一种分离纯化植物绒毡层组织的方法
【技术领域】
[0001]本发明是一种从植物花药分离绒毡层组织的方法，涉及绒毡层组织分离和获取，属于发育生物学及细胞生物学领域。
【背景技术】
[0002]绒毡层细胞存在于植物花药内侧，为小孢子发育提供必要的营养物质，在小孢子发育成熟后降解。绒毡层参与了小孢子发育、花粉与柱头识别等众多生理过程，是发育生物学等相关研究领域研究重点。
[0003]目前，研究相关基因在组织中的特异表达是国际研究趋势。但是绒毡层存在于花药内部，要开展相关研究首先需要分离绒毡层组织，而目前未见相关技术。为了解决上述问题，我们发明了一种快速酶解技术，并运用该技术成功分离出花药绒毡层组织。在这一技术中，我们利用白菜20个花蕾获得的花药，经过酶解、过滤后，获得足量绒毡层组织，并利用该组织进一步提取该组织DNA和RNA。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供简便、快速分离花药绒毡层方法，为进一步研究相关基因在绒毡层组织中表达调控奠定基础。
[0005]本发明一种从植物花药分离绒毡层组织的方法，包括花药处理、酶解、分离、收集等步骤，最后得较少杂质的绒毡层组织。
[0006]具体包括下列步骤(图1):
[0007]I)花药的采集:采集花前三天的花蕾20个，收集化药;本步骤确定了分离花药所需最少花蕾数。
[0008]2)清洗液的制备:含有50mM Hepes,0.5M蔗糖，并用KOH调节pH值至7.5;本步骤确定绒毡层分离合适的缓冲液浓度及糖浓度，保证分离过程中组织细胞不会受到伤害；
[0009]3)酶解液的制备:向清洗液中加入最终浓度为5%纤维素酶RS和0.1 %果胶酶Y23;本步骤确定了绒毡层分离合适酶种类和浓度；
[0010]4)花药前处理:用解剖刀去除花药两端，并在剩余部位中间切开以便绒毡层细胞的提取;本步骤解决花药小孢子去除的问题，并保证酶解液与花药组织充分接触；
[0011]5)小孢子去除:将处理后的花药放入1.5ml离心管中，加入清洗液lml，涡旋20min，过滤，包含小孢子溶液经过过滤后丢弃，花药其他部位依然储存于离心管中，重复上述清洗、分离步骤;花药剩余部分等待进一步处理；
[0012]6)绒毡层细胞的分离:将600μ1酶解液加入到过滤后储存剩余花药部分的离心管，涡旋12min，通过过滤得到上清，绒毡层组织包含于上清液中；
[0013]7)绒毡层细胞的收集:将上清液在4°C、12000g条件下离心15min，沉淀即为绒毡层(图 2)。
[0014]本发明的有益效果体现在:
[0015]I)首次从植物花药中分离出绒毡层细胞，可以用于研究绒毡层组织特性；
[0016]2)应用本发明的方法分离绒毡层细胞，可进一步用于绒毡层细胞DNA、RNA提取，研究与花粉发育、识别相关基因在绒毡层中的表达与调控；
[0017]3)本发明操作简单，耗时短，分离绒毡层组织杂质少，纯度高，可以广泛用于不同植物绒毡层组织分离、纯化。
【附图说明】
[0018]图1花药绒毡层分离纯化流程图。
[0019]图2分离得到的绒毡层组织。T:绒毡层;M:小孢子。标尺=500μπι。从图中可以看出，分离的绒毡层纯度较高。
[0020]图3SPll在不同组织表达分析。SPll基因在白菜花药中特异表达。G:基因组DNA;T:绒毡层RNA反转录得到cDNA ； D:分离过程中其他花药组织RNA反转录得到cDNA。
[0021]图4SPll启动子区域在S基因型为S8S44白菜中DNA甲基化率分析。
【具体实施方式】
[0022]分离植物绒毡层组织，是研究小孢子发育、花粉与柱头识别相关基因在绒毡层中特异表达、调控的必要前提之一。我们应用本发明的方法，获取了足量、少杂质的植物绒毡层组织，为开展相关研究奠定基础。我们相关方法的建立，也填补相关空白。
[0023]本实例用20个白菜花前3天的花蕾分离出绒毡层细胞，实验过程如下(图1):
[0024]1.收集花前三天白菜花蕾20个，取出花药；
[0025]2.切除花药两端，并将剩余部分从中间切开，便于去除小孢子；
[0026]3.将处理后的花药放入1.5ml离心管中，加入清洗液lml，涡旋20min，过滤，包含小孢子溶液经过过滤后丢弃，花药其他部位依然储存于离心管中，重复上述清洗、分离步骤；花药剩余部分等待进一步处理；
[0027]4.将600μ1酶解液加入到过滤后储存剩余花药部分的离心管，涡旋12min，通过过滤得到上清，绒毡层组织包含于上清液中；
[0028]5.将上清液在4°C、12000g条件下离心15min，沉淀即为绒毡层(图2);
[0029]利用获得绒毡层进一步提取RNA和DNA，RNA反转录后用于检测BrSPll表达(图3);DNA用于检测BrSPll-S44启动子区域甲基化情况检测(图4)。
【主权项】
1.一种分离纯化植物绒毡层组织的方法，其特征在于包括下列步骤: 1)花药的采集:采集花前三天的花蕾20个，收集化药； 2)清洗液的制备:含有50mMHepes,0.5M蔗糖，并用KOH调节pH值至7.5; 3)酶解液的制备:向清洗液中加入最终浓度为5%纤维素酶RS和0.1%果胶酶Y23; 4)花药前处理:用解剖刀去除花药两端，并在剩余部位中间切开以便绒毡层细胞的提取； 5)小孢子去除:将处理后的花药放入1.5ml离心管中，加入清洗液lml，涡旋20min，过滤，包含小孢子溶液经过过滤后丢弃，花药其他部位依然储存于离心管中，重复上述清洗、分离步骤;花药剩余部分等待进一步处理； 6)绒毡层细胞的分离:将600μ1酶解液加入到过滤后储存剩余花药部分的离心管，涡旋12min，通过过滤得到上清，绒毡层组织包含于上清液中； 7)绒毡层细胞的收集:将上清液在4°C、12000g条件下离心15min，沉淀即为绒毡层。
【专利摘要】本发明涉及一种分离纯化植物绒毡层组织的方法，属于发育生物学及细胞生物学领域。本发明通过对花药的采集、清洗液的制备、酶解液的制备、花药前处理、去除花药小孢子、绒毡层细胞的分离和收集步骤。利用合适的酶种类及浓度酶解分离绒毡层组织，再通过过滤离心纯化收集绒毡层。本方法具有步骤简单、操作方便、耗时较短等优点，分离效率好，得到的绒毡层组织可用于后续实验。
【IPC分类】C12N5/04
【公开号】CN105602885
【申请号】CN201510797285
【发明人】王春雷, 高季平, 叶蕴灵, 赵贝贝, 张盼盼
【申请人】扬州大学
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2015年11月18日