的下部分6和由向外凸出的脊结构或凸缘8、开口 9和封盖4 界定的上部分。下部分6包含容器主体10，所述容器主体10封闭了内腔室，该内腔室包含全都围绕容器的纵轴排列的上储液池14、中间楔形部分16和下毛细管18。如所示，中间楔形部分16连接较宽直径的上储液池14和较小直径的毛细管18。一般而言，容器主体10可以由本领域内已知的任何塑料材料模塑制成或另外形成。向外凸起的脊结构或凸缘8可以充当封盖4的挡块和/或可以提供实现由使用者改善握紧装置的部件。装置的上部分也可以在装置2的外壁上提供螺纹12用于将封盖4丝扣或螺旋拧到装置2上，从而封闭或密封内腔室。装置可以进一步包含薄的光学窗口 19，通过这个窗口能够进行探询。在一个实施方式中，光学窗口 19的直径被设计用于匹配光纤电缆并有助于装置精确耦合到光谱仪上。 如先前所描述的，光学窗口 19包含由透光材料构成的装置部分，并且通过该部分探询能够进行。在其它实施方式中，整个装置可以由透光材料制成，从而允许通过其进行探询。在一些实施方式中，该实施方式的分离装置2可以预先载入密度缓冲垫层43 (例如图6 7中所示的)以有助于微生物的分离、离析或粒化。在另一个实施方式中，刚好在装载待进行本文中描述的分离步骤的样品之前将密度缓冲垫层加入到分离装置2中。在又一个实施方式中，分离装置2可以预先载入密度缓冲垫层43和溶胞溶液(未显示)以有助于样品溶胞和微生物的分离、离析或粒化，如本文中参考的共同受让的美国专利申请中所描述的。在另一个实施方式中，如在图3 6和图8中所示，分离装置20可以由可以扣到一起或另外连接的两个独立部分上部分22和下部分M制成以形成单个分离装置20。一般而言，通过本领域内的任何已知方式可以将下部分M可拆卸地连接或永久性地连接到上部分22。上部分22包含一般具有圆柱形状的上主体32、向外突起的脊结构或凸缘30和开口四。可以采用封盖或盖子52将开口封闭或密封(参见图8)。上主体32进一步界定了内腔室的上部分。内腔室包含了全都围绕容器的纵轴排布的上储液池40、中间楔形部分42 和毛细管45的上部件44。下主体34包含毛细管45的下部件46。当上主体32和下主体 34扣到一起，或另外附加到一起时，它们封闭了上腔室，该上腔室再次包含上储液池40、中间楔形部分42和毛细管45。如所示，中间楔形部分42连接较宽直径的上储液池40和较小直径的毛细管45。下主体34进一步包含能够适合(例如，扣入或连接到)上主体32底部中的对应凹槽38的结构，例如在下主体34的顶部中形成的凸脊36。装置20的下主体34 可以进一步包含薄的光学窗口 26，通过该光学窗口探询能够进行。如先前所述，光学窗口沈包含由透光材料构成的装置部分，并且通过该部分探询能够进行。在其他实施方式中，整个装置可以由透光材料制成，从而允许通过其进行探询。如先前所述，对容器进行设计以使分离的、离析的或粒化的微生物在分离之后可以很容易地手动或以自动方式从该容器中回收(从而使技术人员不会暴露于容器的内容物)。例如，下部分M在分离步骤之后是可拆卸的，从而允许用户获取分离的或粒化的微生物，所述的微生物将包含在下部分M的毛细管45的下部件46中。在一些实施方式中，该实施方式的分离装置20可以预先载入密度缓冲垫层43 (例如，图6 7中所示的)以有助于微生物的分离、离析或粒化。在另一个实施方式中，可以刚好在待进行本文中所述的分离步骤的样品装载之前将密度缓冲垫层加入分离装置20中。在又一个实施方式中，分离装置20可以预先载入密度缓冲垫层43和溶胞溶液(未显示) 以有助于样品溶胞和微生物的分离、离析或粒化。分离装置的下部分的另一个实施方式在图7中显示。根据本发明，下部分48可以可拆卸地连接或永久性地连接到上部分22以形成分离装置39。上部分22和下部分47分别包含界定内腔室的上主体32和下主体49。内腔室包含上储液池(未显示)、中间楔形部分42和毛细管45。如所示，下主体34进一步包含斜向内的外壁48，其导致在内部毛细管 45的底部对侧上的侧壁薄。这些薄侧壁实现通过分离装置的侧面对分离的、离析的或粒化的微生物50进行探询。在分离装置60的又一个实施方式中，在图9 10显示。参照这些图，分离装置60 包含主体62，主体62界定了上储液池80、中间楔形部分82和下毛细管84。中间楔形部分 82连接较大直径的上储液池80和下毛细管84。经由可拆卸的封盖或盖子72进入上储液池80，可拆卸的封盖或盖子72可以丝扣或螺旋拧到在主体62的顶部外壁上形成的螺纹66 上。根据该实施方式，主体62的下部分包含4个稳定翼68，其用于当分离装置60竖直立于例如桌上时提供稳定性。在另一个实施方式中，在翼68底部上的四个凹口产生用于精确耦合光纤探针的凹陷区域。按照这种方式集束的激发光束导致荧光再现性的改善并降低了由杂散散射光产生的发射信号的污染。分离装置60进一步包含在毛细管84底部的主体62 中形成的光学窗口 70。光学窗口 70包含在主体62上厚度降低的小部分，通过该小部分能够对分离的、离析的或粒化的微生物进行探询。如本文中所述的，光学窗口 70可以由光学透明材料制成。在一些实施方式中，该实施方式的分离装置60可以预先载入密度缓冲垫层85 (如例如图10中所示的)以有助于微生物的分离、离析或粒化。在另一个实施方式中，可以在刚好装载待进行本文中描述的分离步骤的样品之前将密度缓冲垫层加入到分离装置60中。 在又一个实施方式中，分离装置60可以预先载入密度缓冲垫层和溶胞溶液以有助于样品溶胞和微生物的分离、离析或粒化。图8显示了分离装置60内部的浓缩微生物剂50的探询操作。在一个实施方式中， 采用本领域内任何已知的方式可以对分离的、离析的或粒化的微生物进行探询(本文中如探询装置58所代表的)。例如，如在于2009年10月30日提交的标题为“Method for the Isolation and Identification of Microorganisms”，序列号为_的共同待决的美国专利申请中所公开的，探询步骤可以采用内荧光光谱法、拉曼光谱法或其它光学技术进行实施。尽管在上述实施方式中，在浓缩微生物剂仍然位于分离装置内时对其进行光谱探询，但是也可以设想，分离的、离析的或粒化的微生物样品可以从分离装置中移出并例如采用质谱法进行探询，如在于2009年10月30日提交的标题为“Method for Separation,Characterization and/or Identification of Microorganisms using Mass Spectrometry”，序列号为_的共同待决的美国专利申请中所公开的。如上文所提及的，可以实施分离、离析或粒化步骤以使微生物与样品的其它组分 (例如，非微生物或其组分)分离并将微生物浓缩成可以进行探询用于鉴定和表征目的的分离的、离析的或粒化的样品。分离或粒化步骤不必是完全的，S卩，不需要进行100%的分离。需要的是微生物与其它样品组分的分离足以允许对微生物进行探询而基本上不会受到其它组分的干扰。例如，分离能够产生至少约10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%纯度或更高纯度的微生物颗粒。在一个实施方式中，如在本文中所讨论的共同受让的美国专利中请中更全面地描述的，通过离心步骤实施分离，在所述的离心步骤中通过将测试样品(例如，溶胞样品)放置于分离容器中的密度缓冲垫层的顶部并将该容器在以允许微生物被分离(例如，微生物可以在容器的底部和/或侧面上形成颗粒)的条件下离心。根据该实施方式，样品的其它组分(例如，可能存在于样品培养基中的非微生物或其组分)保留在密度缓冲垫层的顶部或密度缓冲垫层的顶层部分内。这种分离步骤将微生物与样品中的物质诸如培养基、细胞碎片和/或其它可能干扰微生物的探询(例如，通过内荧光)的组分分开。在一个实施方式中，所述密度缓冲垫层还用于分离活的微生物和死亡微生物(其不通过密度缓冲垫层)。 在另一个实施方式中，无论是在离心之前还是在离心之后，密度缓冲垫层都不含有密度梯度。换句话说，对分离容器离心的时间和/或加速度的量不足以使构成密度缓冲垫层的物质形成密度梯度。选择缓冲垫层的密度以便使样品中的微生物通过缓冲垫层而样品的其它组分 (例如，血液培养液、细胞碎片)仍然保留在缓冲垫层的顶部或没有完全通过密度缓冲垫层。也可以选择密度缓冲垫层用来分离活的微生物(其通过缓冲垫层)和死亡微生物 (其不通过缓冲垫层)。合适的密度将取决于密度缓冲垫层中所用的物质以及待分离的样品。在一个实施方式中，缓冲垫层的密度在约1.025至约1. 120g/ml，例如约1. 030至约 1. 070g/ml，约1. 040至约1. 060g/ml的范围中或约1. 025至约1. 120g/ml之间的任何范围中。在另一个实施方式中，缓冲垫层的密度是约1. 025,1. 030,1. 035,1. 040,1. 045,1. 050、 1. 055,1. 060,1. 065,1. 070,1. 075,1. 080,1. 085,1. 090,1. 095,1. 100,1. 105,1. 110,1. 115 或 1. 120g/ml。用于密度缓冲垫层的物质可以是具有用于本发明方法的适当的密度范围的任何物质。在一个实施方式中，物质是胶体二氧化硅。胶体二氧化硅可以是未涂覆的(例如， Ludox (W. R. Grace, CT))或者是例如采用硅烧(例如，PureSperm (Nidacon Int ‘ 1， 瑞典)或 Isolate (Irvine Scientific, Santa Ana, CA))或聚乙烯吡咯烷酮(例如， Percol 1 , Percol 1 Plus (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO))涂覆的。在一个实施方式中， 选择了对光谱探询产生最小干扰的胶体二氧化硅，例如，具有最低内荧光的物质。胶体二氧化硅可以在任何合适的介质中稀释以形成合适的密度，例如，平衡盐溶液、生理盐水和/或 0. 25M蔗糖。合适的密度可以采用浓度为约15%至约80% v/v，例如约20%至约65% ν/ν 的胶体二氧化硅获得。用于密度缓冲垫层的另一种合适的物质是碘化造影剂，例如碘海醇 (Omnipaque NycoPi^p ，或 Nycodenz )和碘克沙醇(Visipaque 或 OptiPi^p )。对于血液培养样品，合适的密度可以采用浓度为约10%至约25% w/v，例如约14%至约18% w/ ν的碘海醇或碘克沙醇。对于血液培养样品，蔗糖可以以约10%至约30% w/v，例如约15% 至约20 % w/v的浓度用作密度缓冲垫层。可以用于制备密度缓冲垫层的其他合适的物质包括低粘度高密度的油，诸如显微镜浸镜油(例如，Type DF5Cargille Labs,New York)；矿物油(例如，Drakeol 5, Draketex 50, Peneteck ；Penreco Co. , Pennsylvania)；娃油(聚二甲基硅氧烷)；氟代硅油；硅凝胶；甲泛影酸盐-Ficoll (Lymphoft^p )，例如对于血液培养样品在约75%至约100%的浓度下；泛影酸盐-葡聚糖(Polymorphoft 印 )，例如对于血液培养样品在约25%至约50%的浓度下；羧甲基纤维素；羟丙基甲基纤维素；聚环氧乙烷(高分子量)；Pluronic F127 ；Pluronic F68 ；Pluronic :化合物的混合物；聚丙烯酸；
交联的聚乙烯醇；交联的聚乙烯吡咯烷；PEG甲醚甲基丙烯酸酯；果胶；琼脂糖；黄原胶；胶凝糖；Phytagel ；山梨醇；Ficoll (例如，对于血液培养样品，浓度为约10%至约15%的 Ficoll 400)；甘油；葡聚糖(例如，对于血液培养样品，在约10%至约15%的浓度下)；糖原；氯化铯(例如，对于血液培养样品，在约15%至约25%的浓度下)；全氟碳流体(例如， 全氟正辛烷)；氢氟碳流体(例如，Vertrel XF)等本领域内众所周知的物质。在一个实施方式中，密度缓冲垫层选自以任意组合形式存在的胶体二氧化硅、碘克沙醇、碘海醇、氯化铯、甲泛影酸盐-Ficoll 、泛影酸盐-葡聚糖、蔗糖、Ficoll 400和/或葡聚糖中的一种或多种。密度缓冲垫层也可以由物质的组合构成，例如，胶体二氧化硅和油的组合。上述化合物的某些组合对于本发明的分离和读取步骤可能是有益的。例如，具有不同UV-淬灭性质的化合物的组合，诸如氯化铯和碘海醇。密度缓冲垫层的体积/高度应该足以实现微生物与其它样品组分的分离。体积将取决于分离容器的尺寸和形状。一般而言，可以使用约0. 1至约5ml的体积，例如约0. 2至约1ml，例如约0. 2ml至约0. 5ml。如果分离是以微量规模进行的，则密度缓冲垫层的体积可以是约 μ 1至约100μ 1，例如约5μ 1至约50 μ 1。置于或铺层于密度缓冲垫层顶部的样品体积应该足以提供产生适于光谱探询的颗粒的足够微生物。一般而言，可以使用适于容器的任何体积。例如，可以使用约0. Iml至约5ml的体积，例如约0. 2ml至约1ml，例如约0. 2ml至约0. 5ml。如果分离以微量规模进行，则样品体积可以是约1 μ 1至约100 μ 1， 例如约5μ 1至约50μ 1。容器中对于样品的可利用空间将取决于容器的尺寸和形状。在一些实施方式中，在将样品放置或铺层在顶部之前可以将中间层(液体或固体)放置在密度缓冲垫层的顶部以防止密度缓冲垫层和样品发生任何混合。在一个实施方式中，中间层可以是聚乙烯珠。在另一个实施方式中，可以在密度缓冲垫层和样品之间放置小气泡以防止混合。在另外的实施方式中，可以将密度缓冲垫层铺层在高密度物质(例如，全氟碳流体) 的顶部从而使微生物在分离期间通过密度缓冲垫层并在密度缓冲垫层和高密度物质之间的界面处收集。在本发明的一个实施方式中，分离容器在甩平式转子中进行离心从而使微生物直接在容器底部形成颗粒。容器以足够的加速度离心足够长的时间从而使微生物与样品的其它组分分离(例如，形成颗粒)。离心加速度可以是约1，000 Xg至约20，000Χ g，例如约 2，500 X g至约15，000 X g,例如约7，500 X g至约12，500 X g，等。离心时间可以是约30s至约30min，例如约Imin至约15min，例如约Imin至约5min。离心可以在约2°C至约45°C，例如约15°C至约40°C，例如约20°C至约30°C的温度下进行实施。在一个实施方式中，分离容器包含封盖，并在离心之前将封盖应用于容器以形成气密式密封。封盖的存在降低了处理具有或可能具有传染性和/或危险性的微生物的风险，以及样品发生污染的风险。本发明的方法的优点之一是能够采用密封容器(例如，气密式密封容器)内的微生物实施方法的任何一个或多个步骤(例如，溶胞、分离、探询、和/或鉴定)。本发明方法涉及自动化系统的应用，避免了与处理高度毒性微生物相关的健康和安全性风险，诸如从样品中回收微生物用于直接测试时发生的。在一个实施方式中，对容器离心的时间和/或力不足以在密度缓冲垫层内形成密度梯度。本发明不涉及样品的超离心，例如，以超过约100，OOOXg的力进行离心。另外，本发明也不涉及等密度(平衡)沉降或分带。
11
—旦制备了分离的、离析的或粒化的微生物样品，可以实施后续探询步骤以提供用于表征和/或鉴定微生物的测定结果。所用的探询方式是本领域内已知的。其它探询方式描述在上文所讨论的共同受让的美国专利申请中。实施例实施例1.在原位鉴定纯化的微生物颗粒的装置和方法为了探索在分离装置中在原位快速分离和鉴定微生物的潜能，根据本发明，设计并由UV透明塑料模塑制成几种装置。这些装置包含几个共同的特征，包括封盖、样品储液池和能够对下面和/或侧面的沉降微生物颗粒进行光谱探询的楔形光学质量下部区域、以及有助于装置耦合到荧光分光光度计的特征。装置还必须在分离步骤期间能够经受相对较高的g-力。这种管的几个重复结构被设计用于改进微生物回收、荧光再现性并减少由杂散散射光引起的污染。该管也被设计成气密式密封。沉降的微生物球粒的光学探询通过将分离装置插入放置在荧光分光光度计样品室的定制适配器中或通过将分离装置直接耦合到连接至荧光分光光度计(FlUorolog 3， 来自HORIBA Jobin Yvon Inc. , New Jersey)的双叉分六环一 300 400 μ m的光纤电缆 (Ocean Optics,Dunedin,FL)来实现。构建三反射镜光纤适配器使其能够使用这两种系统检测器(PMT和CCD)。在每种微生物颗粒上收集激发-发射矩阵(EEM)全光谱(扫描范围 激发 260-800nm ；发射 ^O-IlOOnm ；增量 5nm)。量具重现性和可靠性研究在一次性装置-光纤电缆设计结构上采用纯化的色氨酸和核黄素溶液进行实施。对于这两种荧光团均获得小于2. 5%的目标CV，从而证实该一次性装置和研究平台的质量。这些装置证明适用于从培养基中分离和探询微生物。图12显示了在通过使用密度缓冲垫层离心分离包含金黄色葡萄球菌(S. aureus)的溶胞血液培养样品之后的装置实例。根据本发明，在照片中清楚可见的是溶胞样品、密度缓冲垫层和微生物颗粒。
权利要求
1.一种用于分离和鉴定微生物的容器，所述容器包含(a)具有宽内径的上部分；(b)具有窄内径的下部分；和(c)在容器的底部、顶部和/或一个或多个侧面上的光学窗口，所述光学窗口能透过至少一部分的近红外光光谱、可见光光谱和/或紫外光光谱。
2.根据权利要求1所述的容器，其中所述容器具有足以容纳足够样品以产生微生物颗粒的容积。
3.根据权利要求1所述的容器，其中所述上部分和下部分通过中间楔形部分连接。
4.根据权利要求1所述的容器，其中所述下部分小于容器的总高度的一半。
5.根据权利要求1所述的容器，其中所述容器包含封盖器件或带有螺纹以接受封盖器件从而密封所述容器。
6.根据权利要求1所述的容器，其中所述光学窗口由石英、熔融硅石、蓝宝石、丙烯酸树脂、甲基丙烯酸酯、环状烯烃共聚物、环烯烃聚合物或其任意组合组成。
7.根据权利要求1所述的容器，其中所述容器包括容纳其中的密度溶液。
8.根据权利要求7所述的容器，其中所述容器进一步含有选择性溶胞溶液。
9.根据权利要求8所述的分离装置，其中所述装置进一步包含分离密度缓冲垫层和溶胞溶液的薄膜。
10.根据权利要求7所述的容器，其中所述容器进一步包含聚丙烯球。
11.一种一次性的分离装置，包含(a)圆柱形容器，所述圆柱形容器包含具有纵轴的主体，所述主体界定了沿着所述轴取向的具有第一端和第二端的细长的内部毛细管，所述主体进一步界定了连接至毛细管第一端的储液池；(b)其中接近毛细管第二端的主体由光学透明材料制成；(c)用于能够进入储液池从而允许流体样品分散到储液池中的储液池盖子。
12.根据权利要求11所述的分离装置，其中所述装置进一步包含容纳在储液池内的密度缓冲垫层。
13.根据权利要求12所述的分离装置，其中所述装置进一步包含将溶胞溶液铺层在密度缓冲垫层顶部的上方。
14.根据权利要求13所述的分离装置，其中所述装置进一步包含分离密度缓冲垫层和溶胞溶液的薄膜。
15.根据权利要求11所述的分离装置，其中所述储液池具有在0.5和15ml之间的流体容量。
16.根据权利要求11所述的分离装置，其中所述装置进一步包含附加在主体上的终端件，所述终端件封闭了毛细管的第二端，并且其中所述终端件由光学透明材料制成。
17.根据权利要求11所述的分离装置，其中所述装置进一步包含位于所述储液池和所述毛细管之间的楔形部分。
18.根据权利要求11所述的分离装置，其中所述容器包含容纳其中的密度缓冲垫层。
19.根据权利要求11所述的分离装置，其中所述储液池进一步含有选择性溶胞溶液。
20.根据权利要求11所述的分离装置，其中所述储液池进一步包含聚丙烯球。
全文摘要
本发明涉及可以用于从已知包含或疑似包含所述微生物的测试样品中分离、离析或粒化微生物的分离装置或容器。随后，可以对分离的、离析的或粒化的微生物样品进行一个或多个探询步骤而提供用于微生物的表征和/或鉴定的测定结果。在本发明的一个方面，探询步骤可以在本发明中所述的分离装置或容器中在原位进行。
文档编号B01L3/14GK102271814SQ200980153286
公开日2011年12月7日 申请日期2009年10月30日 优先权日2008年10月31日
发明者克里斯多夫·罗恩斯克, 琼斯·海曼, 约翰·林克, 约翰·沃尔什, 罗恩·罗宾逊, 马克·威尔森 申请人:生物梅里埃公司