专利名称：一种快速分离纯化r-藻红蛋白、r-藻蓝蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种R-藻红蛋白、R—藻蓝蛋白快速分离纯化的方法，属于红藻分离纯化技 术领域。
技术背景藻胆蛋白是一类存在于蓝藻、红藻、隐藻和少数甲藻中的水溶性的捕光色素蛋白复合物， 在光合作用中起高效捕获和传递光能的作用，可分为别藻蓝蛋白(APC)、藻蓝蛋白(PC)、藻 红蓝蛋白(PEC)和藻红蛋白(PE)四大类。活性构象下的藻胆蛋白具有摩尔消光系数大、斯托 克位移大及荧光信号强之优点。自十九世纪八十年代藻胆蛋白被用作荧光染料用于诊断，作 为荧光染料广泛用于双色、三色和多色荧光免疫分析。同常规的荧光标记物相比，藻胆蛋白 具有安全、无毒，摩尔消光系数高，荧光量子产率高(超过90%)，背景干扰和假阳性率低， 在pH4-11的范围内稳定的特点。还作为食品或化妆品的色素、示踪剂、抗氧化剂、光敏治 疗剂及光合作用机理和进化研究、免疫增强剂等，并且这类试剂的应用范围还在不断扩大。目前，藻胆蛋白主要从藻类中提取。由于藻类细胞壁中含有多量的多糖成分和杂质，给 分离纯化带来很大困难。多数纯化方法存在纯度低、得率低、操作烦琐、耗时长等缺点。限 制了藻胆蛋白的开发和应用，同时也造成价格昂贵。藻胆蛋白及其诊断试剂主要由Molecular Probes公司、Sig腿公司等生产、销售。我国依赖进口。由于提取困难和价格昂贵，多用于 细胞流式仪，尚未应用到普及型的临床诊断。多管藻、三叉仙菜等是生长在我国沿海地区潮间带的特有海洋红藻，含有大量的R-藻 红蛋白和R-藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白。试验证明多管藻是提取R-藻红蛋白和R-藻蓝蛋白的比 较理想的试材。R-藻红蛋白是藻胆蛋白中应用最广泛的荧光染料之一；R—藻蓝蛋白是唯一 同时含有PEB和PCB的藻胆蛋白。开发R-藻红蛋白、R-藻蓝蛋白的快速大量分离纯化技术， 实现高纯度R-藻红蛋白、R-藻蓝蛋白的低成本大量制备，对于R-藻红蛋白、R-藻蓝蛋白的 研究和应用具有重要的意义。 发明内容针对现有技术的不能够同时、大量、高效提取R-藻红蛋白、R—藻蓝蛋白的缺陷，本发 明的提供一种R-藻红蛋白、R—藻蓝蛋白的快速大量分离纯化方法。 本发明的技术方案如下.---种快速分离纯化R-藻红蛋白、R —藻蓝蛋白的方法，步骤如下(1) 制备R-藻红蛋白、R—藻蓝蛋白粗提液原料为红藻，采用冻溶和低离子强度溶涨的方法，使红藻细胞解体，得R-藻红蛋白、R 一藻蓝蛋白粗提液，使R-藻红蛋白、R—藻蓝蛋白以有活性状态释放出来。(2) R-藻红蛋白、R-藻蓝蛋白的初步纯化应用硫酸铵沉淀法，将R-藻红蛋白、R藻蓝蛋白的粗提液中的R-藻红蛋白、R藻蓝蛋白 从溶液中沉淀出来，离心收集沉淀，再用缓冲液溶解并透析，除去硫酸铵；(3) 离子交换层析大量制备R-藻红蛋白、R—藻蓝蛋白将步骤(2)得到的透析液利用离子交换层析技术，用具有恒定的离子强度、pH梯度的缓冲液分步进行洗脱，先使用高pH值的缓冲液洗脱，得到R—藻蓝蛋白；再用低pH值的缓冲液洗脱，得到R-藻红蛋白。步骤(2)粗提液中的蛋白成分主要是R—藻红蛋白和R—藻蓝蛋白两种，根据藻胆蛋白 在较宽的pH范围内保持稳定的特性和二者等电点不同，利用离子交换层析技术，用具有恒 定的离子强度、pH梯度的缓冲液分步进行洗脱，先使用高pH值的缓冲液洗脱后，再用低 pH值的缓冲液洗脱，将溶液中的R-藻红蛋白和R—藻蓝蛋白完全分开，实现R-藻红蛋白、 R—藻蓝蛋白粗品的大量制备。上述步骤(1)原料红藻，优选多管藻。优选的，上述步骤(1)具体操作步骤为将冷冻的多管藻按重量体积比1: 1 (g/ml 或kg/1)加入20mM醋酸缓冲液(pH5.8)， 25'C下融化20 min，多层纱布过滤得到藻胆蛋 白粗提液，4'C10000rpm离心15min，上清液即为R-藻红蛋白、R —藻蓝蛋白的粗提液。优选的，上述步骤(2)具体操作步骤为向步骤(1)得到的R-藻红蛋白、R—藻蓝蛋 白的粗提液中加入固体硫酸铵，至浓度为50-60。/。(w/v)，放置4 5h，然后4'C 10000-12000 rpm 离心15-20min，弃去上清，沉淀重溶于20mM的醋酸缓冲液(pH5.8)中，所述沉淀与醋酸 缓冲液的比例没有严格限定，只要沉淀能够完全溶解即可。将所得溶液用20mM醋酸缓冲液 (pH5.8，含50mMNaCl)透析，收集透析液。优选的，上述步骤(3)具体操作如下将步骤(2)得到的透析液通过阴离子交换色谱 柱进行离子交换层析，该阴离子交换色谱柱是经20mM醋酸缓冲液(pH5.8，含50mMNaCI) 预平衡的，加入R—藻红蛋白、R —藻蓝蛋白透析液进行吸附，用含50mMNaCl的20mM醋 酸缓冲液(pH5.8，)洗脱过量样品，再利用不连续pH剃度洗脱，分别得到R—藻蓝蛋白和 R-藻红蛋白。所述不连续pH剃度洗脱的具体方法是先用20mM醋酸缓冲液(pH4.8，含50mM NaCl) 洗脱，洗脱速度为60mL/h，检测波长280mn，收集洗脱的蓝色液体，得到纯化的R—藻蓝蛋 白。然后用20mM醋酸缓冲液(pH4.0，含50mM NaCl)洗脱，洗脱速度为60mL/h，检测 波长280nm，收集洗脱的红色液体，得到纯化的R-藻红蛋白。经吸收光谱检测，得到的纯化R-藻红蛋白A56o/A，达到5.3、 R—藻蓝蛋白A6i8/A，达 到3.2、 Aws/A55o达1.7。(如图l、图2所示)。 一般认为，R-藻红蛋白A隨/A2犯达到4.0、 R 一藻蓝蛋白A^/A55o达到1.5以上为纯品。聚丙烯酰氨凝胶电泳检测，只有一个条带，表明 分离纯化的R-藻红蛋白、R—藻蓝蛋白没有其它蛋白的污染(如图3所示)。现有技术制备R-藻红蛋白、R—藻蓝蛋白的方法为将细胞破碎粗提液经过多次羟基磷灰 石柱，再用凝胶过滤层析，最后得到的R-藻红蛋白、R—藻蓝蛋白量少、耗时而且纯度低。 对比技术中得到的R-藻红蛋白纯度达到5.3。与现有技术的三步操作相比，本发明是将粗提 液经过一次离子交换层析，就可以得到大量纯的R-藻红蛋白、R—藻蓝蛋白溶液制品，而且 有效的降低了成本。现有技术制备R-藻红蛋白、R—藻蓝蛋白时，使用的羟基磷灰石层析多次纯化，而羟基 磷灰石柱有层析速度慢、上样少而且不能将样品中的藻红蛋白完全去除的特点，这一步是在 R-藻红蛋白、R—藻蓝蛋白提取过程中的非常耗时的。本发明针对这一现有技术的不足，用 一步离子交换层析大量制备纯度较高的R-藻红蛋白、R —藻蓝蛋白制品发明的方法不仅制备 量大，而且纯度高、耗时少。先根据R-藻红蛋白和R—藻蓝蛋白的等电点不同和离子交换层析具有上样量大、分辨率高及浓縮效应，预先用20mM醋酸缓冲液(pH5.8) +100 mM氯 化钠平衡过的阴离子柱，样品用同样缓冲液透析的藻胆蛋白粗提液，然后用20mM醋酸缓冲 液(pH4.8)洗脱，得到大量比较纯的R—藻蓝蛋白。用20mM醋酸缓冲液(pH4.0)洗脱， 得到大量比较纯的R-藻红蛋白。本发明的优良效果还在于，以多管藻为材料，经冻溶和低离子强度溶涨快速提取R-藻 红蛋白、R —藻蓝蛋白，经硫酸铵沉淀以后，使用阴离子交换层析法进行一步纯化，得到体 积大大縮小的相对较纯的R—藻蓝蛋白和高纯度的R-藻红蛋白。与传统的应用羟基磷灰石层析结合分子筛层析的复杂分离纯化程序相比，本方法克服了 难于规模化快速制备的难题，操作简便，省时省力，对设备要求简单，产率高，容易大量制 备并且大大降低了 R-藻红蛋白、R—藻蓝蛋白的制备成本，从而为将R-藻红蛋白、R —藻蓝 蛋白应用于超灵敏的生物医学检测和光合作用机理研究奠定了基础，具有很好的理论研究价 值和应用前景和经济效益。
图1本发明分离纯化的R—藻蓝蛋白的吸收光谱(实现)和荧光发射光谱(虚线)。在 540nm、 618nm处有两个吸收峰。A训/A幼。达到了 3. 2， A磁/A咖达到1. 7。用498nm激发，荧光 发射峰位于575 nm，与标准荧光发射峰相同。图2本发明分离纯化的R-藻红蛋白的吸收光谱(实现)和荧光发射光谱(虚线)。在 498nm、 540nm、 565nm处有三个吸收峰。&65/&8。达到了 5. 3。用580nm激发，荧光发射峰位 于632 nm，与标准荧光发射峰相同。图3本发明分离纯化的R—藻红蛋白、R—藻蓝蛋白溶液的活性电泳图谱。图中RPE、 RPC 分别对应R藻红蛋白、R—藻蓝蛋白。只有一个条带，进一步说明分离纯化的R藻红蛋白、R 一藻蓝蛋白没有其它蛋白的污染。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。实施例中使用的阴离子交换色谱柱为琼脂糖凝胶FF (DEAE Sepharose Fast Flow),规格 为4X20cm。 实施例1.R—藻红蛋白、R—藻蓝蛋白的快速高效分离纯化方法，步骤如下(1) R—藻红蛋白、R—藻蓝蛋白的提取 原料为天然多管藻,-20 °C冷冻保存。取冷冻保存的多管藻藻体10g，加入20mM醋酸缓冲液(pH5.8) 10ml，反复冻溶，悬 液4'C10000rpm离心15min，上清液即为R-藻红蛋白、R—藻蓝蛋白的粗提液。(2) R—藻红蛋白、R —藻蓝蛋白的初步纯化向上述步骤(2)得到的R—藻红蛋白、R—藻蓝蛋白的粗提液中加入固体硫酸铵，至浓 度为60%(w/v)，放置4h, 4°C 10000 rpm离心15 min，收集沉淀部分。将沉淀溶于20mM的 醋酸缓冲液(pH5.6)中，然后用20mM的醋酸缓冲液(pH5.6)进行透析。收集透析液。(3) 离子交换层析大量制备R-藻红蛋白、R—藻蓝蛋白将预先用20mM醋酸缓冲液(pH5.6)(含50mMNaCl)平衡过的阴离子交换柱，加入 缓冲液为20mM醋酸缓冲液(pH5.6)的R—藻红蛋白、R—藻蓝蛋白粗提液进行吸附。将吸附满R—藻红蛋白、R—藻蓝蛋白的阴离子交换柱，使用20mM醋酸缓冲液(pH5.6)冲洗阴 离子交换柱，将阴离子交换柱上过量的R—藻红蛋白、R —藻蓝蛋白冲洗掉。先用20mM醋 酸缓冲液(pH5.0)(含50mMNaCl)进行洗脱，将R—藻蓝蛋白洗脱下来，就可以得到大量 比较纯的R —藻蓝蛋白。再用20mM醋酸缓冲液(pH4.0)(含50mMNaCl)进行洗脱，将R 一藻红蛋白洗脱下来，就得到大量高度纯化的R—藻红蛋白。所得R —藻蓝蛋白的吸收光谱(实现)和荧光发射光谱(虚线)如图1。在540,、 618nm 处有两个吸收峰。A,/A洲,达到了 3.2， A训/A刷达到1.7，表明已经高度纯化。用498腦激发， 荧光发射峰位于575 nm，与标准荧光发射峰相同。所得R—藻红蛋白的吸收光谱(实现)和荧光发射光谱(虚线)如图2。在498腦、540nm、 565nm处有三个吸收峰。夂65"28。达到了 5. 3，表明已经高度纯化。用580nm激发，荧光发射 峰位于632 nm，与标准荧光发射峰相同，与标准荧光发射峰相同。的R—藻红蛋白、R—藻蓝蛋白溶液的活性电泳图谱如图3。图中RPE、 RPC只有一个条 带，进一步说明分离纯化的R藻红蛋白、R—藻蓝蛋白没有其它蛋白的污染。实施例2.如实施例1所述的R—藻红蛋白、R—藻蓝蛋白的快速分离纯化方法，不同之处在于 步骤(2)中直接加入固体硫酸铵至浓度为50% (w/v)，放置4h， 4。C10000rpm离心20min， 收集沉淀部分。
权利要求
1.一种快速分离纯化R-藻红蛋白、R-藻蓝蛋白的方法，步骤如下(1)原料为红藻，采用冻溶和低离子强度溶涨的方法，使红藻细胞解体，得R-藻红蛋白、R-藻蓝蛋白粗提液，(2)应用硫酸铵沉淀法，将上述R-藻红蛋白、R藻蓝蛋白的粗提液中的R-藻红蛋白、R藻蓝蛋白从溶液中沉淀出来，离心收集沉淀，再用缓冲液溶解并透析，除去硫酸铵；(3)将步骤(2)得到的透析液利用离子交换层析技术，用具有恒定的离子强度、pH梯度的缓冲液分步进行洗脱，先使用高pH值的缓冲液洗脱，得到R-藻蓝蛋白；再用低pH值的缓冲液洗脱，得到R-藻红蛋白。
2. 如权利要求l所述的快速分离纯化R-藻红蛋白、R—藻蓝蛋白的方法，其特征在于， 步骤(1)的原料为多管藻。
3. 如权利要求2所述的快速分离纯化R-藻红蛋白、R—藻蓝蛋白的方法，其特征在于， 具体操作步骤为将冷冻的多管藻加入pH5.8、 20mM醋酸缓冲液，25'C下融化20 min，多 层纱布过滤得到藻胆蛋白粗提液，4'C10000rpm离心15min，上清液即为R-藻红蛋白、R— 藻蓝蛋白的粗提液。
4. 如权利要求l所述的快速分离纯化R-藻红蛋白、R—藻蓝蛋白的方法，其特征在于， 步骤(2)具体操作步骤为向步骤(1)得到的R-藻红蛋白、R —藻蓝蛋白的粗提液中加入 固体硫酸铵，至浓度为50-60%(w/v)，放置4 5h，然后4°C 10000-12000 rpm离心15-20min， 弃去上清，沉淀重溶于pH5.8、 20mM的醋酸缓冲液中，将所得溶液用pH5.8、含50mMNaCl 的20mM醋酸缓冲液透析，收集透析液。
5. 如权利要求1所述的快速分离纯化R-藻红蛋白、R—藻蓝蛋白的方法，其特征在于， 步骤(3)具体操作如下将步骤(2)得到的透析液通过阴离子交换色谱柱进行离子交换层 析，该阴离子交换色谱柱是经pH5.8、含50mMNaCl的20mM醋酸缓冲液预平衡的，加入 R—藻红蛋白、R—藻蓝蛋白透析液进行吸附，用pH5.8、含50mMNaCl的20mM醋酸缓冲 液洗脱过量样品，再利用不连续pH剃度洗脱，分别得到R—藻蓝蛋白和R-藻红蛋白。
6. 如权利要求5所述的快速分离纯化R-藻红蛋白、R—藻蓝蛋白的方法，其特征在于， 所述不连续pH剃度洗脱的具体方法是先用pH4.8、含50mMNaCl的20mM醋酸缓冲液洗 脱，洗脱速度为60mL/h，检测波长280nm，收集洗脱的蓝色液体，得到纯化的R—藻蓝蛋白; 然后用pH4.0、含50mM NaCl的20mM醋酸缓冲液洗脱，洗脱速度为60mL/h，检测波长 280nra，收集洗脱的红色液体，得到纯化的R-藻红蛋白。
全文摘要
一种快速分离纯化R-藻红蛋白、R-藻蓝蛋白的方法，属于红藻分离纯化技术领域。本发明以红藻为材料，应用经冻溶和低离子强度溶涨提取R-藻红蛋白、R-藻蓝蛋白，经硫酸铵沉淀进行初步纯化，然后使用阴离子交换层析吸附富集R-藻红蛋白、R-藻蓝蛋白，并通过一步阴离子交换层析分步洗脱大量制备得到高纯度的R-藻红蛋白、R-藻蓝蛋白。本方法省去了传统的应用分子筛层析结合羟基磷灰石层析多步层析的复杂分离纯化程序，克服了难于规模化快速制备的难题，操作简便，省时省力，对设备要求简单，得率高。
文档编号C07K1/30GK101240009SQ20081001440
公开日2008年8月13日 申请日期2008年2月28日 优先权日2008年2月28日
发明者周百成, 张熙颖, 张玉忠, 陈秀兰, 颜世敢 申请人:山东大学