一种从微生物发酵液中分离纯化丁二酸的工艺的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生物化工领域，涉及微生物发酵液中有机酸分离纯化。 技术背景
[0002] 丁二酸，又名琥泊酸，分子式:C4H6O4,分子量：118.09，是一种在人体、动植物和微 生物中广泛存在的天然二元有机羧酸。它作为C4平台化合物之一，在医药、食品、化工和农 业等行业具有广泛的应用。同时作为大宗原料化学品，市场需求量相当大。
[0003] 目前，丁二酸的来源主要是通过石油原料中的顺丁烯酸酐的催化加氢来合成的， 随着环境和能源问题的日益严峻，该生产方式不符合可持续发展的要求。利用生物转化发 酵的方法生产丁二酸具有高效、低碳、环境友好等优势，有望取代丁二酸的化工生产方式。 但由于发酵法生产丁二酸的分离工艺不够成熟，下游的丁二酸分离纯化费用占去了大部分 生产成本。因此，降低分离纯化的费用对于推进生物基丁二酸实现工业化，有着重要的意 义。
[0004] 从发酵液中提取丁二酸传统的方法主要有钙盐沉淀法、铵盐法、溶剂萃取法、离子 交换法、电渗析法以及膜分离法等。钙盐法也称石灰-硫酸法，该法提取步骤繁琐，劳动强度 大，收率不高，在提取过程中有大量的硫酸钙废弃物产生，同时发酵液中的其他有机杂酸也 会与钙离子，形成钙盐沉淀，杂酸不能完全除去。铵盐法，是用试剂消耗量少，副产物少的生 产和纯化工艺，可以循环利用硫酸铵，缺点是路线长，步骤繁琐，难度大，费用高，不利于用 发酵制备丁二酸的规模化生产。溶剂萃取法的前期投资小，产品纯度高，不足的是需要消耗 大量溶剂，成本高，且残留溶剂的毒性对食品级和医药级的产品质量有不良影响。电渗析法 提取的收率和纯度都很高，但是能耗高，设备投资大，操作成本高，在处理杂质离子有很大 的局限不能处理二价离子。膜分离方法膜易堵塞，不能根本去除杂质酸。近来，也有用双水 相系统分离丁二酸，此法的工艺简单，能耗低，但无法去除杂酸。
[0005] 总之，当前工艺存在着工艺流程繁杂，经济性差，单元操作设计不合理，不易实现 与发酵工艺的耦合，丁二酸收率低，需要进一步提高和改进。因此，有必要从微生物发酵液 中开发一种高效、简单、低成本及绿色无污染的丁二酸分离工艺。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种从丁二酸发酵液中分离出高纯度丁二酸的工艺方法。本 发明克服了现有工艺方法中收率低、纯度不高、高能耗、高成本等不足的缺点。
[0007] 本发明的技术方案：向发酵液中加入适量的尿素经超声（或加热）溶解，冷却结晶 获得共结晶加合物，再用醇将共结晶加合物溶解，然后将其加入到NaOH的醇溶液中，析出乳 白色固体，抽滤、干燥得到白色的丁二酸钠盐固体，最后，将丁二酸钠盐固体溶于水中过强 酸性阳离子交换树脂酸化得到丁二酸溶液，真空旋蒸、干燥，得到丁二酸晶体，工艺流程图 见说明书附图1。
[0008] 具体如下：
[0009] -种从微生物发酵液中分离纯化丁二酸的工艺，包括如下步骤：
[0010] (1)将产丁二酸的微生物发酵液过滤、离心除去菌体细胞及不溶的固体颗粒杂质， 取上清发酵液添加尿素，在4~28°C下共结晶析出丁二酸-尿素的加合物;尿素的添加量为 发酵液中丁二酸质量的2~8倍，共结晶结晶时间2~24小时；
[0011] (2)将步骤（1)所得丁二酸-尿素加合物溶于醇中，加入NaOH醇溶液，混合析出丁二 酸钠白色固体;过滤、干燥得丁二酸钠；
[0012] (3)将步骤(2)所得的丁二酸钠经强酸性阳离子交换树脂交换，收集pH 2~6的流 出液，减压蒸发干燥得丁二酸。
[0013] 添加尿素后可以通过超声或加热等方式促进尿素溶解。
[0014] 发酵液中有机酸如丁二酸的测定可以用UPLC检测，其色谱条件为：Waters AcquityUPLCΦ色谱柱：ACQUITYuPLC?BEH，Cl8l·7μm，2·lX100mm流动相 ：CH3CN:3mM H2S〇4=3:97，pH 2 · 25，流速：0 · 2mL/min，进样量：2yL，PDA检测波长：210nm，丁二酸发酵液主 要成分检测说明书附图2;
[0015] 微生物厌氧发酵糖类物质获得丁二酸发酵液。本发明方法适用的微生物包括产丁 二酸基因工程菌，如Escherichia coli NZNlll、Escherichia coli AFP111 等。但用于本发 明适用的微生物并不具体局限于产丁二酸的基因工程菌。
[0016] 步骤(2)所述的醇为甲醇、乙醇等;NaOH的量是丁二酸-尿素加合物质量的1~3倍； 让丁二酸完全转化成钠盐析出。
[0017] 步骤(2)过滤、干燥得丁二酸钠，可以浓缩回收滤液中醇和尿素，尿素回至步骤(1) 重复利用。
[0018] 步骤(3)所述的强酸性阳离子交换树脂包括732型、734型及Dowex? 50WX4强酸 性阳离子交换树脂中的一种或几种。
[0019]为了达到更好的效果，步骤(3)所述的强酸性阳离子交换树脂，经过碱化-水-酸 化-水-碱化-水-酸化-水预处理，最终纯水洗至流出液的pH 6~7;再将丁二酸钠溶液上样， 用纯水洗脱，收集pH 2~6的流出液，即为丁二酸溶液，减压浓缩得到丁二酸晶体。实施实例 6丁二酸晶体纯度检测见说明书附图3。
[0020] 本发明利用尿素与丁二酸以氢键结合，冷却结晶析出共结晶物。再利用碱（如 NaOH)去破坏氢键，形成不溶于醇的丁二酸钠盐，再利用强酸性阳离子交换树脂分离获得丁 二酸。
[0021] 本发明的有益效果：
[0022] 本发明通过加入过量的尿素能够将96%以上的丁二酸从发酵液中共结晶出来，而 其他杂酸如乙酸、丙酮酸等浓度基本不变(如图4、图5)。如说明书附图4所示在6组50mL的预 处理后的Escherichia coli NZN111发酵液中，分别加入不同量的尿素，添加量为0g，5g， l〇g时，发酵液中的丁二酸的含量急剧的减少，与尿素共结晶析出，而当尿素的量继续由l〇g 增大到20g，发酵液中丁二酸的减幅变小，当尿素添加量超过25g时发酵液中丁二酸的量低 于2.64g/L，而乙酸和丙酮酸的浓度变化不大。如说明书附图5所示，当总尿素添加量为45g 时，50mL Escherichia coli NZN111 发酵液中丁二酸的浓度由 106.7(^/1 减少至 1.32g/L， 而乙酸和丙酮酸的浓度基本不变。
[0023] 工艺步骤简单易工业化。所得的丁二酸得率高、纯度高(可以超过99% )。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明所述的从微生物发酵液中分离丁二酸的工艺路线；
[0025] 图2为本发明所述的Escherichia coli NZN111发酵液的UPLC液相色谱图（1 一水 2-丙酮酸3-乙酸4一丁二酸）；
[0026]图3为本发明所述的实施实例6分离得到的丁二酸的UPLC液相色谱图（1 一水2-丁 二酸)；
[0027]图4为本发明所述的尿素对发酵液中丁二酸、丙酮酸、乙酸的影响图；一· 一丁二 酸;一▲一乙酸;一?一丙酮酸；
[0028]图5为本发明所述的丁二酸发酵液加入尿素前后变化图；1水2丙酮酸3乙酸4丁二 酸； 具体实施方案
[0029]以下结合具体实例对本发明进行详细说明
[0030] 将产丁二酸的微生物发酵液过滤、离心除去菌体细胞及不溶的固体颗粒杂质，获 得上清的发酵液备用。
[0031] 实施例1:将产丁二酸的微生物Escherichia coli NZN111发酵液过滤、离心除去 菌体细胞及不溶的固体颗粒杂质，取上清发酵液备用。取10mL上清发酵液(初始丁二酸浓度 为101.77g/L)于洁净干燥的试管中，向试管中加入4.0g尿素，水浴加热至试管中的固体完 全溶解，然后放置在4 °C下8h，过滤干燥，得到针状固体2.08g。将2.08g针状固体溶解于盛有 100mL无水甲醇的烧杯中，称取2. lg NaOH溶解于另一只盛有100mL无水甲醇的烧杯中，然后 将NaOH醇溶液倒入盛有针状固体醇溶液的烧杯中混合，有大量白色固体析出，过滤干燥得 到白色固体。再将白色固体溶解于50mL纯水中，过732强酸型阳离子交换树脂，收集pH2~6 的流出液，旋蒸（60~70°C)，干燥（80°C)，得到0.91g 丁二酸固体。丁二酸的回收率为 89 · 42 %，经UPLC测定纯度99 · 68 %。
[0032] 实施例2:将产丁二酸的微生物Escherichia coli NZN111发酵液过滤、离心除去 菌体细胞及不溶的固体颗粒杂质，取上清发酵液备用。取50mL上清Escherichia coli NZN111发酵液（丁二酸初始浓度101.77g/L)于洁净干燥的试管中，向试管中加入20.0g尿 素，超声至试管中的固体完全溶解，然后放置在室温下8h，过滤干燥，得到10.50g针状固体。 将针状固体溶解于盛有400mL无水乙醇的烧杯中，称10.50gNa0H溶解于另一只盛有750mL无 水乙醇的烧杯中，然后将NaOH醇溶液倒入盛有针状固体醇溶液的烧杯中混合，有大量白色 固体析出，过滤干燥得到白色固体。再将白色固体溶解于250mL纯水中，过732强酸型阳离子 交换树脂，收集PH2~6的流出液，旋蒸(60~70°C)，干燥(80°C)，得到4.5g 丁二酸固体。丁二 酸的回收率为90.90 %，经UPLC测定纯度99.50 %。
[0033] 实施例3:将产丁二酸的微生物Escherichia coli NZN111发酵液过滤、离心除去 菌体细胞及不溶的固体颗粒杂质，取上清发酵液备用。取100mL上清Escherichiacoli NZN111发酵液(丁二酸初始浓度为101.77g/L)于洁净干燥的烧杯中，向烧杯中加入40.0g尿 素，水浴加热至烧杯中的固体完全溶解，然后放置在室温下12h，过滤干燥，得到针状固体 20.29g。将针状固体溶解于盛有lOOOmL无水乙醇的烧杯中，称取2