一种蛋白提取和分离纯化方法
【专利摘要】本发明公开了一种蛋白提取和分离纯化方法，所述蛋白提取和分离纯化方法包括卵粘蛋白分离纯化方法、鸡蛋卵转铁蛋白分离纯化方法和鸡蛋免疫球蛋白提取纯化方法；本发明采用先稀释后均质的方法，蛋清液经生理盐水稀释后均质，不仅降低了蛋清液的黏度，而且破坏了其复杂的结构，从而使蛋清液过滤速度较快，膜清洗较为容易，降低了膜的污染程度，延长了膜的使用寿命当操作压力在0.15MPa时，处于相对平稳的流通状态，且在一定程度上一直滤液浓差极化现象。本发明以已水稀释法为基础，并结合聚乙二醇沉淀以及DEAE?Toyopearl 650M一步洗脱离子交换层析进行纯化，得到高回收率高纯度的鸡卵黄IgY。
【专利说明】
一种蛋白提取和分离纯化方法
技术领域
[0001] 本发明属于糖蛋白技术领域，尤其涉及一种蛋白提取和分离纯化方法。
【背景技术】
[0002] 鸡卵类粘蛋白是由鸡卵清中制得的一种糖蛋白，具有强烈的抑制胰蛋白酶的作 用，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究和胰蛋白酶的亲和层析纯化制备。分子量:28000Da， 分子由四个分子量相近的亚基组成糖蛋白组成，即D-甘露糖，D-半乳糖，葡萄糖胺，唾液酸； 化学稳定性，耐热：在80°C条件下，理化性质不发生改变，耐有机溶剂:在50 %的丙酮溶液 中，能保持良好的溶解度，耐沉淀剂:在1 〇 %的TCA的溶液中不发生沉淀。等电点性质，等电 点:pi在3.9-4.5之间，溶液中的状态:在pH3.0的溶液中稳定，在pH8.0的溶液中容易分解。 鸡卵黄免疫球蛋白，简称IgY，又称鸡卵黄抗体。具有免疫原性，在蛋黄中以α-、β-和γ-卵黄 球蛋白三种形式存在。
[0003] 目前国际上采用的IgY分离纯化方法主要包括水稀释法、有机溶剂抽提沉淀法、超 滤、超临界萃取法与冻融等物理化学法及盐析与DEAE色谱相结合等方法。国内外有关于从 鸡蛋清中分离提取活性物质已有较多研究和报道，且已有相关的工业化生产并产生了良好 的经济效益，如溶菌酶，免疫球蛋白等。而从鸡蛋清中提取卵转铁蛋白的研究主要还停留在 实验室规模，并未实现工业化生产，研究进展相对缓慢。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种蛋白提取和分离纯化方法，旨在解决【背景技术】中所述 的问题。
[0005] 本发明是这样实现的，一种蛋白提取和分离纯化方法，所述蛋白提取和分离纯化 方法包括卵粘蛋白分离纯化方法、鸡蛋卵转铁蛋白分离纯化方法和鸡蛋免疫球蛋白提取纯 化方法；
[0006] 所述卵粘蛋白分离纯化方法采用GaCL2或MgCl2制备卵粘蛋白；
[0007] 所述鸡蛋卵转铁蛋白分离纯化方法包括：新鲜鸡蛋清原液，0.9生理盐水稀释， 3000r/min离心15min去除卵粘蛋白，再用等电点盐析除去卵白蛋白；经离心和等电点沉淀 的样品微滤除去〇. 1_1〇〇Μ?范围的杂质，进而米用超滤，用聚讽树脂衍生物膜去除lOOkDa以 上大分子蛋白质，再用聚砜树脂衍生物膜截留分子量大于50kDa的蛋白质，得浓缩液，得到 的浓缩液进行透析处理，并冷冻干燥；
[0008] 所述鸡蛋免疫球蛋白提取纯化方法采用已水稀释法结合聚乙二醇沉淀以及DEAE-Toyopearl 650M-步洗脱离子交换层析进行纯化，得到高回收率高纯度的鸡卵黄IgY。
[0009] 进一步，所述卵粘蛋白分离纯化方法包括以下步骤：
[0010] 全蛋清搅拌均匀后加5倍体积的盐溶液，0.05mol/LMgCl2或〇.lmol/L NaCl，均质 后用0.1mol/L HC1调pH = 6.0,4°C静置过夜，15,000g离心10min，4°C，沉淀用0.5mol/L NaCl重悬，4°C放置4h，15,000g离心10min，4°C，将得到的沉淀双蒸水洗涤至上清中不含蛋 白质，沉淀部分即为卵粘蛋白粗提物；
[00?1 ] 粗提物溶解于1 〇mmo 1 /L硼酸盐酸缓冲液pH = 9.6中配成5mg/ml溶液，4°C搅拌过 夜，0.45μπι微孔滤膜过滤后进行凝胶层析，洗脱液为含0.2mol/LMgCld^]TriS-HCl缓冲液， 20mmol/L，pH=8.4，流速0.5ml/min;收集各洗脱峰的冻干样品经SDS-PAGE进行鉴定，目标 组分冷冻干燥后-20 °C保存。
[0012] 进一步，所述卵粘蛋白对大肠杆菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度分别为0.05mg/mL 和0.2mg/mL。
[0013] 进一步，所述鸡蛋卵转铁蛋白分离纯化方法包括：
[0014] 连接好超滤装置，通过0.2MPa超纯水压力持续lh，待水流通量稳定后，测定超滤膜 初始纯水通量，超滤完毕后，取出超滤膜进行蒸馏水冲洗，并用0.1M NaOH和0.1M HC1浸泡 30min，最后用蒸馏水反复冲洗，再次测定膜纯水流通量；
[0015] 新鲜鸡蛋清原液，0.9生理盐水稀释，3000r/min离心15min去除卵粘蛋白，再用等 电点盐析除去卵白蛋白；
[0016] 经离心和等电点沉淀的样品微滤除去0.1 -1 ΟΟμπι范围的杂质，进而采用超滤技术， 用聚砜树脂衍生物膜去除l〇〇kDa以上大分子蛋白质，再用聚砜树脂衍生物膜截留分子量大 于50kDa的蛋白质，得浓缩液，之后得到的浓缩液进行透析处理，并冷冻干燥。
[0017] 进一步，所述蛋白提取和分离纯化方法的超滤装置压力为0.15MPa，0.9生理盐水 稀释倍数为10倍，搅拌速率为125r/min，此时膜通量值为39.80, pH为7。
[0018] 进一步，所述鸡蛋免疫球蛋白提取纯化方法包括：
[0019] 选取新鲜鸡蛋，采用蛋清蛋黄分离器，分离得到蛋黄，用蒸馏水将蛋黄洗净，置于 滤纸上吸干，刺破蛋黄膜，收集蛋黄液，以体积百分比计，用蒸馏水对蛋黄进行不同倍数的 稀释8倍搅拌均匀，调节不同pH值5.0~5.6,4°C静置不同时间（2h、4h、6h、8h、10h)，5000X 冷冻离心30min后，得澄清上清液含IgY水溶性组分WSF;
[0020] 向所得的WSF中加入不同质量分数的PEG6000,磁力搅拌器搅拌30min，22000Xg冷 冻离心，收集沉淀；
[0021] 透析，收集沉淀加入蒸馏水，搅拌，装入透析袋，截留分子量为8000-14000KD中，4 °C透析除去部分残留PEG6000,冷冻干燥即得粗IgY组分；
[0022] 离子交换色谱法纯化IgY，用Na2HP〇4_NaH2P〇4缓冲液平衡，设置pH值为6.0，7.0， 8.0条件下不同缓冲液离子强度（0.03m〇l/L、0.05m〇l/L、0.1m〇l/L)上样平衡、恒流洗脱 (0.075111 〇1/1，0.1111〇1/1)，洗脱流出液按每管51111/31^11自动收集;将层析所收集的组分装入 透析袋截留分子量为8000-14000KD，置于蒸馏水中，4°C透析除盐。
[0023]本发明提供的蛋白提取和分离纯化方法，采用GaCL2与MgCl2结合的方法制备卵粘 蛋白效果最佳，制备的卵粘蛋白纯度>97%，采用该方法制备的卵粘蛋白纯度大于97%，终 产量408.65 ± 4.32mg/ 100g蛋清，回收率为(85.3 ± 1.08) %。经凝胶过滤分离，成功分离得 到纯卵粘蛋白为302. lmg，总得率为57.03%。
[0024]本发明采用先稀释后均质的方法，蛋清液经生理盐水稀释后均质，不仅降低了蛋 清液的黏度，而且破坏了其复杂的结构，从而使蛋清液过滤速度较快，膜清洗较为容易，降 低了膜的污染程度，延长了膜的使用寿命当操作压力在〇.15MPa时，处于相对平稳的流通状 态，且在一定程度上一直滤液浓差极化现象。
[0025] 本发明以已水稀释法为基础，并结合聚乙二醇沉淀以及DEAE-Toyopearl650M-步 洗脱离子交换层析进行纯化，得到高回收率高纯度的鸡卵黄IgY。
【附图说明】
[0026] 图1是本发明实施例提供的蛋白提取和分离纯化方法流程图。
[0027 ]图2是本发明实施例提供的ovomuc i η对大肠杆菌生长曲线影响示意图。
[0028 ]图3是本发明实施例提供的ovomuc i η对沙门氏菌生长曲线影响示意图。
[0029] 图4是本发明实施例提供的ovomucin对金黄色葡萄球菌生长曲线影响示意图。
[0030] 图5是本发明实施例提供的卵转铁蛋白超滤分离的工艺流程图。
[0031] 图6是本发明实施例提供的稀释倍数对鸡蛋清液相对粘度的影响示意图。
[0032] 图7是本发明实施例提供的剪切速率对鸡蛋清液相对粘度的影响示意图。
[0033] 图8是本发明实施例提供的温度对鸡蛋清液相对粘度的影响示意图。
【具体实施方式】
[0034]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0035] 下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
[0036] 一、卵粘蛋白
[0037] 1.2卵粘蛋白分离纯化
[0038] 1.2.1卵粘蛋白分离纯化的工艺流程，如图1所示。
[0039] S101:全蛋清搅拌均匀后加5倍体积的盐溶液（0.05mol/LMgCl2或0.1m〇l/L NaCl)，均质后用0.1mol/L HC1 调pH = 6.0,4°C静置过夜，15,000g离心 10min(4°C)，沉淀用 0.5mol/L NaCl重悬，4°C放置4h，15，000g离心10min(4°C )，将得到的沉淀双蒸水洗涤至上 清中不含蛋白质，沉淀部分即为卵粘蛋白粗提物；
[0040] S102:粗提物溶解于10mmol/L硼酸盐酸缓冲液(pH=9.6)中配成5mg/ml溶液，4°C 搅拌过夜，〇. 45μηι微孔滤膜过滤后进行凝胶层析(Sephacry IS-300HR，2.0*7cm)，洗脱液为 含0 · 2mol/LMgCl2的Tris-HCl缓冲液(20mmol/L，pH = 8.4)，流速0 · 5ml/min。收集各洗脱峰 的冻干样品经SDS-PAGE进行鉴定，目标组分冷冻干燥后-20°C保存。
[0041] 1.2.2分步盐析制备卵粘蛋白粗品
[0042] 全蛋清搅拌均匀后加5倍体积的盐溶液(0.05mol/LMgCl2或0. lmol/L NaCl)，均质 后用0.1mol/L HC1调pH = 6.0,4°C静置过夜，15,000g离心10min(4°C)，沉淀用0.5mol/L NaCl重悬，4°C放置4h，15,000g离心10min(4°C)，将得到的沉淀双蒸水洗涤至上清中不含蛋 白质，沉淀部分即为卵粘蛋白粗提物。
[0043] 1.2.3凝胶过滤层析
[0044] 粗提物溶解于1 Ommo 1 /L硼酸盐酸缓冲液(pH = 9.6)中配成5mg/ml溶液，4 °C搅拌过 夜，0.45μηι微孔滤膜过滤后进行凝胶层析（Sephacry IS-300HR，2.0*7cm)，洗脱液为含 0·2mol/LMgCl2的Tris-HCl缓冲液(20mmol/L，pH = 8.4)，流速0·5ml/min。收集各洗脱峰的 冻干样品经SDS-PAGE进行鉴定，目标组分冷冻干燥后-20°C保存。
[0045] 1.2.4聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
[0046] SDS-PAGE采用Tris-HCl缓冲系统进行垂直电泳，分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度 为5%，考马斯亮蓝R-250(2%)和Schifft试剂分别进行染色。蛋白质溶解液为含SDS(1%， w/v)和2-巯基乙醇（ΙΟμΙ/mL)的0·01mol/L Tris-HCl(pH=7·0)缓冲液。工作电压8V/cm。
[0047] PAGE胶经凝胶成像系统成像后经Gelpro. 32蛋白质图像分析软件对目标条带进行 分析。
[0048] 1.2.5纯度测定
[0049] 采用HPLC法测定卵粘蛋白的纯度，目标组分配制成lmg/mL的溶液进样，RP-HPLC采 用C4柱，流动相为体积分数0.05 %三氟醋酸水溶液，柱温30°C，进样量20μ1，15-95 %乙腈梯 度洗脱，检测波长280nm，流速为lmL/min 〇 [0050] 1.2.6产量和得率的测定
[0051]卵粘蛋白的含量用l〇〇g蛋清蛋白质中卵粘蛋白的毫克数表示。计算公式为：
[0053]其中，W=100g蛋清为原料制备的冷冻干燥后的粉末质量(g);
[0054]卵粘蛋白的得率即为制备样品中含量与蛋清原料中含量的比率，计算公式为：
[0056]其中，Wi为干燥后样品的质量，W2为蛋清质量 [0057] 1.2.7卵粘蛋白抗菌特性研究
[0058] 以大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌为实验对象，对卵粘蛋白的体外抗菌性能 进行评价。
[0059] 1)菌种活化与接种
[0060] 菌种解冻后置无菌操作台上接种到营养肉汤中，37°C恒温震荡培养12h，使菌落数 达1〇1()并制成菌悬液。
[00611 2)最小抑菌浓度的测定(MIC)
[0062] MIC采用二倍稀释法测定。实验过程参照文献(左娟和马美湖2010)。
[0063] 3)生长曲线的测定
[0064] 活化的菌种用灭菌的营养肉汤稀释至菌体浓度为108CFU/ml，进而取100yL加到96 孔酶标板中，在样品孔加入l〇〇yL经过0.45μπι的细菌过滤器过滤的卵粘蛋白溶液(0.05mg/ mL)混匀，37 °C恒温培养箱中培养24h后于酶标仪上测定0D6QQnm。以0D6QQ对培养时间作图绘 制菌体生长曲线，同时设空白对照，阳性对照和阴性对照，每孔5个平行，实验重复3次。 [0065] 4)抑菌率的测定
[0066] 96孔板中依次加入稀释的活化菌悬液100yL，0.05mg/mL卵粘蛋白溶液(0.45μπι细 菌过滤器过滤）l〇〇yL，混匀后于37 °C恒温培养箱中培养24h，酶标仪上测定ODsoonm，空白对 照为100yL培养基加100yL生理盐水，对照组为生理盐水代替样品组的卵粘蛋白溶液，抑菌 率按照以下公式计算(Kodama，Kimura，2001)。
[0068] 1.2.8卵黏蛋白体外抗病毒活性评价
[0069] 1.2.8.1病毒的活化及病毒悬液的制备
[0070] 取出低温冻存的试验病毒株，37°C温水浴融化，加入l_2mL细胞维持液，然后接种 于已经长满单层细胞的细胞培养瓶中，置37°C温箱中使与细胞吸附、生长。逐日在显微镜下 观察病变，待3/4细胞出现病变时，收集培养液，并反复冻融宿主细胞，释放病毒。6000rpm离 心15min，去除沉淀(主要为细胞碎片），上清液即为所需要的病毒悬液。分装存于-70°C冰箱 中，滴定效价备用。
[0071] 1.2.8.2鸡红细胞的制备
[0072]灭菌注射器预先用3.8%的柠檬酸钠洗后吸取正常健康鸡血，放于预先加入3倍体 积的阿氏液的灭菌离心管内，轻轻混匀后经1800r/min离心10min，弃上清液。再加灭菌的 PBS悬浮血球，1800r/min离心10min，弃上清液。重复该步骤3次，充分吸取白细胞与血小板 等后，将沉淀的红细胞根据所需用量用生理盐水配成1 %浓度。
[0073] 1.2.8.3病毒毒力的测定
[0074] 1)流感病毒的血凝滴度
[0075] 取塑料96孔板，自左至右歌加入30yL于第二孔，混匀，以此倍比稀释至11孔，吸取 30yL吸弃至消毒液中。稀释后各孔的稀释度分别1:2、1:4，1:8……最后一孔为对照。各孔加 入1 %的鸡RBC30yL，卫星混合器上摇振lmin，使血球与病毒充分混合。37 °C温箱中作用15-30min，待对照孔的红细胞沉淀可观察结果。效价判定时对照管应不凝集，试验管中以能使 发生"++"凝集的病毒最高稀释度为凝集效价，该管稀释度即为1个血凝单位。
[0076] 2)流感病毒的TCID50的测定
[0077] 取出一块细胞培养板，每个孔大约传 8000-10000个细胞，每个孔的细胞大约70% 丰度即可接种病毒。在EP管中用无血清孵育液10倍倍比稀释病毒原液。用多道加样器吸去 97孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液。将稀释好的 病毒液加到96孔板上，每孔100yL，设置正常的细胞对照。37 °C ω2培养箱中孵育1 h，取出培 养板，显微镜下观察细胞病变。观察CPE，找出能引起半数细胞瓶或管感染的病毒稀释倍数， 按Reed-Muench法计算出该病毒液的TCID50。
[0078] lgTCID50 =距离比例X稀释对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数
[0079] TCID50=Antilog高于50%病变的病毒最高稀释度的对数+距离比例
[0081 ] 1.2.8.4对鸡红细胞的毒性
[0082] 用PBS将ovomucin配成10mg/mL的原液，在96孔V型微量血凝板中用PBS将ovomucin 原液依次倍比稀释，每孔30此。然后每孔加1%红细胞悬液30yL，并使之充分摇匀，于温室静 置30-60min，观察红细胞的凝聚情况。
[0083] 2结果与分析 [0084] 2.1卵粘蛋白的粗制备
[0085] 采用GaCL2与MgCl2结合的方法制备卵粘蛋白效果最佳。该方法制备的卵粘蛋白纯 度>97 %，采用该方法制备的卵粘蛋白纯度大于97 %，终产量408.65 ±4.32mg/100g蛋清，回 收率为(85·3±1·08)%。
[0086] 2.2卵粘蛋白的层析纯化
[0087] 盐析后卵粘蛋白粗提物在Sephacry S-300上洗脱，洗脱液为含0.05mol/ LMgCl2Tris-HCl (20mmo 1/L，pH8.4)，粗提物经凝胶层次西后有4个蛋白洗脱峰。将不同洗脱 峰的蛋白进行SDA-PAGE电泳分析，100g全蛋清中约有385.87 ± 5.32mg，得率约为73.83%， 经凝胶过滤分离，成功分离得到纯卵粘蛋白为302. lmg，总得率为57.03%。
[0088] 2.3卵粘蛋白对不同细菌的抑制效果
[0089] 采用常量肉汤稀释法研究了不同浓度的卵粘蛋白对本实验室保存的沙门氏菌、大 肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果。结果如表1所示。
[0090] 表1卵粘蛋白对沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)
[0092] 注：表示葡萄糖-酚红肉汤培养基未变色；"+"表示葡萄糖-酚红肉汤培养基变 成黄色，有菌落生长
[0093] Note :''-''represent that the color of Broth medium does not change,no bacterial grow;〃+〃represent that the color of Broth medium changed to yellow, bacterial grow.
[0094] 从表1中可以看出，卵粘蛋白对三种细菌的抗菌性有显著差异，其中对大肠杆菌和 沙门氏菌均有不同程度的抑制作用，在卵粘蛋白浓度达到〇.2mg/mL以上时，沙门氏菌培养 基不变色，表明沙门氏菌生长受到明显抑制。而在卵粘蛋白浓度达到0.050mg/mL以上时，大 肠杆菌培养基不变色，表明此时大肠杆菌生长受到明显抑制。因此，卵粘蛋白对大肠杆菌和 沙门氏菌的最小抑菌浓度分别为0.05mg/mL和0.2mg/mL。而在试验浓度度范围内，卵粘蛋白 对金黄色葡萄球菌的影响则相反，加入卵粘蛋白的实验组培养基均变为黄色，即各实验组 均有菌落生长，且培养基颜色比空白对照组颜色较深，表明此时菌体生长不但未受到抑制， 反而受到促进，但各浓度组的效果差异不显著(P>〇.05)。因此卵粘蛋白对金黄色葡萄球菌 无明显抑制作用。
[0095] 2.4卵粘蛋白对细菌生长曲线的影响
[0096] 采用比浊法测定了不同浓度卵粘蛋白对三种细菌生长曲线的影响，结果分别如图 2,图3,图4所示：
[0097] 由上述各图可以看出，卵粘蛋白对实验用三种细菌生长曲线的影响比较显著。且 在图2中可以看出，加入0.05mg/mL卵粘蛋白后大肠杆菌的生长曲线在整个生长周期均位于 对照组之下。表明大肠杆菌在整个生长周期的过程中均受到明显抑制。在图3中，沙门氏菌 在适应期和对数期受到抑制。因此，卵粘蛋白对沙门氏菌的发挥作用方式是延缓菌体的对 数期，无明显杀菌活性。而卵粘蛋白对金黄色葡萄球菌(图4)则无明显抑制作用。
[0098] 2.5卵黏蛋白体外抗病毒活性评价
[0099] 2.5.1受试病毒株的毒力
[0100]将出他受试病毒株感染敏感细胞后每天倒置显微镜下观察细胞的形态变化，以7d 内出现细胞病变的样品孔为阳性孔，计算实验病毒株的TCID5Q，并测定毒株的血凝效价。结 果发现HiNi受试病毒株的血凝效价为1:320，TCID 5Q为ΚΓ3·4。
[0101] 2.5.2不同样品对鸡红细胞的毒性
[0102] 分别对卵粘蛋白进行稀释，研究不同浓度稀释液对HiNi-MDCK细胞的毒性，结果如 表2。
[0103]表2鸡蛋卵粘蛋白对鸡红细胞的细胞毒性
[0105]注：表示发生血凝，不沉积；"+"轻微血凝；"++"不发生血凝，细胞完全沉积 [0106]由表所示，当卵粘蛋白浓度为5mg/mL或低于5mg/mL时，对鸡血红细胞无毒性作用， 但当卵粘蛋白浓度达到10mg/mL以后，细胞不能发生正常的沉积作用，而平铺在微量血凝板 的V型孔中，因此认为10mg/mL卵粘细胞对红细胞有细胞毒性作用。
[0107] 不同浓度卵粘蛋白对新城疫病毒的血凝效价随浓度升高而降低，对新城疫病毒的 血凝效价抑制率随浓度增加而上升。说明鸡卵粘蛋白对新城疫病毒具有很强的抑制作用。
[0108] 二、鸡蛋卵转铁蛋白（卵伴白蛋白）分离纯化及体外抗菌研究
[0109] 国内外有关于从鸡蛋清中分离提取活性物质已有较多研究和报道，且已有相关的 工业化生产并产生了良好的经济效益，如溶菌酶，免疫球蛋白等。而从鸡蛋清中提取卵转铁 蛋白的研究主要还停留在实验室规模，并未实现工业化生产，研究进展相对缓慢。本实验采 用两步超滤法分离提取卵转铁蛋白，经冷冻干燥后得到产品，为工业生产提供参考。
[0110] 1材料与方法
[0111] 1.1材料
[0112] 1.1.1原材料
[0113] 鲜鸡蛋金翼蛋品有限公司提供 [0114]卵转铁蛋白标准品sigma中国公司 [0115] 供试菌种：
[0116]金黄色葡萄球菌（Staphylovovvus aure，ATCC 29213)
[0117] 大肠杆菌(Escherichia coli，ATCC 25922)
[0118] 沙门氏菌(Salmonella，CICC 21382)均由本实验室保存。
[0119] 1.1.2主要试剂
[0122] 1.2实验方法
[0123] 1.2.1卵转铁蛋白超滤分离的工艺流程，如图5所示。
[0124] 1.2.2超滤装置及操作要点
[0125] 连接好超滤装置，预先通过0.2MPa超纯水压力持续lh，待水流通量稳定后，测定超 滤膜初始纯水通量，超滤完毕后，取出超滤膜进行蒸馏水冲洗，并用0.1M NaOH和0.1M HC1 浸泡30min，最后用蒸馏水反复冲洗，再次测定膜纯水流通量，保证其初始通量达到98 %以 上。
[0126] 新鲜鸡蛋清原液，0.9生理盐水稀释，3000r/min离心15min去除卵粘蛋白，再用等 电点盐析除去卵白蛋白。经离心和等电点沉淀的样品微滤除去〇. 1 -1 OOwn范围的杂质，进而 采用超滤技术，用聚砜树脂衍生物膜(截留分子量lOOkDa)去除lOOkDa以上大分子蛋白质， 再用聚砜树脂衍生物膜(截留分子量50kDa)截留分子量大于50kDa的蛋白质，得浓缩液，之 后得到的浓缩液进行透析处理，并冷冻干燥
[0127] 1.2.3前处理对蛋清液粘度的影响
[0128] 1.2.3.1稀释倍数对蛋清液黏度的影响
[0129] 取适量蛋清液，用0.9 %的NaCl溶液稀释，稀释倍数分别为5倍，10倍，15倍，20倍， 25倍，3000r/min冷冻离心10min，取上清液测定蛋清黏度。
[0130] 1.2.3.2剪切速率对蛋清液黏度的影响
[0131 ]稀释后的蛋清分别在4000r/min，5000r/min，6000r/min，7000r/min，8000r/min 高 速分散均质器上进行均质，分别测定蛋清液黏度，考察均质对蛋清液黏度的影响。
[0132] 1.2.3.3温度对蛋清液黏度的影响
[0133] 将经过稀释的蛋清液分别加热到30°C，35°C，40°C，45°C，50°C，测定不同温度下蛋 清液的黏度，研究温度对蛋清液黏度的影响。
[0134] 1.2.4超滤工艺条件的研究
[0135] 1.2.4.1物料稀释倍数对卵转铁蛋白分离的影响
[0136]将鸡蛋液搅拌速率固定为125r/min，操作压力为0 . lOMPa，pH值为6以体积比5倍， 10倍，15倍，20倍进行稀释，以单位时间膜通量为评价指标，考察蛋清液稀释倍数对卵转铁 蛋白膜分离效果的影响。
[0137] 1.2.4.2搅拌速率对卵转铁蛋白分离的影响
[0138] 固定鸡蛋清液稀释倍数为10倍(v/v)，超滤装置操作压力为0. lOMPa，溶液pH值为 6。搅拌速率分别为50r/min，125r/min，200r/min，以单位时间膜通量为评价指标，研究搅拌 速率对鸡蛋清卵转铁蛋白膜分离效果的影响。
[0139] 1.2.4.3操作压力对卵转铁蛋白分离的影响
[0140]固定鸡蛋清液稀释倍数为10倍(v/v)，搅拌速率为125r/min，pH值为6,操作压力分 别为0.05MPa，0. lOMPa，0.15MPa，以单位时间内膜通量为评价指标，研究操作压力对蛋清卵 转铁蛋白膜分离效果的影响。
[0141] 1.2.4.4pH值对卵转铁蛋白分离的影响
[0142] 固定鸡蛋清液稀释倍数为10倍(v/v)，搅拌速率为125r/min，超滤装置操作压力为 0· lOMPa。用0· lmol/L NaOH和0· lmol/L HC1分别将蛋清液的pH值调至6、7、8,以单位时间内 膜通量为评价指标，研究pH值对卵转铁蛋白分离效果的影响。
[0143] 1.2.5相对黏度的测定
[0144] 使用乌氏黏度计测定。参考文献尹业平、王辉宪2007。
[0145] 1.2.6膜通量的测定
[0146] 用来表征超滤膜过滤料液的速率，是衡量膜性能的重要指标。
[0147] 膜通量率计算公式：
[0149] 式中J:膜通量，L· (m'h'Q:通过量，L;t:操作时间，h;A:膜面积，m2
[0150] 1.3SDS-PAGE 电泳
[0151]凝胶制备:配置分离胶浓度为10%、浓缩胶浓度为5%。
[0152] 样品处理:将样品用缓冲液配成lmg/mL浓度，电泳前沸水加热3~5min。
[0153] 电泳条件:浓缩胶中恒压80V，待样品进入分离胶调整电压至120V，恒压lh。
[0154] 1.4反向高效液相色谱(RT-HPLC)检测卵转铁蛋白
[0155] 将lmg/mL卵转铁蛋白做标样，色谱柱选用Vydac214TP54C4柱。
[0156] 1.5卵转铁蛋白的鉴定与纯度分析
[0157] 将透析的蛋清液、层析后的收集液先经过10 %的SDS-PAGE电泳对卵转铁蛋白进行 鉴定，然后通过HPLC测定纯度。
[0158]蛋白质样品的预处理:取蛋白质样液与样品处理液等体积混匀，在100°C水浴中处 理2min，冷却室温后备用。
[0161] 1.6数据分析
[0162] 采用Excel建立数据库，用0rigin7.5版本软件绘图，用DPS200，SAS8.1数据处理软 件进行数据分析。
[0163] 2实验结果与分析
[0164] 2.1降低蛋清黏度的单因素实验
[0165] 2.1.1稀释倍数对蛋清液黏度的影响结果
[0166] 采用先稀释后均质的方法，蛋清液经生理盐水稀释后均质，不仅降低了蛋清液的 黏度，而且破坏了其复杂的结构，从而使蛋清液过滤速度较快，膜清洗较为容易，降低了膜 的污染程度，延长了膜的使用寿命
[0167] 由图6可以看出，蛋清液的相对黏度随稀释倍数的增加而下降，稀释倍数从5倍大 15倍，黏度下降明显。进而缓慢，趋近于时间轴，确定最佳倍数15倍。
[0168] 2.1.2剪切速率对蛋清液黏度的影响结果
[0169]蛋清经稀释后，蛋液的黏稠度还有可能阻塞活污染超滤膜，因此采用高速分散均 质机来降低蛋清液黏度。经过高速分散均质后的蛋白，相对黏度下降很快，如图7所示：
[0170] 2.1.3温度对蛋清液黏度的影响结果
[0171]温度升高可降低蛋清液黏度，但温度过高又会造成蛋白质变性，因此考察温度对 蛋清液黏度的影响。如图8所示：
[0172]如图8所示，随着温度的升高，蛋清液黏度下降很明显。但当温度过高，超过45°C 后，卵转铁蛋白的黏度迅速增大，这和蛋清液中蛋白因高温而改变结构有关。因此实验选择 45 °C为适宜操作温度。
[0173] 2.1.4膜通量的单因素试验
[0174] 2.1.4.1物料稀释倍数对分离卵转铁蛋白膜通量的影响结果
[0175] 膜通量随着超滤时间的延长而逐渐降低，前lOmin内膜通量下降均较快，lOmin后， 膜通量下降较为平缓。当稀释倍数确定为15倍时，滤液的浓差极化现象较平缓且设备运行 较稳定，因此稀释倍数控制在15倍以内（v/v)。
[0176] 2.1.4.2搅拌速率对分离卵转铁蛋白膜通量的影响结果
[0177]膜通量随着蛋清液超滤的进行，下降较为平缓。搅拌速率为50r/min时超滤系统运 行平稳，但膜通量低。搅拌速率为125r/min时流通量下降较慢，相对流通量较大。搅拌速率 为200r/min时膜通量下降较快，且超滤后期流通量下降较快。综合考虑，将搅拌速率控制在 125r/min 左右。
[0178] 2.1.4.3操作压力对分离卵转铁蛋白膜通量的影响结果
[0179] 随着滤液超滤时间的延长，蛋清液浓差极化现象加重，膜通量变小。当操作压力在 0.15MPa时，处于相对平稳的流通状态，且在一定程度上一直滤液浓差极化现象。
[0180] 2.1.4.4pH值对分离卵转铁蛋白膜通量的影响结果
[0181] 随着超滤时间的延长，滤液的膜通量迅速下降，当pH为7时，整体超滤系统处于相 对稳定状态。
[0182] 2.1.5超滤最佳条件的优化结果
[0183] 实验选取操作压力、稀释倍数、搅拌速率3个因素进行正交实验，以单位时间内膜 通量为考察指标，对超滤工艺条件进行优化。经组合实验发现，影响超滤膜通量的主次顺序 为操作压力 > 稀释倍数>搅拌速率，最优组合为超滤装置压力为〇.15MPa，溶液稀释倍数10 倍，搅拌速率为125以11^11。此时膜通量值为39.80。
[0184] 2.1.6SDS-PAGE 电泳结果
[0185] 冻干后获得的卵转铁蛋白样品主要是78KDa左右的卵转铁蛋白和45KDa左右的卵 清蛋白，还有点杂蛋白条带，原因可能是部分卵转铁蛋白与其他蛋白以结合态形式存在，不 易分开。
[0186] 2 · 1 · 7RT-HPLC 分析结果
[0187] 2.1.8体外抗菌研究
[0188] 表3卵转铁蛋白和防腐剂的抑菌活性比较
[0190] 注：牛津杯法又称管蝶法，抑菌圈直径兰20mm为极敏感"+++"，15mm兰抑菌圈直径 兰20mm为高敏感"++"，10mm兰抑菌圈直径兰15mm为中敏感"+"，抑菌圈直径兰10mm为低敏或 无效"一"
[0191 ]由表可知，卵转铁蛋白对大肠杆菌抑菌效果最强，对沙门氏菌次之，对金黄色葡萄 球菌抑菌效果相对较弱。
[0192] 三、鸡蛋免疫球蛋白提取纯化及体外抑菌效果
[0193] 鸡卵黄免疫球蛋白，简称IgY，又称鸡卵黄抗体。具有免疫原性，在蛋黄中以α-、β- 和γ-卵黄球蛋白三种形式存在。目前国际上采用的IgY分离纯化方法主要包括水稀释法、 有机溶剂抽提沉淀法、超滤、超临界萃取法与冻融等物理化学法及盐析与DEAE色谱相结合 等方法。本实验在首先实验室中操作，因此前期研究已水稀释法为基础，并结合聚乙二醇沉 淀以及DEAE-Toyopearl 650M-步洗脱离子交换层析进行纯化，得到高回收率高纯度的鸡 卵黄IgY。
[0194] 1 方法
[0195] 1.1粗IgY 制备
[0196] 1.1.1水稀释法获得水溶性组分(WSF)
[0197] 选取新鲜鸡蛋，采用蛋清蛋黄分离器，分离得到蛋黄，用蒸馏水将蛋黄洗净，置于 滤纸上吸干，刺破蛋黄膜，收集蛋黄液，以体积百分比计，用蒸馏水对蛋黄进行不同倍数的 稀释(2倍，4倍，6倍，8倍，10倍)搅拌均匀，调节不同pH值(4.6、4.8、5.0、5.2、5.4)，4°C静置 不同时间（2h、4h、6h、8h、10h)，5000 X冷冻离心30min后，得澄清上清液含IgY水溶性组分 (ffSF)〇
[0198] 1.1.2PEG 沉淀蛋白
[0199] 向所得的WSF中加入不同质量分数的PEG6000,磁力搅拌器搅拌30min，22000Xg冷 冻离心，收集沉淀。
[0200] 1.1.3透析
[0201]收集沉淀加入一定量的蒸馏水，搅拌，装入透析袋(截留分子量为8000-14000KD) 中，4°C透析除去部分残留PEG6000,冷冻干燥即得粗IgY组分。
[0202] 1 · 1 · 4离子交换色谱法纯化IgY
[0203] 用Na2HP〇4_NaH2P〇4缓冲液平衡，设置pH值为6.0，7.0，8.0条件下不同缓冲液离子 强度（0.03111〇1凡、0.051]1〇1凡、0.11]1〇1凡）上样平衡、恒流洗脱（0.0751]1〇1凡，0.11]1〇1凡），通过 对比研究确定最佳缓冲液pH和洗脱液离子强度。洗脱流出液按每管5ml/3min自动收集。将 层析所收集的组分装入透析袋(截留分子量为8000-14000KD)，置于蒸馏水中，4°C透析除 盐。
[0204] 1.1.5蛋白质含量测定
[0205] 1.1.5.1粗蛋白含量测定以牛血清白蛋白为标准蛋白质，用考马斯亮蓝法测定蛋 白质含量。
[0206] 1.1.5.2粗 IgY 含量测定
[0207] 测定样品280nm下吸光值。
[0208] 1.1.6IgY 纯度测定
[0209] SDS-PAGE凝胶电泳分析，5 %的浓缩胶，10 %的分离胶，浓缩胶电泳电压80V，分离 胶电压120V，电泳样品用G250考马斯亮蓝染色后再按照标准程序褪色。利用Lab-Image软件 推算IgY纯度。
[0210] 1.1.7IgY回收率测定
[0211] IgY回收率公式计算：
[0213] 2实验结果
[0214] 2.1不同稀释倍数对IgY分离效果的影响
[0215]分别取15mL蛋黄液，用不同量的无菌水稀释，搅拌均匀，稀释倍数为2,4,6,8，10 倍，考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，确定最佳稀释倍数为8倍，蛋白质含量为375.27mg/mL。 [0216] 2.2不同pH对IgY分离效果的影响
[0217] 上清液中蛋白质含量在pH5 · 0-5 · 6时回收率较高，均在300mg/mL以上，其中pH5 · 2 时达到最高值321.57mg/mL。
[0218] 2.3SDS-PAGE 凝胶电泳
[0219] 2.4IgY抗菌实验效果
[0220] IgY对大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌生长曲线抗菌效果：
[0221] 当在细菌液中加入IgY和优尔蛋白后，IgY和优尔蛋白对枯草芽饱杆菌和大肠杆菌 在生长初期有明显的抑制作用，试验组和对照组的0D值有明显的差异。而经过24小时后的 抑制作用下降，推测是由于温度对其的影响导致IgY的失活，从而使IgY成为菌株的氮源有 利于菌株得生长。IgY对于金黄色葡萄球菌抑制作用不明显，对照组的0D值较实验组的值 小。
[0222] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种蛋白提取和分离纯化方法，其特征在于，所述蛋白提取和分离纯化方法包括卵 粘蛋白分离纯化方法、鸡蛋卵转铁蛋白分离纯化方法和鸡蛋免疫球蛋白提取纯化方法； 所述卵粘蛋白分离纯化方法采用GaCL2或MgCl2制备卵粘蛋白； 所述鸡蛋卵转铁蛋白分离纯化方法包括:新鲜鸡蛋清原液，〇. 9生理盐水稀释，3000r/ min离心15min去除卵粘蛋白，再用等电点盐析除去卵白蛋白；经离心和等电点沉淀的样品 微滤除去0.1-IOOlWi范围的杂质，进而采用超滤，用聚砜树脂衍生物膜去除IOOkDa以上大分 子蛋白质，再用聚砜树脂衍生物膜截留分子量大于50kDa的蛋白质，得浓缩液，得到的浓缩 液进行透析处理，并冷冻干燥； 所述鸡蛋免疫球蛋白提取纯化方法采用已水稀释法结合聚乙二醇沉淀以及DEAE-Toyopearl 650M-步洗脱离子交换层析进行纯化，得到高回收率高纯度的鸡卵黄IgY。2. 如权利要求1所述的蛋白提取和分离纯化方法，其特征在于，所述卵粘蛋白分离纯化 方法包括以下步骤： 全蛋清搅拌均匀后加5倍体积的盐溶液，0.05mol/LMgCl2或O.lmol/L NaCl，均质后用 O.lmol/L HCl调pH=6.0,4°C静置过夜，15,000g离心10min，4°C，沉淀用0.5mol/L NaCl重 悬，4°C放置4h，15，000 g离心10min，4°C，将得到的沉淀双蒸水洗涤至上清中不含蛋白质， 沉淀部分即为卵粘蛋白粗提物； 粗提物溶解于I Ommo 1/L硼酸盐酸缓冲液pH=9.6中配成5mg/ml溶液，4 °C搅拌过夜，0.45 μπι微孔滤膜过滤后进行凝胶层析，洗脱液为含0.2 mol/LMgCl2的Tris-HCl缓冲液，20mmol/ L，pH=8.4，流速0.5ml/min;收集各洗脱峰的冻干样品经SDS-PAGE进行鉴定，目标组分冷冻 干燥后-20 °C保存。3. 如权利要求2所述的蛋白提取和分离纯化方法，其特征在于，所述卵粘蛋白对大肠杆 菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度分别为〇. 〇5mg/mL和0.2mg/mL。4. 如权利要求1所述的蛋白提取和分离纯化方法，其特征在于，所述鸡蛋卵转铁蛋白分 离纯化方法包括： 连接好超滤装置，通过〇. 2MPa超纯水压力持续Ih，待水流通量稳定后，测定超滤膜初始 纯水通量，超滤完毕后，取出超滤膜进行蒸馏水冲洗，并用0.1 M NaOH和0.1 M HCl浸泡 30min，最后用蒸馏水反复冲洗，再次测定膜纯水流通量； 新鲜鸡蛋清原液，〇 .9生理盐水稀释，3000r/min离心15min去除卵粘蛋白，再用等电点 盐析除去卵白蛋白； 经离心和等电点沉淀的样品微滤除去0.1 -1 OOym范围的杂质，进而采用超滤技术，用聚 砜树脂衍生物膜去除IOOkDa以上大分子蛋白质，再用聚砜树脂衍生物膜截留分子量大于 50kDa的蛋白质，得浓缩液，之后得到的浓缩液进行透析处理，并冷冻干燥。5. 如权利要求4所述的蛋白提取和分离纯化方法，其特征在于，所述蛋白提取和分离纯 化方法的超滤装置压力为0.15MPa，0.9生理盐水稀释倍数为10倍，搅拌速率为125r/min， 此时膜通量值为39.80，pH为7。6. 如权利要求1所述的蛋白提取和分离纯化方法，其特征在于，所述鸡蛋免疫球蛋白提 取纯化方法包括： 选取新鲜鸡蛋，采用蛋清蛋黄分离器，分离得到蛋黄，用蒸馏水将蛋黄洗净，置于滤纸 上吸干，刺破蛋黄膜，收集蛋黄液，以体积百分比计，用蒸馏水对蛋黄进行不同倍数的稀释8 倍搅拌均匀，调节不同pH值5.0~5.6，4°C静置，5000 X冷冻离心30min后，得澄清上清液含 IgY水溶性组分WSF; 向所得的WSF中加入不同质量分数的PEG6000,磁力搅拌器搅拌30min，22000Xg冷冻离 心，收集沉淀； 透析，收集沉淀加入蒸馏水，搅拌，装入透析袋，截留分子量为8000-14000KD中，4 °C透 析除去部分残留PEG6000,冷冻干燥即得粗IgY组分； 离子交换色谱法纯化IgY，用Na2HP〇4_NaH2P〇4缓冲液平衡，缓冲液离子强度上样平衡、恒 流洗脱，洗脱流出液按每管5ml/3min自动收集;将层析所收集的组分装入透析袋截留分子 量为8000-14000KD，置于蒸馏水中，4°C透析除盐。
【文档编号】C07K1/30GK105949300SQ201610344942
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】杨涛, 刘岩, 都韧宁, 于寒松
【申请人】吉林厚德食品有限公司