专利名称：黄芩根指纹特征组分提取物及其提取工艺和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的黄芩根指纹特征组分提取物及其提取工艺和应用。
背景技术：
黄芩(Scutellaria Baicalensis Georgi)为常用中药之一，我国药典收载的黄芩为唇形科植物黄芩的根，具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等功效，用于湿温；暑温；胸闷；湿热痞满；泻痢；黄疸；肺热；咳嗽；高热烦渴；血热吐衄；痈肿疮毒；胎动不安。其主要有效成分为黄酮类化合物，包括黄芩甙；野黄芩甙；去甲汉黄芩素-7-O-葡萄糖苷酸；千层纸素-7-O-葡萄糖苷酸；汉黄芩素-7-O-葡萄糖苷酸；黄芩素；汉黄芩素；白杨黄素等，具体结构见表一。
表一、主要成分结构
Glucuronosyl葡萄糖苷酸基；Gluronosyl葡萄糖基。
现代药理研究证明黄芩具有明显的抗菌、消炎和抗病毒等作用，黄芩作为常用中药，临床中已被广泛应用。目前除利用其清热解毒作用抗菌消炎外，其扩张血管、抗氧化功能在心血管疾病治疗上有很大潜力；其抗病毒作用在治疗肝炎、艾滋病等相关疾病方面的前景广阔的。
国外对天然药物的认识是基于全面的化学成分及药理学基础之上，所含化学成分是对其质量评价的依据。美国FDA、英国草药典、印度草药典、德国药用植物学会、加拿大药用植物学会等均接受指纹图谱的质量控制方法，我国SFDA也已大力推广实施指纹图谱对中药产品的质量控制。组分中药是以明确的组分形成及指纹特征为特点的中药，本发明涉及的黄芩根指纹特征组分提取物，应用于药品的研究开发领域时，具有组分中药的特征，组分中药是中药指纹图谱的深入，力图阐明中药的物质基础。组分中药着眼于宏观规律性研究，建立客观、整体和多指标的综合评价体系，在阐明产品的活性成分的同时，阐明其中的其他成分，能够展示各类成分的全貌，是当前国际公认的、最有效的质量控制技术，能够对中药材、中成药(包括半成品及成品)质量的真伪优劣与稳定性做出全面的评价。为使我国具有自主知识产权的中药产品得到国际社会的认可与接受，必须全面提升中药标准化的水平，采用国际认可的质量控制方法，使之成为中药实现现代化的纽带。
以具有明确指纹特征的黄芩根组分提取物为药效物质基础是一项开创性的工作，摆脱了过去以单一成分或以投料收率为质量控制手段的局面，建立了表征手段，而且该黄芩根组分提取物的特征可以很好的实现。这种指纹特征明确的黄芩根组分提取物为物质基础进行相关产品的质量控制符合目前中药现代化的发展方向，具有一定先进性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成分稳定，含量明确的具有稳定指纹特征的黄芩根组分提取物。
本发明的另一目的是提供上述黄芩根指纹特征组分提取物的制备方法。
本发明的还一目的是提供上述黄芩根指纹特征组分提取物的应用。
本发明所提供的成分稳定，含量明确的黄芩根指纹特征组分提取物为以高效液相方法表征为黄芩甙含量范围70.0-80.0％，总次要黄酮含量范围12.0-19.0％；总次要黄酮各成分含量范围野黄芩甙0.5-2.5％；去甲汉黄芩素-7-O-葡萄糖苷酸0.5-2.5％；千层纸素-7-O-葡萄糖苷酸1.0-4.0％汉黄芩素-7-O-葡萄糖苷酸2.0-6.5％；黄芩素2.5-6.5％；汉黄芩素0.5-3.5％；白杨黄素0.1-0.5％，以重量计；上述总次要黄酮各成分含量同时选取最低值，或同时选取最高值时均不在本发明的范围内，即总次要黄酮各成分含量不能同时选取最低值或同时选取最高值。
本发明第一次明确地提供黄芩根指纹特征组分提取物，可以明确含量的混合物。而以往的黄芩提取物都是从原料着手，并不清楚其成分的含量，更谈不上较精确地表明该混合物而本发明所提供的黄芩根指纹特征组分提取物明显不同于以往的以原材料投料计算或以单一成分说明的黄芩药材或提取物，是一种新的可以准确表述其成分含量的黄芩提取物。且本发明组分提取物可以很好地制备出来，并可以用科学系统的表征手段进行质量控制。本发明所提供的黄芩根指纹特征组分提取物明显不同于以往的以原材料投料计算或以单一成分说明的黄芩药材或提取物，是一种新的黄芩根组分提取物。因而本发明的产物也可代表我国的中药产品能得到国际社会的认可与接受。本发明为中药产品实现中药现代化提供一种实现方式。
本发明的另一目的黄芩根指纹特征组分提取物的制备方法为(1)水提黄芩根原料粉碎成粗粉，投入于提取罐中，第一次加入3-6倍量水沸腾保温提取1-3小时。第二次加入2-4倍量水沸腾保温提取1-2小时，过滤或离心，收集提取液进行碱化处理；(2)碱化用20-40％NaOH或KOH溶液将上步收集的滤液的pH值调至pH7-9.5，静置0.5-2小时，经过滤或离心收集溶液；(3)酸化当溶液温度在40℃-50℃时，用浓盐酸或浓硫酸将溶液调至pH1-3，再加热到80-90℃保温20-50分钟，进行下步分离操作；(4)分离将上步中所得溶液过滤或离心，收集沉淀，用少量60-80℃热水冲洗沉淀到中性，干燥得干粉A；母液保留；所述的干粉A即为黄芩根指纹特征组分提取物。
所述(4)步中将母液进行回收将第4步中所保留的母液用20-40％NaOH或KOH溶液将pH值调至pH7，减压浓缩到原体积的1/6-1/3，当浓缩液温度在40℃-50℃时，用浓盐酸或浓硫酸将溶液调至pH1-3，再加热到80-90℃保温20-50分钟，静置，冷却到室温，经过滤或离心，收集沉淀，用少量水冲洗沉淀到中性，干燥得干粉B。干粉有B也可由母液不经浓缩，直接静置24-96小时，分离得到不溶物，收集不溶物，用少量水冲洗沉淀到中性，干燥而得；由干粉A、B调配得到干粉C，所述的干粉C即为黄芩根指纹特征组分提取物。
上述制备的黄芩根指纹特征组分提取物以及含有此指纹特征组分提取物的具有抗炎作用的化妆品、保健食品及药品在国内外未见公布，此组分提取物指纹特征见表二。
以高效液相方法进行表征，含量以重量计，该指纹特征见表二及附图(如图1、图2、图3、图4、图5、图6所示)。
表二黄芩根组分提取物指纹特征
含有上述黄芩根指纹特征组分提取物的产品可作为具有抗炎作用的化妆品、保健食品及药品。
本发明提取物可应用于各种剂型的药品，包括胶囊、片剂、口服液、针剂、丸剂等。
本发明所使用的原料为唇形科植物黄芩的根。
本发明根据产品的指纹特征对原料及生产过程实施控制，摆脱了以往依靠经验或单一成分来控制原料及生产过程的局面。本发明的黄芩组分提取物具有明确的特征，其使用和评价可建立在较好的量化基础上。本发明是与当前国际公认的、最有效的质量控制技术接轨，凭借指纹特征确认产品的真伪，判定质量的稳定与否。建立客观、整体和多指标的综合评价体系，在阐明产品的活性成分的同时，阐明其中的其他成分，能够展示各类成分的全貌，能够对产品质量的真伪优劣与稳定性做出全面的评价。为使我国具有自主知识产权的中药产品得到国际社会的认可与接受，全面提升中药标准化的水平，使之成为中药实现现代化的纽带，且产品具有抗炎的药理作用。
为了更好理解本发明实质，下面以更具体的实例说明。
试验本发明制备的黄芩根指纹特征组分提取物对炎症动物模型的抗炎作用。
1、实验材料动物小鼠，昆明种；大鼠，Wistar品系，均由湖南中医学院实验动物中心提供。
药物黄芩根指纹特征组分提取物，本发明工艺制备。
氢化可地松河南利华制药有限公司生产，批号031204。
以上使用的药物均室温保存，实验时以生理盐水配制成适当浓度药液使用。
2、方法与结果2.1对二甲苯致小鼠耳廓肿胀反应的影响。昆明种小鼠，雄性，26～30g，按体重分层，随机分为空白对照、氢化可地松、黄芩根指纹特征组分提取物大中小剂量5组，每组12只。各组小鼠按20ml/kg容积灌胃给药，间隔12h给药3次。末次给药后60min以二甲苯接触右耳5s，15min脱颈椎处死小鼠，用直径6mm的打孔器将双耳同部位等面积切下，称取左右耳片重量，计算耳廓肿胀率(％)和肿胀抑制率(％)。实验结果见表三。
表三 对二甲苯致小鼠耳廓急性炎症的抑制作用(x±s)
注1.黄芩根指纹特征组分提取物按纯品计算，下同；2.组间比较t检验，与空白对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，下同。
2.2对蛋清致大鼠足跖肿胀反应的影响。Wistar大鼠，180～220g，雌雄各半，按体重分层，随机分为空白对照、氢化可地松、黄芩根指纹特征组分提取物大中小剂量5组，每组12只。各组大鼠按10ml/kg容积灌胃给药，分别给予生理盐水、氢化可地松20mg/kg、黄芩根指纹特征组分提取物40、80、160mg/kg，间隔12h给药3次。末次给药后30min，以新鲜蛋清0.1ml注射于大鼠左后足跖皮下致炎。容积法测定大鼠致炎足外踝突出处平面以下部位致炎前和致炎后0.5、1.0、2.0、4.0和6.0h的容积，计算大鼠足跖肿胀值。实验结果见表四。
表四对蛋清致大鼠足跖肿胀值的影响(x±s)
2.3对大鼠棉球肉芽肿形成的影响。Wistar大鼠，雄性，135～165g，按体重分层，随机分为空白对照、氢化可地松、黄芩根指纹特征组分提取物大中小剂量5组，每组12只。各组大鼠以3％戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉，剪毛后无菌条件下切开下腹部正中皮肤，切口长1cm，向双侧腹股沟皮下植入10mg无菌干燥棉球，缝合切口，术后当日按10ml/kg容积灌胃给予受试药物，每日1次，连续7日；术后8日戊巴比妥钠麻醉大鼠，手术取出棉球，剔尽脂肪组织，60℃烘干称重术后棉球，减原棉球重量，以mg/100g表示肉芽肿重，计算炎症抑制率(％)。实验结果见表五。
表五对火鼠棉球肉芽肿形成的抑制作用(x±s)
2.4对组胺致大鼠皮肤毛细血管通透性增高反应的影响。Wistar大鼠，雌雄各半，180～220g，按体重分层，随机分为空白对照、氢化可地松、黄芩根指纹特征组分提取物大中小剂量5组，每组12只。各组大鼠按10ml/kg容积灌胃给药，间隔12h给药3次。末次给药后60min，各鼠背部皮内注射0.01％组胺生理盐水溶液0.1ml，立即尾静脉注射1％伊文思蓝生理盐水溶液0.4ml/100g，30min后脱颈椎处死大鼠，直径1.5cm打孔器切下背部蓝染皮片，剪碎后置7∶3丙酮生理盐水溶液5ml，45℃浸泡96h直至皮肤蓝色完全消失，1500rpm离心15min，取上清液测定A620nm值，计算渗出抑制率(％)。实验结果见表六。
表六对组胺致大鼠皮肤毛细血管通透性增高的抑制作用(x±s)
3、结果与结论实验结果表明，黄芩根指纹特征组分提取物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀、蛋清致大鼠足跖肿胀、大鼠棉球肉芽肿的形成以及组胺致大鼠皮肤毛细血管通透性增高均有较明显的抑制作用，可抑制炎症的急性期病变和炎症后期结缔组织生成。
图1为本发明实施例1的黄芩根指纹特征组分提取物的指纹特征色谱图。
图2为本发明实施例2的黄芩根指纹特征组分提取物的指纹特征色谱图。
图3为本发明实施例3的黄芩根指纹特征组分提取物的指纹特征色谱图。
图4为本发明实施例4的黄芩根指纹特征组分提取物的指纹特征色谱图。
图5为本发明实施例5的黄芩根指纹特征组分提取物的指纹特征色谱图。
图6为本发明实施例6的黄芩根指纹特征组分提取物的指纹特征色谱图。
具体实施例方式
实施例1(1)黄芩根原料粉碎成粗粉，投入于提取罐中，第一次加入3倍量水沸腾保温提取1小时。第二次加入3倍量水沸腾保温提取1小时，过滤。
(2)将滤液置入沉淀罐中，用40％NaOH溶液将pH值调至pH7，静置0.5小时，离心得离心液。
(3)当离心液温度在40℃时，用浓盐酸将离心液pH值调至pH2，再加热到80℃保温20分钟，过滤得沉淀。
(4)将沉淀用60℃热水洗至中性，真空干燥，粉碎，过筛得干粉A1，所述A1即为黄芩根指纹特征组分提取物。
(5)指纹特征表征方式采用HPLC(高效液相色谱法)，在一定分离条件下，以外标法或者以黄芩甙为标准品计算各次要黄酮的相关因子，对各峰进行定量；黄芩甙以黄芩甙标准品直接进行定量。
(6)所得组分提取物A1指纹特征见表八及图1表八、黄芩根组分提取物A1指纹特征
实施例2(1)黄芩根原料粉碎成粗粉，投入于提取罐中，第一次加入3倍量水沸腾保温提取1小时。第二次加入3倍量水沸腾保温提取1小时，过滤。
(2)将滤液置入沉淀罐中，用40％NaOH溶液将pH值调至pH7，静置0.5小时，离心得离心液。
(3)当离心液温度在40℃时，用浓盐酸将离心液pH值调至pH2，再加热到80℃保温20分钟，过滤得沉淀，滤液保留。
(4)将沉淀用60℃热水洗至中性，真空干燥得干粉A2。
(5)将第(3)步中所保留的母液用40％NaOH溶液将pH值调至pH7，减压浓缩到原体积的1/6，当浓缩液温度在40℃时，用浓盐酸将浓缩液调至pH2，再加热到80℃保温30分钟，静置，冷却到室温，过滤，收集沉淀，用少量水冲洗沉淀到中性，干燥得干粉B1。
(6)根据表二的指纹特征对所得干粉A2和干粉B1进行调配得到符合特征的组分提取物C1，所述C1即为黄芩根指纹特征组分提取物，如表九及图2。
表九、黄芩根组分提取物C1指纹特征
实施例3(1)黄芩根原料粉碎成粗粉，投入于提取罐中，第一次加入4倍量水沸腾保温提取1小时。第二次加入2倍量水沸腾保温提取1小时，离心。
(2)将滤液置入沉淀罐中，用30％KOH溶液将pH值调至pH7，静置0.5小时，离心得离心液。
(3)当离心液温度在45℃时，用浓硫酸将离心液pH值调至pH1.5，再加热到80℃保温20分钟，过滤得沉淀，滤液保留。
(4)将沉淀用60℃热水洗至中性，真空干燥得干粉A3，所述A3即为黄芩根指纹特征组分提取物。
(5)所得组分提取物A3的特征如表十及图3。
表十、黄芩根组分提取物A3指纹特征
实施例4(1)黄芩根原料粉碎成粗粉，投入于提取罐中，第一次加入4倍量水沸腾保温提取1小时。第二次加入2倍量水沸腾保温提取1小时，过滤。
(2)将滤液置入沉淀罐中，用40％NaOH溶液将pH值调至pH7，静置0.5小时，离心得离心液。
(3)当离心液温度在45℃时，用浓硫酸将离心液pH值调至pH1.5，再加热到80℃保温20分钟，过滤得沉淀，滤液保留。
(4)将沉淀用60℃热水洗至中性，真空干燥得干粉A4。
(5)将第3步中所保留的母液用40％NaOH溶液将pH值调至pH7，减压浓缩到原体积的1/6，当浓缩液温度在45℃时，用浓硫酸将浓缩液调至pH2，再加热到80℃保温20分钟，静置，冷却到室温，过滤，收集沉淀，用少量水冲洗沉淀到中性，干燥得干粉B2。
(6)根据表二的指纹特征对所得干粉A4和干粉B2进行调配得到符合特征的组分提取物C2，所述C2即为黄芩根指纹特征组分提取物，如表十一及图4。
表十一、黄芩根组分提取物C2指纹特征
实施例5(1)黄芩根原料粉碎成粗粉，投入于提取罐中，第一次加入4倍量水沸腾保温提取1小时。第二次加入3倍量水沸腾保温提取1小时，离心。
(2)将滤液置入沉淀罐中，用40％KOH溶液将pH值调至pH7，静置0.5小时，离心得离心液。
(3)当离心液温度在45℃时，用浓硫酸将离心液pH值调至pH2，再加热到80℃保温30分钟，过滤得沉淀，滤液保留。
(4)将沉淀用60℃热水洗至中性，真空干燥得干粉A5。
(5)所得组分提取物A5的特征如表十及图5。
表十二、黄芩根组分提取物A5指纹特征
实施例6(1)黄芩根原料粉碎成粗粉，投入于提取罐中，第一次加入4倍量水沸腾保温提取1小时。第二次加入3倍量水沸腾保温提取1小时，过滤。
(2)将滤液置入沉淀罐中，用40％NaOH溶液将pH值调至pH7，静置0.5小时，离心得离心液。
(3)当离心液温度在45℃时，用浓硫酸将离心液pH值调至pH1.5，再加热到80℃保温50分钟，过滤得沉淀，滤液保留。
(4)将沉淀用60℃热水洗至中性，真空干燥得干粉A6。
(5)将第3步中所保留的母液用40％KOH溶液将pH值调至pH7，减压浓缩到原体积的1/5，当浓缩液温度在45℃时，用浓硫酸将浓缩液调至pH2，再加热到80℃保温50分钟，静置，冷却到室温，过滤，收集沉淀，用少量水冲洗沉淀到中性，干燥得干粉B3。
(6)根据表二的指纹特征对所得千粉A6和干粉B3进行调配得到符合特征的组分提取物C3，特征如表十三及图6。
表十三、黄芩根组分提取物C3指纹特征
实施例7取本发明黄芩根指纹特征组分提取物100g，与50g糊精及20g混合，用85％乙醇制软材，用16目尼龙筛网制粒，55-60℃真空干燥，20目筛整粒，选用2号胶囊壳，用全自动胶囊填充机或手工填充成1000粒，抛光即得。每粒含组合物100mg。本品具有抗炎活性，成人口服每日2-3次，每次1-2粒。
实施例8取本发明黄芩根指纹特征组分提取物1份、茶多酚3份、糖粉10份、糊精2份，以重量计，过80目筛，混合均匀，加入8％淀粉浆制成软材，用12目尼龙筛网制粒，55-60℃真空干燥，14目筛整粒，分装即得，每包重6g。此颗粒剂具有抗炎活性，成人口服每日2-3次，每次1包。
实施例9配方本发明黄芩根指纹特征组分提取物0.2份，硬脂酸15.0份，单硬脂酸甘油脂1.0份，白油1.0份，十六醇1.0份，丙二醇10.0份，氢氧化钾0.6份，氢氧化钠0.05份，以重量计，香精、防腐剂适量，加水到总重为100份。
配制按配方中的量分别称量黄芩根指纹特征组分提取物、硬脂酸、单硬脂酸甘油脂、白油、十六醇和丙二醇，将称量好的原料加入250ml烧杯中，水和碱称重后加入另一250ml烧杯中。分别加热至90℃，使物料熔化、溶解均匀。装水的烧杯在90℃下保持20min灭菌。然后在搅拌下将水慢慢加入到油脂中，继续搅拌，当温度降至50℃时，加入防腐剂。降温至40℃后，加入香精，搅拌均匀。静置、冷却至室温。调整膏体的pH，使其在要求的范围内。此雪花膏具有一定抗炎活性。
权利要求
1.黄芩根指纹特征组分提取物，其特征在于以高效液相方法表征，黄芩根组分提取物的指纹特征为黄芩甙含量范围70.0-80.0％，总次要黄酮含量范围12.0-19.0％；另外，总次要黄酮各成分含量范围野黄芩甙0.5-2.0％；去甲汉黄芩素-7-O-葡萄糖苷酸0.5-2.5％；千层纸素-7-O-葡萄糖苷酸1.0-4.0％；汉黄芩素-7-O-葡萄糖苷酸2.0-6.5％；黄芩素2.5-6.5％；汉黄芩素0.5-3.5％；白杨黄素0.1-0.5％，总次要黄酮各成分含量不能同时选取最低值或同时选取最高值；以重量计。
2.制备权利要求1中所述的黄芩根指纹特征组分提取物的生产工艺，其特征在于(1)水提黄芩根原料粉碎成粗粉，投入于提取罐中，第一次加入3-6倍量水沸腾保温提取1-3小时。第二次加入2-4倍量水沸腾保温提取1-2小时，过滤或离心，收集提取液进行碱化处理；(2)碱化用20-40％NaOH或KOH溶液将上步收集的滤液的pH值调至pH7-9.5，静置0.5-2小时，经过滤或离心收集溶液；(3)酸化当溶液温度在40℃-50℃时，用浓盐酸或浓硫酸将溶液调至pH1-3，再加热到80-90℃保温20-50分钟，进行下步分离操作；(4)分离将上步中所得溶液过滤或离心，收集沉淀，用少量60-80℃热水冲洗沉淀到中性，干燥得干粉A，母液保留；所述的干粉A即为黄芩根指纹特征组分提取物。
3.根据权利要求2所述的黄芩根指纹特征组分提取物的生产工艺，其特征在于所述(4)步中将母液进行回收将第4步中所保留的母液用20-40％NaOH或KOH溶液将pH值调至pH7，减压浓缩到原体积的1/6-1/3，当浓缩液温度在40℃-50℃以上时，用浓盐酸或浓硫酸将溶液调至pH1-3，再加热到80-90℃保温20-50分钟，静置，冷却到室温，经过滤或离心，收集沉淀，用少量水冲洗沉淀到中性，干燥得干粉B；干粉有B也可由母液不经浓缩，直接静置24-96小时，分离得到不溶物，收集不溶物，用少量水冲洗沉淀到中性，干燥而得；由于粉A、B调配得到干粉C，所述的干粉C亦为黄芩根指纹特征组分提取物。
4.权利要求1所述黄芩根指纹特征组分提取物的应用，其特征在于应用于与抗炎有关的化妆品、保健食品及药品。
5.根据权利要求4所述黄芩根指纹特征组分提取物的应用，其特征在于应用于各种剂型的药品，包括胶囊、片剂、口服液、针剂、丸剂。
全文摘要
黄芩根指纹特征组分提取物及其提取工艺和应用，黄芩根指纹特征组分提取物的含量范围为黄芩甙含量范围70.0－80.0％，总次要黄酮含量范围12.0－19.0％；次要黄酮各成分含量范围野黄芩甙0.5－2.0％；去甲汉黄芩素－7－O－葡萄糖苷酸0.5－2.5％；千层纸素－7－O－葡萄糖苷酸1.0－4.0％；汉黄芩素－7－O－葡萄糖苷酸2.0－6.5％；黄芩素2.5－5.5％；汉黄芩素0.5－3.5％；白杨黄素0.1－0.5％。具有该指纹特征的黄芩根组分提取物具有明确的抗炎活性。本发明涉及含有该指纹特征组分提取物的化妆品、保健食品及药品在抗炎方向的应用。
文档编号C07H17/00GK1687098SQ20051003145
公开日2005年10月26日 申请日期2005年4月15日 优先权日2005年4月15日
发明者曾建国 申请人:长沙世唯科技有限公司