专利名称：堆肥微生物总dna的提取与纯化方法
技术领域：
本发明涉及DNA的提取与纯化，具体涉及堆肥中微生物总DNA的提取与纯化。
背景技术：
堆肥是利用微生物对可生物降解固体废物进行分解从而对其实现最终处理的一种系统，因此，充分认识其中的微生物学原理能为改进处理工艺、提高处理效率提供依据。对堆肥进行微生物群落研究的传统方法主要是微生物培养和纯种分离技术。因为环境中的绝大多数微生物是无法通过培养方式进行研究的，而且堆肥中的微生物种类繁多、常处于动态变化状态，培养研究无法反映系统中微生物的种群动态变化过程，因此，这样的研究方法已经无法满足堆肥微生物学研究的要求。分子生态学技术正是这样一种能在不对微生物进行培养而对其进行研究的新技术。
1992年Burke等在《Molecular Ecology》发刊词中提出分子生态学是应用分子生物学方法为生态学和种群生物学各领域提供革新见解的新兴学科，从而确立了分子生物学技术在分子生态学研究中的主体地位。目前，分子生态学研究已经涉及到环境科学研究的众多领域，包括在堆肥微生物分子生态学方面的研究。
在分子生态学研究中，DNA的提取与纯化是基础工作，高质量核酸样品的获得直接影响到后续分析的可信度。由于堆肥中微生物种类繁多，而且混杂有大量腐殖酸，因此，如何充分使微生物细胞裂解并释放DNA，有效减少腐殖酸等杂质的污染从而获得高产率和高纯度的DNA是对堆肥微生物群落进行分子生态学研究的关键。目前，新的适合堆肥微生物总DNA提取与纯化的方法体系尚未建成，大多数研究中还是借用植物或普通微生物DNA的提取与纯化方法，存在着速度慢，产量低，设备要求高，腐殖酸类污染物含量高等缺点。因此，寻找一种有效的DNA提取与纯化方法是利用分子生态学技术研究堆肥微生物所急需解决的问题。
发明内容
本发明旨在运用生物化学、分子生物学和微生物学的原理，研究一种DNA的提取与纯化方法，以解决堆肥中微生物总DNA的提取与纯化中存在的速度慢、腐殖酸等杂质含量高、DNA产率低与纯度不高等问题，从而提高堆肥中DNA的产率和纯度，以便更好地应用于堆肥微生物的分子生态学研究。
本发明是通过以下技术方案实现上述发明目的的。
堆肥中微生物总DNA的提取与纯化方法，包括DNA的提取与纯化，本发明的方法为(1)样品的洗涤待提取DNA的样品用0.12M磷酸盐缓冲液，以4～6ml/g堆肥的用量在25～35℃温度条件下，以150rpm速率匀速震荡15～30min，然后以6000×g离心10min，沉淀再次洗涤；(2)DNA的提取样品洗涤后，用1.2～1.5ml/g堆肥的溶菌酶溶液在37℃恒温条件下，以200～250rpm振荡温浴1～2h，然后均以0.5～0.8ml/g堆肥的用量加入裂解缓冲液、磷酸盐缓冲液和氯仿—异戊醇溶液，并以2500～3000rpm速率旋涡振荡10～15min，经0.6倍体积的异丙醇沉淀1～2h后，以16000×g速度离心10～20min，沉淀用0.8～1.5的ml冰70％乙醇洗涤两次后溶解于500～1000μl的TE缓冲液中，得到粗提的DNA溶液；(3)DNA的纯化粗提的DNA溶液用0.5～0.6倍体积的聚乙二醇和0.1倍体积的NaCl溶液在4℃温度条件下沉淀2～24h，然后取0.7ml粗提DNA溶液加入至DNA特异离心吸附柱内，在4℃，12000×g离心1min，DNA吸附于柱上，弃去收集管废液，重复上述操作直至粗提的DNA溶液全部离心完毕，吸附柱上的DNA经0.7ml冰70％乙醇洗涤两次，再用含RNaseA的TE缓冲液100～500μl洗脱DNA，得到纯化的DNA溶液。
下面结合附图进一步详述本发明
图1纯化后的堆肥微生物总DNA的琼脂糖凝胶电泳照片；其中Marker为从生物公司购买的DNA分子量标记，1，2，3分别代表三个平行样品，数字表示DNA的大小，单位是bp。
图2PCR扩增纯化DNA得到的16SrDNA产物的琼脂糖凝胶电泳照片；其中MarkerV为从生物公司购买的DNA分子量标记MarkerV，1，2，3分别代表三个平行样品，数字表示DNA的大小，单位是bp；目前，分子生态学在环境科学中的研究主要依赖于对生物的DNA进行分析研究。堆肥中的微生物种类是非常丰富的，因此，要对其中的微生物开展分子生态学研究，就必须获取高质、高量的DNA，然后利用PCR扩增、限制性内切酶酶切和梯度凝胶电泳以及建立克隆文库和DNA测序对微生物的DNA序列进行分析，从而获取微生物的遗传信息。
本发明首先对堆肥中的一部分腐殖酸类物质和微生物细胞外的DNA洗脱，既减少了腐殖酸类物质的污染，也消除了胞外DNA对实验结果的影响；因此本发明首先将磷酸盐缓冲液(0.12M，pH8.0，)与堆肥样品混合，使用时磷酸盐缓冲液用量为4～6ml/g堆肥，堆肥样品量增加时适量增加溶液用量，然后在振荡器上在25～35℃温度条件下匀速震荡(150rpm以上)15～3min，样品量较多时可提高振荡速度或延长振荡时间然后以6000×g离心10min，沉淀再次洗涤；样品洗涤后使用溶菌酶溶液37℃振荡(200～250rpm)温浴1h，堆肥样品量较多时可延长温浴时间，一般保持在2h以内；然后再加入裂解缓冲液(0.5～0.8ml/g堆肥)和磷酸盐缓冲液(0.5～0.8ml/g堆肥)以及氯仿—异戊醇溶液(0.5～0.8ml/g堆肥)旋涡振荡(2500～3000rpm以上)10～15min，样品量较多时可提高振荡速度或延长振荡时间将微生物细胞裂解，经0.6×体积异丙醇沉淀1～2h后，离心(16,000×g)10min，样品量较大时离心时间可延长至20min；沉淀用1.0ml冰70％乙醇洗涤两次后溶解于TE缓冲液(500～1,000μl)中，得到粗提的DNA溶液，提取过程使用的溶液和仪器为恒温振荡器旋涡混合仪冷冻离心机磷酸盐缓冲液0.12M，pH8.0(NaH2PO4配制成0.12M，用1.0M NaOH溶液将pH调至8.0)溶菌酶溶液 0.15M NaCl，0.1M Na2EDTA，10mg/ml溶菌酶，pH8.0裂解缓冲液 10％SDS(w/v)，0.1M NaCl，0.5M Tris-HCl，pH8.0磷酸盐缓冲液0.1M，pH8.0(NaH2PO4配制成0.1M，用1.0M NaOH溶液将pH调至8.0)氯仿—异戊醇溶液24∶1(v/v)TE缓冲液10mM Tris·Cl，pH8.0，1mMEDTA冰70％乙醇(v/v)；本发明采用溶菌酶、SDS以及高速旋涡振荡的方法，利用生物、化学以及物理相结合的原理，尽可能地将堆肥中的微生物细胞裂解，从而使细胞内的核酸物质释放出来，实现了DNA产量的最大化，而且为了使溶菌酶的作用更好地发挥，又将溶菌酶溶液与堆肥样品在37℃下振荡温浴1～2h，这样既保证了其处于酶催化的最适温度，又可以与样品充分接触；加入的氯仿—异戊醇溶液能够抽提掉大部分细胞裂解产生的蛋白质和糖类物质；粗提的DNA用0.5～0.6×体积聚乙二醇(PEG8000)和0.1×体积NaCl溶液在4℃沉淀2h以上，如果时间充裕，可以将其保存过夜；然后将0.7ml粗提DNA溶液加入DNA特异离心吸附柱离心(4℃，12,000×g，1min)，使DNA特异吸附于柱上，弃去收集管废液；重复上述操作至粗提DNA溶液全部离心完毕；离心吸附柱上的DNA经0.7ml冰70％乙醇洗涤两次后，使用含核糖核酸酶A(RNaseA)的TE缓冲液(100～500μl，根据堆肥样品量具体确定)将DNA洗脱下来，得到纯化的DNA溶液，纯化过程使用的溶液和仪器材料为恒温箱冷冻离心机PEG8000 50％(w/v)NaCl溶液 5MDNA特异离心吸附柱 型号CB2(北京天为时代科技有限公司)TE缓冲液 10mM Tris·Cl，pH8.0，1mM EDTA，0.5mg/ml RNaseA冰70％乙醇(v/v)。
本发明在DNA纯化中加入的PEG8000是一种对腐殖酸类物质具有良好的去除效果的物质，而随后使用的特异离心吸附柱，则能特异性地将DNA吸附在离心柱上，当用70％乙醇洗涤时不能将DNA洗脱，因此不能很好地去除与DNA混杂在一起的其他有机物质，本发明即在溶解吸附柱上的DNA的TE缓冲液中还加入了RNaseA，能够去除DNA中的核糖核酸(RNA)。
本发明针对堆肥的特点，使用了对不同对象有特定作用的处理方法，从而获得了片段长度比较单一的23kb的DNA；经过纯化以后，DNA的产量达到了53±1.5μgDNA/g堆肥，而腐殖酸类物质的产量仅为1.5±0.2μg/g堆肥，使用细菌16S rDNA通用扩增引物从纯化后的DNA中成功地扩增出了特异性很高的长度约为1.5kb的PCR扩增产物。
具体实施例方式1、堆肥取样堆肥取自一个20L的实验室规模的堆肥装置，堆肥材料主要为10kg菜市场剩余，并添加了5kg菜园土壤，采样点为堆肥表面以下3cm，一共取三个样品(设为1，2，3)，每个样品1g，取样时间为堆肥处理16d后，温度为22℃(已达到了最高温度46℃)，pH为6.8，含水率为43.4±0.5％，有机质含量为1.62±0.3％。其中，pH用玻璃电极法测定，含水率在105℃下重复烘烤至恒重测定，有机质含量根据重铬酸钾法测定。
2、样品的洗涤每1g样品加入到4ml 0.12M的磷酸盐缓冲液(pH8.0)中并与溶液混匀，然后室温下在振荡器上150rpm匀速震荡15min，然后以6,000×g离心10min；沉淀再次洗涤后用于后续处理。
3、DNA的提取洗涤过的堆肥样品1g与1.5ml的溶菌酶溶液混匀，然后在37℃恒温振荡器上以225rpm振荡1h；然后加入0.5ml裂解缓冲液，0.5ml磷酸盐缓冲液，0.5ml氯仿-异戊醇；将装有样品的离心管置于漩涡混合器上以2,800rpm振荡10min；裂解液以6,000×g离心3min，上清转入新离心管；原管加入0.5ml去离子水重新离心5～10s；两次离心的上清混合，12,000×g离心5min，收集水相留用；加0.6×异丙醇沉淀1h，然后16,000×g离心10min；沉淀以冰预冷的70％乙醇洗涤两次后风干，加入600μl TE缓冲液将DNA溶解。
其中，溶菌酶溶液0.15M NaCl，0.1M Na2EDTA，10mg/ml溶菌酶，pH8.0；裂解缓冲液10％SDS、0.1M NaCl、0.5M Tris-HCl，pH8.0；磷酸盐缓冲液0.1M，pH8.0；氯仿-异戊醇体积比为24∶1；TE缓冲液10mM Tris·Cl，pH8.0，1mM EDTA。
4、DNA的纯化在粗提DNA溶液中加入0.5×体积的PEG8000溶液和0.1×体积NaCl溶液，轻微颠倒将液体混合，在4℃恒温箱中保存2h；使用北京天为时代科技有限公司的CB2离心吸附柱将混合液离心，每次在吸附柱中加入0.7ml混合液，冷冻离心机中4℃下12,000×g离心1min，弃去收集管中液体，重复多次直至粗提DNA溶液全部离心完毕；然后吸附柱以冰预冷的70％乙醇0.7ml洗涤，在4℃下12,000×g离心1min；弃去收集管中废液，70％乙醇重复洗涤；吸附柱自然风干后，更换新收集管，用200μl加入了核糖核酸酶A(RNaseA)的TE缓冲液将吸附柱上的DNA洗脱至收集管，37℃恒温消化2h后于4℃保存备用。
其中，PEG8000溶液50％(质量体积百分数)；NaCl溶液5M；含RNaseA的TE缓冲液10mM Tris·CL，pH8.0，1mM EDTA，0.5mg/ml RNaseA。
5、纯化的DNA片段大小的琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段大小的检测按照常规的琼脂糖凝胶电泳进行，所用琼脂糖凝胶浓度为1％(质量体积百分数)，所用的DNA分子量标记(Marker)为北京天为时代科技有限公司的λDNA/HindIII，所用电泳缓冲液为1×TAE电泳缓冲液，以10V/cm的电压降在水平电泳槽上电泳，电泳结束后凝胶使用溴化乙锭(EB)染色液染色10min，然后在美国BIoRad公司的Gel Doc2000凝胶成像系统上拍照检测，结果见图1，从图1可以看出，纯化后的DNA条带单一，没有拖尾现象，DNA片段长度约为23kb。
其中，1×TAE电泳缓冲液40mM Tris碱，20mM乙酸，2mM EDTA；1％琼脂糖凝胶1g琼脂糖，加入100ml 1×TAE电泳缓冲液加热溶解，然后冷却；EB染色液10μg/ml 1×TAE电泳缓冲液。
6、DNA和腐殖酸类物质浓度的测定DNA浓度使用美国Beckman公司生产的DU640核酸和蛋白质分析仪进行测定，实验步骤根据仪器操作手册进行，仪器根据测量结果自动给出所检测DNA溶液的浓度，根据稀释倍数计算得到原始DNA浓度，从而根据DNA溶液浓度和体积计算得到纯化后的DNA产量为53±1.5μgDNA/g堆肥。
腐殖酸的吸收波长为340nm，使用一系列浓度(0.1-100ng/μl)的腐殖酸混合物(Aldrich Chemical，USA)作为标准曲线，通过加入10ng/μl DNA(Molecular Probes，USA)和2μg/μl牛血清白蛋白(Amresco，USA)以检查DNA和蛋白质对腐殖酸浓度测定的影响，使用紫外下分光光度计在340nm波长处测定各个样品的吸光度。根据测量结果计算得出腐殖酸类物质的产量为1.5±0.2μg/g堆肥。
7、16S rDNA的PCR扩增及产物检测选择细菌16S rDNA扩增通用引物对27F(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和1495R(5′-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3′)作为PCR扩增的引物，该引物对分别对应于大肠杆菌(E.coli)16S rDNA的8-27位碱基和1495-1514位碱基，从而可以扩增出近乎全长的16S rDNA序列，约为1507bp。
50μl的PCR扩增体系为1μl已纯化DNA，5μl dNTP混合溶液(终浓度为1pmol/μl)，引物各1μl，10×Buffer 5μl，Taq DNA聚合酶(Promege，USA)0.5μl，加无菌去离子水补足50μl。扩增条件为94℃预变性5min，接下来是94℃30s，50℃30s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min，停止于4℃。
PCR扩增产物的检测同样使用1％琼脂糖凝胶电泳，除所用的DNA分子量标记为北京天为时代科技有限公司的Marker V外，其余与第5点方法相同，结果见图2，从图2可以看出，使用细菌通用引物对(27F和1495R)进行PCR扩增，得到了长度为1,500bp的PCR产物，条带单一，表明扩增的特异性很好，本方法提取、纯化的DNA可以用于分子生态学研究。
从上述测定结果可以清楚地看出，本方法不仅可以得到较高产量的长片段DNA，而且其中的腐殖酸类物质含量极低，纯化的DNA用于16S rDNA的PCR扩增，得到了特异性良好的产物，此外，本方法不需要额外的仪器设备，因此本方法可以成为堆肥微生物分子生态学研究中的一种方便、高质、高量、低成本的堆肥微生物总DNA提取与纯化技术。
权利要求
1.一种堆肥中微生物总DNA的提取与纯化方法，包括DNA的提取与纯化，本发明的特征在于(1)样品的洗涤待提取DNA的样品用0.12M磷酸盐缓冲液，以4～6ml/g堆肥的用量在25～35℃温度条件下，以150rpm速率匀速震荡15～30min，然后以6000×g离心10min，沉淀再次洗涤；(2)DNA的提取样品洗涤后，用1.2～1.5ml/g堆肥的溶菌酶溶液在37℃恒温条件下，以200～250rpm振荡温浴1～2h，然后均以0.5～0.8ml/g堆肥的用量加入裂解缓冲液、磷酸盐缓冲液和氯仿—异戊醇溶液，并以2500～3000rpm速率旋涡振荡10～15min，经0.6倍体积的异丙醇沉淀1～2h后，以16000×g速度离心10～20min，沉淀用0.8～1.5ml的冰70％乙醇洗涤两次后溶解于500～1000μl的TE缓冲液中，得到粗提的DNA溶液；(3)DNA的纯化粗提的DNA溶液用0.5～0.6倍体积的聚乙二醇和0.1倍体积的NaCl溶液在4℃温度条件下沉淀2～24小时，然后取0.7ml粗提DNA溶液加入至DNA特异离心吸附柱内，在4℃，12000×g离心1min，DNA吸附于柱上，弃去收集管废液，重复上述操作直至粗提DNA溶液全部离心完毕，吸附柱上的DNA经0.7ml冰70％乙醇洗涤两次，再用含RNaseA的TE缓冲液100～500μl洗脱DNA，得到纯化的DNA溶液。
全文摘要
本发明涉及堆肥中微生物总DNA的提取和纯化。本发明用磷酸盐缓冲液洗涤样品，用溶菌酶溶液和SDS溶液裂解堆肥微生物细胞，粗提的DNA经异丙醇离心沉淀和70％冰乙醇洗涤，用聚乙二醇和DNA特异离心吸附柱纯化粗提的DNA。经琼脂糖凝胶电泳检测表明，提取的DNA片段长度约为23kb；纯化后的DNA经紫外分光光度计检测，腐殖酸类的产量为1.5μg/g堆肥，去除了大部分的腐殖酸类物质；用核酸蛋白质分析仪对纯化的DNA进行检测，DNA的产量为53μg/g堆肥。本发明堆肥微生物总DNA的提取与纯化，能去除DNA中的腐殖酸类物质的干扰，得到的高质量DNA可直接用于PCR扩增及其他分子生物学分析，从而建立一套可用于城市生活垃圾堆肥微生物分子生态学研究的快速、高质、高量的DNA提取与纯化技术。
文档编号C07H1/00GK1733791SQ20051003211
公开日2006年2月15日 申请日期2005年9月6日 优先权日2005年9月6日
发明者肖勇, 杨朝晖, 曾光明, 陈耀宁, 陶然 申请人:湖南大学