专利名称：从蓝藻中快速分离纯化c-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种从蓝藻中快速分离纯化c-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的方法，属于藻蓝蛋白分离纯化技术领域。
技术背景为了研究蛋白质等生物大分子的细胞定位、相互作用及其动态变化，研究人员急需新技 术和新材料来实现对蛋白质等生物大分子的"标识"、"阅读"和"查询"。现在常用的荧光 标记，由于荧光染料分子荧光特性的限制(荧光光谱较宽、量子产率低)，远远不能适用于 高通量的生物大分子专一标识。藻胆蛋白是一类光合作用捕光色素-蛋白质复合物，主要存在于蓝藻、红藻、隐藻和少数甲藻中。在光合作用中起捕获和传递光能的作用，具有强烈的荧光。在蓝藻和红藻中，由2-3 种藻胆蛋白组成超分子结构藻胆体,形成高效的能量传递序列。在80年代中期，美国研究藻 类光合作用的学者提出将藻胆蛋白作为荧光标记物，用于诊断试剂。由于其独特的优点，藻胆 蛋白和藻胆蛋白标记的诊断试剂在90年代初进入国际市场。同常用的荧光标记物相比，藻胆蛋白具有下列优点生产过程安全、无毒，光能吸收强， 荧光产率高，超过90%，背景光干扰和假阳性率低，在pH4-11的范围内稳定，可以作双色、 三色和四色标记。所以，这类试剂的应用范围不断扩大。但是，由于价格昂贵，尚未应用到 普及型的临床诊断试剂。我国全部进口，也仅限于用细胞流式仪进行的诊断。藻胆蛋白及其诊断试剂主要由美国生产，德国也有产品向我国推销，英国和我国台湾正 在研制。最早研制产品的是美国分子探针公司(Molecular Probes, Inc.)现在Sigma公司 共有6种藻胆蛋白产品，藻胆蛋白-Biotin/Avidin标记物12种，RPE-IgG或RPE-IgM12种，RPE 单抗标记物3种。藻胆蛋白生产沿用已公开的实验室方法。藻胆蛋白蛋白的种类包括异藻蓝 蛋白(APC)、藻蓝蛋白(PC)、藻红蓝蛋白(PEC)和藻红蛋白(PE)四大类，其中，藻蓝蛋白和藻 红蛋白根据其光谱特性不同又分为C-藻蓝蛋白(CPC)、R-藻蓝蛋白(RPC)、C-藻红蛋白(CPE)、 b-藻红蛋白(b-PE)、 B-藻红蛋白(BPE)和R-藻红蛋白(RPE)。其中存在于蓝藻中的C-藻 蓝蛋白(CPC)和异藻蓝蛋白(APC)是目前最常用的藻胆蛋白荧光探针。我国螺旋藻等蓝藻 已经开始了工业化培养，资源非常丰富，是分离纯化CPC和APC的很好的材料。国际市场上 决定购、销关系的主要是价格因素。影响普及型诊断试剂的开发和应用的主要因素也是藻胆 蛋白价格太高。因此，开发CPC和APC的快速高效分离纯化技术，实现高纯度CPC和APCE 的低成本大量制备，对于CPC和APC在普及型诊断试剂的应用具有重要的意义。 发明内容本发明针对现有技术的不足，提供一种从蓝藻中快速分离纯化c-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋 白的方法。本发明的技术方案如下从蓝藻中快速分离纯化C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的方法，步骤如下 (1) C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的提取原料为蓝藻，采用液氮研磨的方法，使蓝藻解体溶解，离心去除细胞残渣，收集上清液得到c-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白粗提液。(2) C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的初步纯化将步骤(l)的粗提液，用硫酸铵沉淀法，使c-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白从粗提液中沉淀 出来，离心收集沉淀，再用pH5.8 6.0、 20mM磷酸缓冲液溶解并透析，除去硫酸铵，即得c-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白溶液。(3) —步法制备高纯度C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白将步骤(2)制得的O藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白溶液，用离子交换层析，并用具有恒定的 离子强度、连续pH梯度的缓冲液进行洗脱，分别获得高纯度的C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白。优选的，上述步骤(1)中的原料蓝藻为单细胞蓝藻，具体选自螺旋藻或集胞藻。可以 自行培养或购买。所述步骤(1)具体操作如下取新鲜的蓝藻，按重量体积比l: 1 (g/ml或kg/1)加入液氮进行研磨磨碎，然后按鲜藻 重量体积比1: 1 (g/ml或kg/1)加入0.02mol/L磷酸缓冲液(pH5.8~6.0)，溶解，4。C下，8000 rpm 10000rpm离心10 min 15min，上清液即为C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的粗提液。所述步骤(2)具体操作如下向步骤(1)制得的C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白粗提液中加入固体硫酸铵，至浓度为55 60%(w/v)，放置5 6h，然后在4。C下，8000 rpm 10000rpm离心10 min 15min，取沉淀， 并将沉淀溶于20mM的磷酸缓冲液(pH5.8~6.0)中，将溶有沉淀的磷酸缓冲液进行透析，透 析液即为C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白溶液。上述沉淀与磷酸缓冲液的比例没有严格限定，只 要沉淀能够完全溶解即可。所述步骤(3)具体操作如下取步骤(2)制得的C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白溶液1.5 2.5ml，上琼脂糖凝胶FF (DEAE Sepharose Fast Flow)离子交换色谱柱，然后用含0.05mol/L NaCl的20mmol/L醋酸缓冲液 (pH5.6，)洗脱，再用20mmol/L醋酸缓冲液(pH5.8，含0.05mol/L NaCl)和20mmol/L 醋酸缓冲液(pH4.0，含0.05mol/LNaCl)各lOOmL进行梯度洗脱，洗脱速度为1 1.2mL/min， 洗脱曲线见图l，检测波长280nm，根据洗脱曲线分别收集蛋白峰A和蛋白峰B，得到高纯 度的C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白(图2A，图2B)。优选的，所述步骤(3)中的DEAE Sepharose Fast Flow离子交换色谱柱是经20mmol/L 醋酸缓冲液(pH5.8，含0.05mol/LNaCl)预先平衡的，规格为0.6X10cm。以上操作步骤如无特别说明，均按本领域常规操作。经吸收光谱检测，得到的纯化CPC，最大吸收峰为615nm，纯度A615/A2犯达到了 5.59; 580nm光激发，最大荧光发射峰位于640nm (图2A)。纯化的APC最大吸收峰为650nm， 纯度A650/A28o达到了 5.19; 580nm光激发，最大荧光发射峰位于660nm (图2B)。 一般 认为，A620/A2so和A650/A28o达到4.5以上，就认为CPC和APC己经纯化，因此，该一步 法离子交换层析得到的CPC和APC是高纯化的。Native—PAGE电泳检测，分离纯化的CPC 和APC分别只有一个条带，进一步表明分离纯化的CPC和APC没有其它蛋白的污染(图3)。 本发明的优良效果在于，以蓝藻为材料，应用液氮研磨快速提取CPC和APC，然后经 硫酸铵沉淀进行初步纯化，最后根据CPC和APC在较宽的pH范围内保持稳定的特性和不 同的等电点特性，利用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析技术，用恒定的离子强度、连续pH梯度的缓冲液进行洗脱， 一步法可以同时得到高纯度的CPC和APC。本方法省去 了传统的应用分子筛层析结合离子强度洗脱的离子交换层析的复杂分离纯化程序，克服了难 于规模化快速制备的难题，操作简便，省时省力，对设备要求简单，得率高，容易大量制备 并且大大降低了 CPC和APC的制备成本，从而为将CPC和APC应用于超灵敏的生物医学检测 奠定了基础，具有很好的应用前景和经济效益。
图1是钝顶螺旋藻CPC和APC连续剃度离子交换层析洗脱曲线(检测波长280)，峰A 为CPC，峰B为APC。图2A是图1的峰A中分离纯化的CPC的吸收光谱(实线)和荧光发射光谱(虚线)。 吸收峰分别为615nm， A615/A280达到了 5. 59，表明已经高度纯化。用580nm激发，荧光发 射峰位于640腦，与标准荧光发射峰相同。图2B是图1的峰B中分离纯化的APC的吸收光谱(实线)和荧光发射光谱(虚线)。 吸收峰分别为650nm， A650/A280达到了 5. 19，表明已经高度纯化。用580nm激发，荧光发 射峰位于660nm，与标准荧光发射峰相同。图3分离纯化的钝顶螺旋藻CPC和APC的聚丙烯酰氨凝胶电影(Native — PAGE)电泳 图谱，泳道1为CPC,泳道2为APC。在Native—PAGE中，CPC和APC都分别只有一个条带， 进一步说明分离纯化的CPC和APC没有其它蛋白的污染。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不仅限于此。实施例1从蓝藻中快速分离纯化C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的方法，步骤如下(1) C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的提取取新鲜的螺旋藻，按重量体积比l: 1 (g/ml)加入液氮研磨磨碎，然后按鲜藻重量体积比l: 1加入0.02mol/L磷酸缓冲液(pH5.8)，溶解，4'C下，8000 rpm离心15min，上清液即为c-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的粗提液。(2) C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的初步纯化向上述步骤(1)制得的C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白粗提液中加入固体硫酸铵，至浓度 为60%(w/v)，放置5h，然后在4'C下，10000rpm离心10 min，取沉淀，并将沉淀溶于 20mM的磷酸缓冲液(pH5.8)中，将溶有沉淀的磷酸缓冲液进行透析，透析液即为C-藻蓝 蛋白和异藻蓝蛋白溶液。(3) —步法制备高纯度C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白取步骤(2)制得的C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白溶液2.0ml，上经20mmol/L醋酸缓冲液 (pH5.8，含0.05mol/LNaCl)预先平衡的DEAE Sepharose Fast Flow离子交换色谱柱，规格 为0.6X10cm，然后用含O.05mol/L NaCl的20mmol/L醋酸缓冲液(pH5.6，)洗脱，再用 20mmol/L醋酸缓冲液(pH5.8，含0.05mol/L NaCl)和20mmol/L醋酸缓冲液(pH4.0，含 0.05mol/LNaCl)各100mL进行梯度洗脱，洗脱速度为lmL/min，洗脱曲线见图l，检测波 长280腦，根据洗脱曲线分别收集蛋白峰A和蛋白峰B，得到高纯度的C-藻蓝蛋白和异藻蓝 蛋白(图2A，图2B)。实施例2从蓝藻中快速分离纯化C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的方法，步骤如下(1) C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的提取取新鲜的集胞藻，按重量体积比l: 1 (g/ml)加入液氮研磨磨碎，然后按重量体积比 1: 1加入0.02mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)，溶解，4'C下，10000rpm离心10 min，上清液即为c-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的粗提液。(2) C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的初步纯化向上述步骤(1)制得的C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白粗提液中加入固体硫酸铵，至浓度 为55。/。(w/v)，放置6h，然后在4。C下，8000 rpm离心15min，取沉淀，并将沉淀溶于20mM 的磷酸缓冲液(pH6.0)中，将溶有沉淀的磷酸缓冲液进行透析，透析液即为C-藻蓝蛋白 和异藻蓝蛋白溶液。(3) —步法制备高纯度C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白取步骤(2)制得的C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白溶液2.5ml，上经20mmol/L醋酸缓冲液 (pH5.8，含0.05mol/LNaCl)预先平衡的DEAE Sepharose Fast Flow离子交换色谱柱，规格 为0.6X10cm，然后用含O.05mol/L NaCl的20mmol/L醋酸缓冲液(pH5.6，)洗脱，再用 20mmol/L醋酸缓冲液(pH5.8,含O.05mol/L NaCl)和20mmol/L醋酸缓冲液(pH4.0，含 O.05mol/L NaCl)各lOOmL进行梯度洗脱，洗脱速度为1.2mL/min，洗脱曲线见图1，检测 波长280nm，根据洗脱曲线分别收集蛋白峰A和蛋白峰B，得到高纯度的C-藻蓝蛋白和异藻 蓝蛋白(图2A，图2B)。
权利要求
1、从蓝藻中快速分离纯化C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的方法，步骤如下(1)原料为蓝藻，采用液氮研磨的方法，使蓝藻解体溶解，离心去除细胞残渣，收集上清液得到C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白粗提液；(2)将步骤(1)的粗提液，用硫酸铵沉淀法，使C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白从粗提液中沉淀出来，离心收集沉淀，再用pH5.8～6.0、20mM磷酸缓冲液溶解并透析，除去硫酸铵，即得C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白溶液；(3)将步骤(2)制得的C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白溶液，用离子交换层析，并用具有恒定的离子强度、连续pH梯度的缓冲液进行洗脱，分别获得高纯度的C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白。
2、 如权利要求l所述的从蓝藻中快速分离纯化C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的方法，其特 征在于，所述步骤(1)具体如下取新鲜的蓝藻，按重量体积比1: 1加入液氮研磨磨碎，然后按重量体积比1: 1加入0.02mol/L磷酸缓冲液(pH5.8 6.0)，溶解，4。C下，8000 rpm 10000rpm离心10min 15min,上清液即为c-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的粗提液。
3、 如权利要求l所述的从蓝藻中快速分离纯化C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的方法，其特 征在于，所述蓝藻为单细胞蓝藻，选自螺旋藻或集胞藻。
4、 如权利要求1所述的从蓝藻中快速分离纯化C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的方法，其特 征在于，所述步骤(2)具体操作为向上述步骤(1)得到的C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白粗 提液中加入固体硫酸铵，至浓度为55 60%，重量体积比，放置5 6h，然后在4。C下，8000 rpm 10000rpm离心10 min 15min，取沉淀，并将沉淀溶于pH5.8 6.0的20mM的磷酸缓冲 液中，将溶有沉淀的磷酸缓冲液进行透析，透析液即为C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白溶液。
5、 如权利要求l所述的从蓝藻中快速分离纯化C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的方法，其特 征在于，所述步骤(3)具体操作如下取步骤(2)制得的C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白溶液1.5 2.5ml，上DEAE Sepharose Fast Flow离子交换色谱柱，然后用pH5.6、含0.05mol/LNaCl的20mmol/L醋酸缓冲液洗脱，再 用pH5.8、含0.05mol/L NaCl的20mmol/L醋酸缓冲液和pH4.0、含0.05mol/L NaCl的 20mmol/L醋酸缓冲液各lOOmL进行梯度洗脱，洗脱速度为1 1.2mL/min，检测波长280nm，根据洗脱曲线分别收集c-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白，得到高纯度的c-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白。
6、 如权利要求5所述的从蓝藻中快速分离纯化C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的方法，其特 征在于，所述DEAE Sepharose Fast Flow离子交换色谱柱是经pH5.8、含0.05mol/L NaCl的 20mmol/L醋酸缓冲液预先平衡的，规格为0.6X lOcm。
全文摘要
一种从蓝藻中快速分离纯化C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白的方法，属于藻蓝蛋白分离纯化技术领域。本发明应用经冻溶和低离子强度溶涨快速提取C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白，然后经硫酸铵沉淀进行初步纯化，最后利用琼脂糖凝胶FF(DEAE Sepharose Fast Flow)离子交换层析技术，用恒定的离子强度、pH梯度的缓冲液进行洗脱，一步法可以得到高纯度的C-藻蓝蛋白和异藻蓝蛋白。本方法操作简便，省时省力，对设备要求简单，得率高并且大大降低了CPC和APC的制备成本，从而为将CPC和APC应用于超灵敏的生物医学检测奠定了基础。
文档编号C07K1/30GK101240010SQ20081001440
公开日2008年8月13日 申请日期2008年2月28日 优先权日2008年2月28日
发明者周百成, 张熙颖, 张玉忠, 陈秀兰, 颜世敢 申请人:山东大学