金鲳鱼内脏蛋白酶的分离方法、蛋白酶及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及鱼类加工领域，具体涉及金鲳鱼内脏蛋白酶的分离方法，还涉及采用上述分离方法得到的蛋白酶及其应用。
【背景技术】
[0002]随着金鲳鱼需求量的大量增加，加工过程有大量下脚料产生并且基本都没有开发利用，其中占金鲳鱼体重的5%?8%的内脏更是如此。这不仅造成了水产资源的巨大浪费还造成了严重的环境污染。因此，金鲳鱼内脏的高值利用是一个亟待解决的问题。
[0003]蛋白酶是生物体内的一类酵素(酶)，它们能够分解蛋白质，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。蛋白酶的提取主要来自植物，动物和微生物中，但是在海洋和水产资源中提取的蛋白酶没有得到广泛应用。如今，鱼类蛋白水解酶在食品加工的需求日益增大。内脏作为渔业产业中主要的副产品之一，在提取和应用消化酶方面具有广泛的生物技术潜能，尤其是在宽范围PH和温度条件下具有高活性和在较低浓度下表现出高的催化活性的蛋白酶。鱼类蛋白酶的这些特征使它们在食品加工过程中有广泛的应用前景。
[0004]明胶是动物体内的胶原蛋白经过降解处理后获得的分子量主要分布在2-20万道尔顿之间的动物蛋白，它广泛应用于食品、化工、医药等行业。根据明胶用途的不同，对明胶分子量的要求也不同。如医药工业和组织工程上使用的明胶，要求分子量较大，而在保健食品和化妆品领域需求的是分子量较小的胶原蛋白肽。但明胶具有特殊的氨基酸结构不易被蛋白酶分解，所以研宄开发降解明胶能力强且价廉的蛋白酶，是目前生产胶原蛋白肽生产过程中亟待解决的技术难题。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供金鲳鱼内脏蛋白酶的分离方法，解决了现有技术中降解明胶的蛋白酶降解能力低的技术问题，初次从金鲳鱼内脏中提取到了高效降解明胶且价廉的蛋白酶。
[0006]本发明的第二目的是提供上述分离方法得到的蛋白酶。
[0007]本发明的第三目的是提供上述分离方法得到的蛋白酶的应用。
[0008]本发明所采用的第一技术方案是，金鲳鱼内脏蛋白酶的分离方法，按以下步骤进行:
[0009]步骤1:对新鲜金鲳鱼的内脏脱脂、浸提、离心后得到蛋白酶粗酶液；
[0010]步骤2:采用硫酸铵对蛋白酶粗酶液进行粗分离得到复合蛋白酶液；
[0011]步骤3:采用SephadexG-1OO凝胶分离步骤2得到的复合蛋白酶液，得到三种不同的蛋白酶，根据出峰时间依次记为:蛋白酶组分1、蛋白酶组分2、蛋白酶组分3。
[0012]本发明所采用的第一技术方案的特点还在于，
[0013]步骤I的具体过程为:
[0014]将洗干净的新鲜金鲳鱼的内脏切成段，按照固液体积比1:2-3的比例将内脏放在4°C的丙酮中脱脂10-20min，去除脂肪，脱脂结束后用4°C的蒸馏水洗干净内脏上的丙酮；
[0015]然后将脱脂后的内脏加入到3-5倍体积的4°C的pH = 7.5的Tris-HCl缓冲溶液中，用打浆机将其充分打碎后在4°C条件下浸提2-5小时；
[0016]最后在4°C，10000-20000rpm下离心15_30min，取上清液，上清液即为蛋白酶粗酶液。
[0017]步骤2的具体过程为:
[0018]2.1，首先将硫酸铵研磨成细粉末，分别加入到蛋白酶粗酶液中至以下质量分数:25%,35%,45%,55%,65%,盐析得到粗复合蛋白酶液；
[0019]2.2，然后以酪蛋白为标准底物，利用紫外分光光度法测定不同硫酸铵质量分数下盐析得到的粗复合蛋白酶液的酶活性，选取活性最高的粗复合蛋白酶液；
[0020]2.3，将步骤2.2得到的活性最高的粗复合蛋白酶液在4°C条件下静置2-5小时，然后于4°C、10000-15000r/min下离心10_20min，丢弃上清液，沉淀用1/5-1/4蛋白酶粗酶液体积的PH7.5的Tris-Hcl缓冲溶液溶解，然后在4°C条件下，以蒸馏水为透析外液在磁力搅拌下透析24-48h，期间换蒸馏水多次，透析袋中的液体即为复合蛋白酶液。
[0021]步骤3的具体过程为:
[0022]将复合蛋白酶液用S^hadexG-1OO凝胶进行分离，分别收集每个峰的洗脱组分，得到三种不同的蛋白酶，分别用透过分子量为8000道尔顿-14000道尔顿的透析袋，对三种不同的蛋白酶透析，得到最终的蛋白酶组分1、蛋白酶组分2、蛋白酶组分3 ;其中，SephadexG-1OO凝胶分离条件为:样品浓度5_20mg/mL，上样量为l_2mL，蒸馏水为洗脱液，洗脱流速为1.5-2.0mL/min，检测波长为280nmo
[0023]本发明所采用的第二技术方案是，根据上述金鲳鱼内脏蛋白酶的分离方法制备的蛋白酶。
[0024]本发明所采用的第三技术方案是，根据上述金鲳鱼内脏蛋白酶的分离方法制备的蛋白酶在分解明胶上的应用。
[0025]本发明的有益效果为，本发明方法充分利用金鲳鱼加工过程中的生产残渣，在金鲳鱼内脏中提取到了明胶降解能力强且专一的蛋白酶，为分解明胶的蛋白酶提取开辟了新的途径，提高了金鲳鱼的利用率，实现了金鲳鱼的高附加值利用。此外，本发明方法原料成本低，生产工艺简单。
【附图说明】
[0026]图1是采用本发明的方法得到复合蛋白酶的最适pH测定实验结果曲线；
[0027]图2是采用本发明的方法得到蛋白酶各组分与胃蛋白酶及去离子水对明胶的分解效果图；其中，I为用蛋白酶组分3酶解明胶后的试样；2为用蛋白酶组分2酶解明胶后的试样；3为用蛋白酶组分I酶解明胶后的试样；4为用胃蛋白酶处理的明胶试样；5为没有经过酶解即添加去离子水的明胶试样；
[0028]图3是采用本发明的方法得到蛋白酶各组分与胃蛋白酶对牛血清蛋白的分解效果图；其中I为没有经过酶解即添加去离子水的牛血清蛋白样品；2为牛血清蛋白经胃蛋白酶酶解后的试样；3为用蛋白酶组分I酶解后的牛血清蛋白试样；4为用蛋白酶组分2酶解后的牛血清蛋白试样；5为用蛋白酶组分3酶解后的牛血清蛋白试样；
[0029]图4是采用S印hadexG-100凝胶色谱分离蛋白酶各组分的色谱图；
[0030]图5是本发明得到的蛋白酶各组分的酶活性比较图。
【具体实施方式】
[0031]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0032]本发明的金鲳鱼内脏蛋白酶的分离方法，为了保证后续步骤中酶的活性不丧失，整个分离提取蛋白酶的过程在低温下进行:采用丙酮除脂、PH7.5的Tris-Hcl缓冲溶液匀楽法从金娼鱼内脏中提出粗蛋白酶，并依次通过硫酸钱沉淀、透析、SephadexG-1OO凝胶方法对粗蛋白酶进行纯化，得到高活性并且对明胶分解具有专一性强的蛋白酶；该方法按以下步骤进行:
[0033]步骤1:原料处理
[0034]将新鲜金鲳鱼的内脏洗干净并切成段，按照固液体积比1:2-3的比例将内脏放在4°C的丙酮中脱脂10-20min，去除脂肪，脱脂结束后用4°C的蒸馏水洗干净内脏上的丙酮；
[0035]然后将脱脂后的内脏加入到3-5倍体积的4°C的pH = 7.5的Tris-HCl缓冲溶液中，用打浆机将其充分打碎后在4°C条件下浸提2-5小时；
[0036]最后在4°C，10000-20000rpm下离心15_30min，取上清液，上清液即为蛋白酶粗酶液。
[0037]步骤2:采用硫酸铵对蛋白酶粗酶液进行粗分离得到复合蛋白酶液，具体过程如下:
[0038]2.1，首先将硫酸铵研磨成细粉末，分别加入到蛋白酶粗酶液中至以下质量分数:25%,35%,45%,55%,65%,盐析得到粗复合蛋白酶液；
[0039]2.2，然后以酪蛋白为标准底物，利用紫外分光光度法测定不同硫酸铵质量分数下盐析得到的粗复合蛋白酶液的酶的活性，选取活性最高的粗复合蛋白酶液；
[0040]测试结果表明，当硫酸铵质量分数为55%时，盐析得到的粗复合蛋白