复合TiO₂共聚物微球的制备及其应用的制作方法

专利名称：复合TiO₂共聚物微球的制备及其应用的制作方法
技术领域：
本发明具体涉及一种复合Ti02共聚物微球的制备及其在天然产 物(大豆异黄酮)分离纯化中的应用。
背景技术：
扩张床吸附(Expanded Bed Adsorption, EBA)4支术是上世纪九十 年代发展起来的一种新型蛋白质分离纯化技术，能直接从发酵液、细 胞培养液或匀浆液中捕获目标产物，集固液分离、浓缩和初步纯化于 一个操作单元之中，减少了操作步骤，提高了产品收率，降低了纯化 费用和资本投入，被誉为近些年来出现的第 一个新的单元操作。扩张 床的操作特性介于流化床和固定床之间，吸附剂依靠液体逆流运动在 床中悬浮起来，同时吸附剂的密度和粒径具有一定的分布，因此能够 在扩张床中形成稳定的分级床层。
开发适用的扩张床吸附基质是扩张床技术应用的关键之一。应用 于扩张床技术的吸附剂基质主要有两种 一种是在一惰性的高密度核 外包上一层亲水性的天然高分子材料，如琼脂糖-石英砂、琼脂糖-不锈钢、葡聚糖-硅胶、纤维素-二氧化钛等；另一种是直接用高密度 的材料，如多孔玻璃、二氧化锆-水凝胶、全氟聚合物等。目前扩张 床基质已成功地用于大肠杆菌匀浆、包涵体，大肠杆菌培养液，酵母细 胞匀浆，酵母培养液，杂交瘤细胞培养液以及动物组织产物的提Jf又，也 可将扩张床用作生物反应器，但尚未见报道扩张床基质在天然产物分离纯化中的应用。合成共聚物作为基质在固定床层析中得到了广泛的
应用但作为扩张床吸附剂基质还鲜见报道。

发明内容
本发明的目的在于提供一种复合Ti02共聚物微球扩张床吸附基 质的制备方法及其在大豆废糖蜜分离纯化大豆异黄酮中的应用。
本发明所提供的一种复合Ti02共聚物微球的制备方法，包括以下 步骤
1) 将明胶和氯化钠加入去离子水中，加热搅拌，升温至60。C, 得到含有明胶和氯化钠的水溶液，水溶液中明胶和氯化钠的质量分数 分別为0. 5 ~ 2. 5%和4 ~ 12 %;
2) 将表面改性的Ti02加入到引发剂、单体、交联剂和致孔剂的 混合溶液中搅拌得到稳定分散的有机相溶液，其中所述的引发剂为过 氧化苯曱酰，所述的单体曱基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，所述的交联 剂为二乙蹄苯(DVB)， GMA和DVB的质量比为4~1: 1,所述的致孔 剂为聚乙二醇和乙酸丁酯的混和物，可1发剂的加入量为单体质量的 0. 5~2%， Ti02的加入量为单体质量的5~80%，致孔剂的加入量为 单体质量的50 ~ 130%;
3 )将步骤1)制得的水溶液与步骤2 )制备的有机相溶液按体积 比2~7: l混合，搅拌升温至90。C反应9h后固化、过滤、洗涤、干 燥得到共聚物微球；
4)将步骤3)制备的共聚物微球，加入到干燥的N,N-二甲基甲 酰胺(DMF)中溶胀；5 )将|3 -环糊精(|3 -CD )溶解于DMF中并迅速加入氢化钠NaH， 加入量为(3 -CD质量的0. 1 ~ 0. 5 % ,常温下于摇床中搅拌反应至无氢 气放出为止，得到|3-CD钠盐溶液；
6)将步骤4 )中溶胀好的共聚物微球加到步骤5 )中澄清透明的 P -CD钠盐溶液中，P -CD钠盐溶液的用量为共聚物微球质量的1 ~ 5 倍，于60-8(TC的水浴摇床中搅拌反应15~20h，反应结束后抽滤、 洗涤，烘干制得复合Ti02共聚物微球。
所述的复合Ti02共聚物微球的粒径为40~ 400 nm、湿真密度为 1. 1 ~ 1. 5g/cm3。
本发明所提供的一种复合Ti02共聚物微球作为扩张床吸附基质 从大豆废糖蜜中分离纯化大豆异黄酮，具体步骤如下
1 )将复合Ti02共聚物微球装张床柱后，用0. 01 ~ 0. 05mol/L , pH 5~8的磷酸盐緩冲溶液平衡吸附层析柱，并将稀释后的废糖蜜上扩 张床吸附柱；
2)吸附结束后，用去离子水洗涤柱体至洗涤液在紫外光谱仪 254nm无吸收峰；
3 )用浓度为50% ~ 80%的乙醇溶液进行梯度洗脱，洗脱体积为6 ~ 12个柱体积，分离出大豆异黄酮。
本发明具有以下有益效果
1)本发明所制备的复合Ti02共聚物微球形状规则，有利于扩张 床操作的稳定；
2 )本发明所制备的复合Ti02共聚物微球基质具有适宜的密度和粒径分布，适用于扩张床；
3) 本发明所制备的复合Ti02共聚物微球的密度和粒径大小可以 调节，可以满足不同应用环境的需要；
4) 本发明的制备工艺简单，易于控制和放大；
5) 本发明所制备的复合Ti02共聚物微球基质洗脱条件温和，生 物相容性好，亲水性好，在天然产物分离纯化方面具有广泛的应用前 景。
以下结合具体实施方式
对本发明作进一步说明。
具体实施方式
实施例1
1)于装有搅拌器、冷凝管和温度计的1 L三口烧瓶中加入4g 明胶、21g氯化钠和500g去离子水，升温至60°C搅拌半小时；
2 )将30g表面改性的TiOz加入到lOOg曱基丙烯酸缩水甘油面旨、 64g二乙烯苯、1.4g过氧化苯曱酰、44. 2g聚乙二醇400和18g乙酸 丁酯的混合溶液中，搅拌得到稳定分散的有机相溶液；
3)将步骤2)得到的有机相溶液緩慢加入到步骤1)得到的水 相中，调节搅拌转速至350 rpm，维持转速不变，60。C下悬浮分散45 min,升温至9(TC,保温9h,固化得到白色微球，过滤，热水洗涤5 遍，丙酮抽提除去致孔剂，真空干燥至恒量，得到共聚物微球；
4 )称取100g步骤3 )制备的共聚物微球，加入到干燥的N, N-二曱基曱酰胺(謝F)中溶胀过夜；
5 )将100g P -环糊精(p -CD )溶解于DMF中并迅速加入0. 2g氬化钠(NaH)，常温下于普通摇床中搅拌反应至无氬气;^丈出时为止； 6)将步骤4)中溶胀好的共聚物微球加到步骤5)得到的澄清 透明的P-CD钠盐溶液中，于70。C的水浴摇床中搅拌反应20h,反应 结束后真空泵抽滤，固体产物先用画F淋洗两遍，再用大量热水洗涤 直至用紫外光谱仪检测洗涤液无吸收时为止，通过筛分得到粒径分布 为58~ 320jum ,密度为1. 21g/mL的复合Ti02共聚物微球。
用制得的复合Ti02共聚物微球装柱，装填高度为12cm,用 0. Olmol/L， pH=6. 8的磷酸盐緩冲液在线性流速220cm/h,膨胀比2. 1 条件下平衡吸附层析柱后，将稀释后的大豆废糖蜜上样。吸附结束后， 用去离子水洗涤3个柱体积，至洗涤液在紫外光谱仪254nm无吸收峰， 然后照固定床模式用浓度为55%~70°/。的乙醇溶液进行梯度洗脱，洗 脱体积为8个柱体积。得到的大豆异黄酮经HPLC ^r测纯度为63. 51 %。
实施例2
1) 于装有搅拌器、冷凝管和温度计的1L三口烧瓶中加入4g明 胶、21g氯化钠和500g去离子水，升温至6(TC搅拌半小时；
2) 将50g表面改性的Ti02加入到lOOg甲基丙烯酸缩水甘油酯、 55g二乙烯苯、1.4g过氧化苯曱酰、90. 2g聚乙二醇400和36. 5g乙 酸丁酯的混合溶液，搅拌得到稳定分散的有机相溶液；
3)步骤2)得到的有机相溶液緩慢加入到步骤1)得到的水相 中，调节搅拌转速至480 rpm,维持转速不变，60。C下悬浮分散45 分钟，升温至90。C,保温9h,固化得到白色微球，过滤，热水洗涤5遍，丙酮抽提除去致孔剂，真空干燥至恒量，得到共聚物微球；
4 )称取80g共聚物微球，加入干燥的N， N-二曱基甲酰胺(画F ) 中溶胀过夜；
5 )将120g P -环糊精(|3 -CD )溶解于DMF中并迅速加入0. 45g 氢化钠(NaH)常温下，于普通摇床中搅拌反应至无氢气放出时为止；
6 )将步骤4 )中溶胀好的共聚物微球加到步骤5 )得到的澄清透 明的P-CD钠盐溶液中，于80。C的水浴摇床中搅拌反应18h,反应结 束后真空泵抽滤，固体产物先用画F淋洗两遍，再用大量热水洗涤直 至用紫外光谱仪检测洗涤液无吸收时为止，通过筛分得到粒径分布为 40~ 380jum ,密度1. 33g/mL的复合1402共聚物微球。
用制得的复合Ti02共聚物微球装柱，装填高度为17cra，用 0. Olmol/L, pH=6. 8的磷酸盐緩冲液在线性流速250cm/h,膨胀比2. 5 条件下平衡吸附层析柱后，将稀释后的大豆废糖蜜上样。吸附结束后， 用去离子水洗涤3个柱体积，至洗涤液在紫外光谱仪254腿无吸收峰， 然后照固定床模式用浓度为55%~70%的乙醇溶液进行梯度洗脱，洗 脱体积为6个柱体积。得到的大豆异黄酮经HPLC检测纯度为66.83 %。
权利要求
1、一种复合TiO2共聚物微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤1)将明胶和氯化钠加入去离子水中，加热搅拌，升温至60℃，得到含有明胶和氯化钠的水溶液，水溶液中明胶和氯化钠的质量分数分别为0.5～2.5％和4～12％；2)将表面改性的TiO2加入到引发剂、单体、交联剂和致孔剂的混合溶液中搅拌得到稳定分散的有机相溶液，其中所述的引发剂为过氧化苯甲酰，所述的单体为甲基丙烯酸缩水甘油酯GMA，所述的交联剂为二乙烯苯DVB，GMA和DVB的质量比为4～1∶1，所述的致孔剂为聚乙二醇和乙酸丁酯的混和物，引发剂的加入量为单体质量的0.5～2％，TiO2的加入量为单体质量的5～80％，致孔剂的加入量为单体质量的50～130％；3)将步骤1)制得的水溶液与步骤2)制备的有机相溶液按体积比2～7∶1混合，搅拌升温至90℃反应9h后固化、过滤、洗涤、干燥得到共聚物微球；4)将步骤3)制备的共聚物微球，加入到干燥的N，N-二甲基甲酰胺DMF中溶胀；5)将β-环糊精β-CD溶解于DMF中并迅速加入氢化钠NaH，加入量为β-CD质量的0.1～0.5％，常温下于摇床中搅拌反应至无氢气放出为止，得到β-CD钠盐溶液；6)将步骤4)中溶胀好的共聚物微球加到步骤5)中澄清透明的β-CD钠盐溶液中，β-CD钠盐溶液的用量为共聚物微球质量的1～5倍，于60～80℃的水浴摇床中搅拌反应15～20h，反应结束后抽滤、洗涤，烘干制得复合TiO2共聚物微球。
2、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的复合 Ti02共聚物微球的粒径为40 - 400jum、湿真密度为1. 1 ~ 1. 5g/cm3。
3、 一种复合Ti02共聚物微球的应用，其特征在于，所述的复合 Ti02共聚物微球作为扩张床吸附基质从大豆废糖蜜中分离纯化大豆 异黄酮，具体步骤如下1) 用复合Ti02共聚物微球装张床柱后，用0. 01 ~ 0. 05mol/L,pH 5~8的磷酸盐緩冲溶液平衡吸附层析柱，并将稀释后的废糖蜜上扩 张床吸附柱；2) 吸附结束后，用去离子水洗涤柱体至洗涤液在紫外光谱仪 254nm无吸收峰；3 )用浓度为50% ~ 80°/ 的乙醇溶液进行梯度洗脱，洗脱体积为6 ~ 12个柱体积，分离出大豆异黄酮。
全文摘要
本发明涉及一种复合TiO₂共聚物微球的制备方法及其在天然产物分离纯化中的应用。本发明通过将含有表面改性的TiO₂、引发剂过氧化苯甲酰、单体GMA、交联剂DVB和致孔剂的油相加入到含有明胶和氯化钠的复合水相中升温固化成微球；以微球为固载母体，使β-CD在氢化钠存在下直接固载到微球上，制备出复合TiO₂共聚物微球。该共聚物微球可作为扩张床吸附基质从大豆废糖蜜中分离纯化大豆异黄酮。本发明具有制备工艺简单，易于控制和放大，所制备的复合TiO₂共聚物微球基质球形度好，洗脱条件温和，生物相容性好，亲水性好，在天然产物分离纯化方面具有广泛的应用前景。
文档编号C08F2/44GK101531734SQ20081010194
公开日2009年9月16日 申请日期2008年3月14日 优先权日2008年3月14日
发明者宋航彬, 肖正发, 袁其朋 申请人:北京化工大学