本发明属于黄酮类化合物的提取领域，特别涉及一种从昆仑雪菊中分离纯化马里苷的方法。
背景技术：
马里苷，英文名marein，cas登记号535-96-6，化学结构式如下：
马里苷是一种植物多酚类物质，存在于两色金鸡菊和昆仑雪菊中。已有报道证明，马里苷具有较强的抗氧化活性，且对胰岛β细胞的保护作用。例如，文献1(“昆仑雪菊中5个黄酮类化合物抗氧化活性的dft研究”，丁豪，农产品加工，第6期，2016年6月)报道了推测出马里苷强抗氧化活性。文献2(“两色金鸡菊黄酮成分马里苷对胰岛β细胞的保护作用”，刘菁，新疆医科大学学报，2007年04期)报道了马里苷对高糖高脂造成的胰岛细胞损伤有保护作用，其可能机制可能与bcl蛋白家族有关。
马里苷的提取往往是先将原料浸提，然后减压柱层析，再用硅胶柱层析或凝胶柱层析，多次柱层析导致马里苷的提取繁琐，收率低。
为了克服提取繁琐、收率低等问题，本发明提出了一种全新的马里苷分离纯化方法。
技术实现要素：
本发明提供了一种马里苷分离纯化方法，该方法以昆仑雪菊为原料，晾干粉碎过筛，用乙醇浸泡1-2个月，再用甲苯萃取，萃取物用高速逆流色谱(hsccc)分离纯化，即可得到纯度较高的马里苷。该方法具有操作简单，时间短且提取率高等优点。
本发明的技术方案具体如下：
一种马里苷的分离纯化方法，包括如下步骤：
(1)以昆仑雪菊为原料，自然晾干，粉碎过筛得粉末；
(2)将上述粉末加入到乙醇中，浸泡30-60天，过滤，取上清液，减压浓缩至干；
(3)向浓缩物中加入水和甲苯，用甲苯萃取三次，取甲苯层，再次减压浓缩至干；
(4)取浓缩物，用高速逆流色谱进行分离纯化，以氯仿-甲醇-正丁醇-水(5:4:1:3)为溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，转速为820r/min，流速为2.0ml/min，紫外检测，根据色谱图收集馏分，减压浓缩后得到马里苷。
优选的，第(1)步中过筛所采用的是选自40、100、200目的筛子。
优选的，第(2)步中浸泡30或60天。
采用本发明的方法分离纯化马里苷，具有操作简单，安全可靠，时间短，提取率高等优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐释本发明。
实施例1
将市售的昆仑雪菊自然晾干，称取100g晾干的昆仑雪菊，粉碎过40目筛得粉末；将该粉末加入到500ml乙醇中，浸泡30天，过滤，取上清液，并将该上清液减压浓缩至干；向浓缩物中加入50ml水和50ml甲苯，萃取，分出甲苯层；水层再加入50ml甲苯，萃取，分出甲苯层；剩余水层加入20ml甲苯萃取，分出甲苯层；将三次萃取的甲苯层合并，减压浓缩至干。室温下，配制溶剂系统，按氯仿-甲醇-正丁醇-水的体积比为5:4:1:3配制，置于分液漏斗中震荡，静止分层并放置过夜，使溶剂系统充分平衡，上相为固定相，下相为流动相。取甲苯层浓缩物，用固定相和流动相各10ml充分溶解得样品。开启高速逆流色谱仪，先充满固定相，设置转速为820r/min，泵入流动相，流速为2.0ml/min，待平衡后注入样品，紫外检测，根据色谱图收集馏分，减压浓缩后得到淡黄色固体马里苷0.21g。ms：451.4[m+h]+，对照标准品用hplc和红外谱图检测，其特征锋位置相同，且计算得含量为97.5％。
实施例2
将市售的昆仑雪菊自然晾干，称取100g晾干的昆仑雪菊，粉碎过100目筛得粉末；将该粉末加入到500ml乙醇中，浸泡60天，过滤，取上清液，并将该上清液减压浓缩至干；向浓缩物中加入50ml水和50ml甲苯，萃取，分出甲苯层；水层再加入50ml甲苯，萃取，分出甲苯层；剩余水层加入20ml甲苯萃取，分出甲苯层；将三次萃取的甲苯层合并，减压浓缩至干。室温下，配制溶剂系统，按氯仿-甲醇-正丁醇-水的体积比为5:4:1:3配制，置于分液漏斗中震荡，静止分层并放置过夜，使溶剂系统充分平衡，上相为固定相，下相为流动相。取甲苯层浓缩物，用固定相和流动相各10ml充分溶解得样品。开启高速逆流色谱仪，先充满固定相，设置转速为820r/min，泵入流动相，流速为2.0ml/min，待平衡后注入样品，紫外检测，根据色谱图收集馏分，减压浓缩后得到淡黄色固体马里苷0.25g，含量为96.7％。
实施例3
将市售的昆仑雪菊自然晾干，称取100g晾干的昆仑雪菊，粉碎过40目筛得粉末；将该粉末加入到500ml乙醇中，浸泡60天，过滤，取上清液，并将该上清液减压浓缩至干；向浓缩物中加入50ml水和50ml甲苯，萃取，分出甲苯层；水层再加入50ml甲苯，萃取，分出甲苯层；剩余水层加入20ml甲苯萃取，分出甲苯层；将三次萃取的甲苯层合并，减压浓缩至干。室温下，配制溶剂系统，按氯仿-甲醇-正丁醇-水的体积比为5:4:1:3配制，置于分液漏斗中震荡，静止分层并放置过夜，使溶剂系统充分平衡，上相为固定相，下相为流动相。取甲苯层浓缩物，用固定相和流动相各10ml充分溶解得样品。开启高速逆流色谱仪，先充满固定相，设置转速为820r/min，泵入流动相，流速为2.0ml/min，待平衡后注入样品，紫外检测，根据色谱图收集馏分，减压浓缩后得到淡黄色固体马里苷0.23g，含量为97.1％。