专利名称：一种从微生物发酵液中纯化普伐他汀前体美伐他汀的方法
技术领域：
本发明涉及一种从微生物发酵液中纯化普伐他汀前体美伐他汀的方法，可用于降血脂药物中的研究和生产，属于心血管药物技术领域。
背景技术：
心血管疾病已是人类死亡的主要原因之一，其发病率与死亡率均高居所有疾病前列。在上世纪中叶工业化国家出现了心血管疾病大流行，心血管疾病死亡人数占了总死亡人数的一半。从绝对数看，我国是心血管疾病的大国。而且随着人民生活水平的不断提高，生活方式与饮食习惯的改变，使各种心血管疾病的发生率正趋于上升。经研究证实心血管疾病的主要病理基础为动脉粥样硬化，高血脂症是导致动脉粥样硬化的首要因素，因此降脂药在减少心血管疾病发病率方面的重要性已引起人们的关注。
在众多类型的降血脂药物中，上世纪八十年代初发展起来的一类羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，即他汀类药物，由于它们降低胆固醇的高效性，抑制胆固醇合成的高度选择性以及低毒性，已成为心血管药物研制中最活跃，发展最迅速的领域。其中普伐他汀钠(pravastatin sodium)是近年发展起来的一种新型他汀类降血脂药物，由于其高效低毒性，疗效显著，耐受性好等优点，被公认为该类药物中最有发展前途的一种。
普伐他汀是由其前体美伐他汀(compactin)经转化菌羟基化得到，美伐他汀由微生物发酵产生，其结构式为 C23H36O6美伐他汀的质量直接影响转化菌的转化效率和普伐他汀的纯度，同时它也是普伐他汀的主要生产成本来源。因此制备低成本、高质量的美伐他汀对提高普伐他汀的得率和纯度，降低生产成本具有重要意义。目前美伐他汀的制备方法大多采用有机溶剂萃取发酵液，高温下回流浓缩使美伐他汀闭环，然后低温下结晶纯化。这种方法制备的美伐他汀闭环对许多普伐他汀转化菌有毒性，无法直接添加，而且生产能耗大，成本高，不利于普伐他汀的大规模生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产能耗小、成本低、得率高、最终生产可直接用普伐他汀的从微生物发酵液中纯化普伐他汀前体美伐他汀的方法。
为实现以上目的，本发明的技术方案是提供一种从微生物发酵液中纯化普伐他汀前体美伐他汀的方法，其特点在于含有美伐他汀的发酵液经过滤后，用水解酶处理，然后真空浓缩，再在酸性条件下将美伐他汀萃取到疏水性有机溶剂中，有机溶剂用弱酸性缓冲液洗涤后，真空浓缩至美伐他汀浓度大于300g/L，加入亲水性有机溶剂混合均匀，最后加入铵盐或氨水，使美伐他汀转换为铵盐形式结晶析出。
它包括以下步骤(1).含有美伐他汀的发酵液经过滤后，用酸调节pH值为4-10；(2).在发酵液中加入水解酶，水解酶终浓度为0.1％～10％，调节pH值为6～10，在40～60℃下保温10～20小时；(3).酶降解液在0.08Mpa、50～90℃下减压浓缩，冷却到低于30℃；(4).浓缩液调节pH值为3～5，加入疏水性有机溶剂，充分搅拌混合10～20分钟，有机溶剂与浓缩液的体积比为1∶2；(5).高速离心分离有机相和水相，水相可以加入有机溶剂再萃取1～4次，弃水相，合并有机相；(6).有机相加入含有10～20％NaCl的微酸性缓冲液洗涤，有机相和缓冲液的体积比为2∶1，缓冲液pH值为5～7，高速离心分离水相和有机相，弃水相，重复洗涤有机相1～2次；(7).有机相加入无水Na2SO4，搅拌10～20分钟，然后过滤，在0.08MPa，30～90℃下真空浓缩至美伐他汀含量为250～350g/L；(8).浓缩液冷却到低于30℃，加入亲水性有机溶剂，有机溶剂终浓度50～95％，边搅拌边加入铵盐或氨水，使美伐他汀以铵盐形式结晶析出；(9).过滤收集美伐他汀铵盐晶体，用亲水性有机溶剂洗涤晶体，在40-60℃下真空干燥，HPLC检测美伐他汀纯度大于94％，得率大于80％；(10).美伐他汀铵盐可进一步通过重结晶提高纯度，最终得到的美伐他汀铵盐纯度大于98％。
本发明所述的微生物可以是Penicillium sp.，Penicilliumbrevicompactin，Penicilmyces.sp.，Trichoderma longibraiatum，Hyphomyceschrisopomus，penicillium citrium其中之一或它们的混合物；所述的水解酶可以是枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶其中之一或它们的混合物；所述的疏水性有机溶剂可以是乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸丙酯、富马酸乙酯、丁甲酮、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、甲苯其中之一或它们的混合物；所述的微酸性缓冲液可以是KH2PO4、NaH2PO4其中之一或它们的混合物；所述的亲水性有机溶剂可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异戊醇、辛醇、丙酮其中之一或它们的混合物；所述的铵盐或氨水，铵盐可以是NH4CL、(NH4)2SO4、NH4Ac，NH4NO3其中之一或它们的混合物。
本发明的优点是美伐他汀以铵盐形式在常温下结晶纯化，生产能耗小，成本低，得率高，纯化得到的高纯度的美伐他汀铵盐，纯度不低于98％，对普伐他汀转化菌无毒性，可直接用于普伐他汀生产。
具体实施例方式下面对本发明提出的一种从微生物发酵液中纯化普伐他汀前体美伐的方法的实施例作进一步详细描述。
实施例1(1).5L发酵滤液，含有美伐他汀10g，用6N HCl调节pH值为8.0；(2).加入20ml枯草杆菌蛋白酶溶液，55℃保温，搅拌12小时；(3).将酶降解液在80℃、0.08MPa下真空浓缩至50ml，冷却到低于30℃；(4).浓缩液用6N HCl调节pH值为4.0，加入25ml乙酸乙酯，充分搅拌混合15分钟；(5).高速离心分离水相和有机相，水相用25ml乙酸乙酯再萃取两次，弃水相，合并有机相；(6).有机相用40ml含15％NaCl的1％KH2PO4缓冲液，pH值为6.5，洗涤两遍，高速离心分离水相和有机相，弃水相；(7).有机相加入0.2g无水Na2SO4，搅拌15分钟，过滤，滤液在0.08Mpa、50℃下真空浓缩至3ml；(8).浓缩液冷却到低于30℃，加入12ml无水丙酮，终浓度为80％，边搅拌边加人0.5ml 5N NH4Cl溶液，使美伐他汀铵盐结晶析出；(9).过滤收集美伐他汀铵盐晶体，用无水丙酮洗涤晶体，在50℃下真空干燥，共得到美伐他汀铵盐晶体8.8g，HPLC检测纯度为93.5％；(10).美伐他汀铵盐晶体进一步重结晶，得到美伐他汀铵盐晶体8.3g，HPLC检测纯度为98.5％。
实施例2(1).60L发酵滤液，含有美伐他汀175g，用6N HCl调节pH值为8.0；(2).加入200ml胰蛋白酶溶液，55℃保温，搅拌15小时；(3).酶降解液在0.08MPa、80℃真空浓缩至5L，冷却到低于30℃；(4).浓缩液用6N HCL调节pH值为4.0，加入25L乙酸丁酯，充分搅拌混合15分钟；(5).高速离心分离水相和有机相，水相用25L乙酸丁酯重复萃取两次，弃水相，合并有机相；(6).有机相用40L含有15％NaCl的1％KH2PO4缓冲液，pH值为6.5，洗涤两遍，离心分离水相和有机相，弃水相；
(7).有机相加入1g无水Na2SO4，搅拌15分钟，过滤，滤液在0.08Mpa、50℃下真空浓缩至550ml；(8).有机相冷却到低于30℃，加入2200ml无水乙醇，终浓度为80％，边搅拌边加入20ml 2N NH4Ac溶液，使美伐他汀铵盐结晶析出；(9).过滤收集美伐他汀铵盐晶体，用无水乙醇洗涤晶体，在50℃下真空干燥，共得到美伐他汀铵盐晶体150g，HPLC检测纯度为94.2％；(10).美伐他汀铵盐晶体进一步重结晶，得到美伐他汀铵盐晶体143g，HPLC检测纯度为98.5％。
权利要求
1.一种从微生物发酵液中纯化普伐他汀前体美伐他汀的方法，其特征在于，含有美伐他汀的发酵液经过滤后，用水解酶处理，然后真空浓缩，再在酸性条件下将美伐他汀萃取到疏水性有机溶剂中，有机溶剂用弱酸性缓冲液洗涤后，真空浓缩至美伐他汀浓度大于300g/L，加入亲水性有机溶剂混合均匀，最后加入铵盐或氨水，使美伐他汀转换为铵盐形式结晶析出。它包括以下步骤(1).含有美伐他汀的发酵液经过滤后，用酸调节pH值为4-10；(2).在发酵液中加入水解酶，水解酶终浓度为0.1％～10％，调节pH值为6～10，在40～60℃下保温10～20小时；(3).酶降解液在0.08Mpa、50～90℃下减压浓缩，冷却到低于30℃；(4).浓缩液调节pH值为3～5，加入疏水性有机溶剂，充分搅拌混合10～20分钟，有机溶剂与浓缩液的体积比为1∶2；(5).高速离心分离有机相和水相，水相可以加入有机溶剂再萃取1～4次，弃水相，合并有机相；(6).有机相加入含有10～20％NaCl的微酸性缓冲液洗涤，有机相和缓冲液的体积比为2∶1，缓冲液pH值为5～7，高速离心分离水相和有机相，弃水相，重复洗涤有机相1～2次；(7).有机相加入无水Na2SO4，搅拌10～20分钟，然后过滤，在0.08MPa，30～90℃下真空浓缩至美伐他汀含量为250～350g/L；(8).浓缩液冷却到低于30℃，加入亲水性有机溶剂，有机溶剂终浓度50～95％，边搅拌边加入铵盐或氨水，使美伐他汀以铵盐形式结晶析出；(9).过滤收集美伐他汀铵盐晶体，用亲水性有机溶剂洗涤晶体，在40-60℃下真空干燥，HPLC检测美伐他汀纯度大于94％，得率大于80％；(10).美伐他汀铵盐可进一步通过重结晶提高纯度，最终得到的美伐他汀铵盐纯度大于98％。
2.根据权利要求1所述的一种从微生物发酵液中纯化普伐他汀前体美伐他汀的方法，其特征在于，所述的微生物可以是Penicillium sp.，Penicilliumbrevicompactin，Penicilmyces sp.，Trichoderma longibraiatum，Hyphomyces chrisopomus，penicillium citrium其中之一或它们的混合物；
3.根据权利要求1所述的一种从微生物发酵液中纯化普伐他汀前体美伐他汀的方法，其特征在于，所述的水解酶可以是枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶其中之一或它们的混合物；
4.根据权利要求1所述的一种从微生物发酵液中纯化普伐他汀前体美伐他汀的方法，其特征在于，所述的疏水性有机溶剂可以是乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸丙酯、富马酸乙酯、丁甲酮、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、甲苯其中之一或它们的混合物；
5.根据权利要求1所述的一种从微生物发酵液中纯化普伐他汀前体美伐他汀的方法，其特征在于，所述的微酸性缓冲液可以是KH2PO4、NaH2PO4其中之一或它们的混合物；
6.根据权利要求1所述的一种从微生物发酵液中纯化普伐他汀前体美伐他汀的方法，其特征在于，所述的亲水性有机溶剂可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异戊醇、辛醇、丙酮其中之一或它们的混合物；
7.根据权利要求1所述的一种从微生物发酵液中纯化普伐他汀前体美伐他汀的方法，其特征在于，所述的铵盐或氨水，铵盐可以是NH4CL、(NH4)2SO4、NH4Ac，NH4NO3其中之一或它们的混合物。
全文摘要
本发明涉及一种从微生物发酵液中纯化普伐他汀前体美伐他汀的方法，可用于降血脂药物中的研究和生产，其特点在于，含有美伐他汀的发酵液经过滤后，用水解酶处理，然后真空浓缩，再在酸性条件下将美伐他汀萃取到疏水性有机溶剂中，有机溶剂用弱酸性缓冲液洗涤后，真空浓缩至美伐他汀浓度大于300g/L，加入亲水性有机溶剂混合均匀，最后加入铵盐或氨水使美伐他汀转换为铵盐形式结晶析出。本发明的优点是美伐他汀以铵盐形式在常温下结晶纯化，生产能耗小，成本低，得率高，纯化得到的高纯度的美伐他汀铵盐，纯度不低于98％，对普伐他汀转化菌无毒性，可直接用于普伐他汀生产。
文档编号C07C67/00GK1504454SQ02151068
公开日2004年6月16日 申请日期2002年12月5日 优先权日2002年12月5日
发明者梅民权, 季晓铭, 李严, 姚勇, 卓中浩 申请人:上海天伟生物制药有限公司