一种分离、纯化重组蛋白的方法
【专利摘要】本发明涉及一种分离、纯化重组蛋白的方法。该方法包括：在大肠杆菌系统表达目的蛋白的包涵体，用PEG沉淀法对变性包涵体进行纯化后，再进行变性、复性过程，并进一步采用色谱纯化技术，最终获得高纯度、高活性的重组蛋白产品。该方法提供了一种快速、低成本、高质量的重组蛋白的分离纯化方法。本发明提供的方法可用于表达、纯化生物大分子目的蛋白，具体包括细胞因子、酶、抗菌肽、抗体或抗体片段，尤其包括人IL?15。本发明操作简便，成本低，可应用于大规模的工业生产。
【专利说明】
一种分离、纯化重组蛋白的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种分离纯化重组蛋白的方法，具体公开了一种运用PEG沉淀与色谱 技术，从大肠杆菌系统表达纯化重组蛋白如细胞因子包括人IL-15的方法。
【背景技术】
[0002] 重组蛋白是应用重组DNA或RNA技术，在大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞 等系统获得的蛋白质。目前，生物医药领域的大多数产品均为重组蛋白类产品，例如酶、重 组细胞因子、单克隆抗体及其衍生产品等。由于大肠杆菌系统具有周期短、成本低、操作方 便等优点，成为重组蛋白的首选表达系统。然而大肠杆菌胞内缺乏合适的氧化还原环境，且 表达系统的高效率使得外源蛋白累积速率较快，使得这些蛋白不能及时折叠，从而极易形 成不可溶的包涵体。据报道，只有10%左右的哺乳动物细胞来源的蛋白在大肠杆菌系统能 够获得可溶性表达，其余大部分蛋白都以包涵体形式表达。为提高蛋白表达的可溶性，人们 尝试将麦芽糖结合蛋白（MBP)、谷胱甘肽转移酶(GST)等促溶性纯化标签与目的蛋白进行融 合表达，并在标签与目的蛋白之间添加蛋白酶识别位点，如凝血酶（Thrombin)，肠激酶 (Enterokinase)，Xa因子，烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)等，在纯化后采用相应的蛋白酶将促 溶标签切除。该方案虽然能够促进表达产物的可溶性，但酶的添加、去除及相应的验证步骤 都大大增加生产成本，因此不适合大规模的工业生产。根据已上市的生物药物的生产经验， 大肠杆菌系统生产的产品仍主要以包涵体形式表达，因此包涵体的纯化及其变性、复性过 程直接关系到大规模生产的效率及生产成本，发展新型的纯化技术，提高包涵体的纯化效 率具有重要意义。
[0003] 重组人白细胞介素15(IL-15)是一个114个氨基酸的细胞因子，含有2对分子内二 硫键。它与IL-2、IL-7在激活T细胞活化和增殖、增强免疫力方面具有类似的作用，而在刺激 记忆性T细胞、D8效应细胞及NK细胞方面更有优势。因此，IL-15作为肿瘤免疫治疗及疫苗佐 剂，具有非常好的临床应用前景，目前，世界范围内已有多项IL-15相关的临床I期及II期试 验处于研究中。但IL-15蛋白的单体不稳定，表达和纯化工艺都较困难。目前已有报道的临 床级样品采用大肠杆菌系统进行表达，产物以包涵体形式存在，大量宿主杂蛋白参与了包 涵体的形成过程，这些杂蛋白的存在不但对后续的色谱纯化造成难度，且对IL-15变性后的 复性效率造成影响，进一步降低IL-15的收率。因此，为提高IL-15重组蛋白的纯化效率，必 须首先解决包涵体的纯化问题。现有的包涵体纯化策略为高浓度盐酸胍变性条件下进行S-200分子筛层析。由于分子筛的上样量一般不超过柱体积的5%，该方法需要大量的S-200介 质，相应的缓冲液中含有高浓度的变性剂，使得操作过程费时费力，成本高昂，成为重组人 IL-15生产工艺的瓶颈。因此，改善包涵体的纯化工艺，对于提高重组人IL-15的生产水平具 有重要意义。本说明中以重组IL-15为例对本发明进行阐述，具有一定的代表性和推广价 值。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，采用PEG沉淀的方法将目的蛋白从包涵 体中进行纯化，经过复性后，结合色谱分离技术，获得高纯度和高活性的重组蛋白产品，包 括细胞因子，治疗用酶，单克隆抗体及抗体片段等。
[0005] 具体为，本发明提供一种PEG沉淀与色谱技术结合从大肠杆菌系统表达和纯化重 组细胞因子的方法，所述方法包括如下步骤：
[0006] (1)构建目的蛋白表达载体:将目的蛋白编码基因序列插入到原核表达质粒上，构 建获得目的蛋白表达载体；
[0007] (2)将步骤(1)中所得目的蛋白表达载体转化至大肠杆菌的宿主细胞，获得转化的 宿主，并在表达条件下，培养和诱导转化的宿主，从而表达目的蛋白；
[0008] (3)收集步骤(2)中表达目的蛋白的宿主菌，采用高压均质或超声波等方法破碎菌 体，并采用过滤或离心等方法分离不可溶成分，采用缓冲液洗涤后得到含有目的蛋白的包 涵体成分；
[0009] (4)在步骤(3)所得包涵体中加入变性剂进行变性，高速离心后取上清部分，得到 目的蛋白包涵体的变性液；
[0010] (5)在步骤(4)中所得溶液中加入一定浓度的PEG，使所述变性液浓度达到1 %到 25%，搅拌均匀后静置离心，大部分宿主杂蛋白存在于上清中，目的蛋白存在于沉淀中从而 得到分离；
[0011] (6)将步骤(5)中PEG沉淀后的蛋白重新溶解在变性液中，获得纯化后的目的蛋白 变性液；
[0012] (7)将步骤(6)所得目的蛋白变性液通过复性手段进行复性，得到目的蛋白的复性 溶液，所述复性手段包括稀释、透析及柱上复性；
[0013] (8)将步骤(7)中含有复性后目的蛋白依次进行疏水作用层析、离子交换层析及分 子筛层析等分离过程，除去杂蛋白，获得终产品。
[0014] 优选的，在上述步骤(4)中，首先对目的蛋白的包涵体进行变性。
[0015] 优选的，所述PEG的分子量范围为2000-20000。
[0016] 优选的，所述PEG的浓度范围为1 %-25%。
[0017] 优选的，所述变性剂为尿素或盐酸胍，所述变性剂的用量为4-8M。
[0018] 本发明另一方面还公开一种上述方法在表达、纯化生物大分子目的蛋白中的应 用。
[0019] 优选的，所述生物大分子目的蛋白为基因重组药物产品，包括细胞因子、酶、抗菌 肽、抗体或抗体片段，其中，所述细胞因子包括人IL-15。
[0020] 与现有技术相比，本发明采用PEG沉淀方法特异性地沉淀目的蛋白，由于宿主蛋白 仍存在于溶液中，从而可通过离心的方法使目的蛋白得到纯化，具体在以下几个方面表现 出优异的效果：
[0021] 1)现有的分子筛技术用于纯化变性的蛋白，受限于分子筛的分辨率较低，仍有较 多与目的蛋白分子量接近的杂蛋白不能去除，而PEG沉淀所采用的PEG分子量、溶液盐浓度 等得到优化，沉淀中目的蛋白纯度较高；
[0022] 2)现有技术中的分子筛柱层析，由于上样量一般不高于柱体积的5%，因此处理样 品时需大体积的层析柱及大量介质，成本高昂，而PEG价格便宜，用量小，因此本发明具有试 剂耗材的成本优势；
[0023] 3)现有技术中的分子筛柱层析需经过平衡，上样，洗脱的多个步骤，随着处理量的 增加所需时间也线性增加;而PEG沉淀所需的沉淀时间固定，离心速度较快，因此本发明能 够节省时间，降低成本。
【附图说明】
[0024] 图1是本发明中分离、纯化重组蛋白方法的流程图。
[0025]图2是采用本发明技术表达重组人IL-15的SDS-PAGE及Western鉴定。目的蛋白分 子量约12kDa，Western Blot使用anti-human IL-15的单克隆抗体。
[0026]图3是不同浓度PEG沉淀后，所得到上清与沉淀的SDS-PAGE。
[0027] 图4是PEG沉淀后重组人IL-15蛋白的复性SDS-PAGE分析。
[0028]图5是经过PEG沉淀纯化及复性的IL-15蛋白进行疏水作用层析的色谱图。
[0029]图6是重组人IL-15疏水作用层析的SDS-PAGE分析。
[0030]图7是IL-15蛋白进行阴离子交换层析的色谱图。
[0031]图8是IL-15蛋白进行阴离子交换层析的SDS-PAGE分析。
[0032]图9是IL-15蛋白进行分子筛层析的色谱图。
[0033]图10是IL-15蛋白进行分子筛层析的SDS-PAGE分析。
[0034]图11是对本方法纯化的重组人IL-15产品进行RP-HPLC分析。。
[0035]图12是对本方法纯化的重组人IL-15产品进行淋巴细胞瘤CTLL-2细胞增殖的活性 检测。
【具体实施方式】
[0036]以下结合附图与具体实施例进一步阐述本发明的优点。
[0037]本发明所述分离、纯化重组蛋白方法的流程可如图1所示。具体如下：
[0038] 实施例
[0039] 1.重组人IL-15的表达
[0040] (1)重组人IL-15表达载体和宿主菌的构建
[0041]人白介素_15(IL-15)的编码基因序列如SEQ ID N0.1所示，扩增片段并插入到 pET28b载体的Nco I与Xho I酶之间，转化DH5a菌株，得到表达载体pET28b/IL-15。通过测序 验证载体构建正确后，将质粒按照碱裂解法抽提并转化表达宿主菌BL21(DE3)，获得转化的 宿主菌。
[0042] (2)重组人IL-15的表达
[0043]将含有重组质粒pET28b/IL-15的表达宿主菌单菌落接种于Kan+的LB液体培养中， 37 °C 200rpm条件下培养12小时，作为种子菌。取种子菌，按1:100体积比接种于无菌的Kana+ LB培养基中，37 °C 200rpm条件下培养3小时，0D600达到1左右。加入终浓度为ImM的IPTG诱导 重组人IL-15的表达，在诱导前及诱导的1、2、3小时分别收集菌液，制备还原的蛋白电泳样 品，采用4_20%SDS_PAGE进行电泳，并用anti-human IL-15的一抗进行Western鉴定。
[0044]结果如图2所示。泳道1:蛋白质分子量标准；泳道2:重组人IL-15蛋白标准品lyg; 泳道3:大肠杆菌BL21(DE3)诱导前全菌蛋白；泳道4:诱导lh后全菌蛋白；泳道5:诱导2h后全 菌蛋白；泳道6:诱导3h后全菌蛋白。从图2中可见，经诱导后目的蛋白得到迅速表达。
[0045] 2.重组人IL-15包涵体的PEG沉淀纯化
[0046] 将诱导后的菌液进行离心收集，经过高压均质破碎后，离心获得含有重组人IL-15 的包涵体。取洗涤干净的包涵体约5g，在50m 1变性液（5OmM Tr i s-HC1，5mM EDTA，10OmM DTT，7M盐酸胍，pH 8.0)中溶解（1 OmL/g包涵体），4°C孵育2小时溶解包涵体。再23000rpm，4 °C，离心30min，上清液即IL-15变性液。将该上清分为6份，分别在磁力搅拌器上流加等体积 的预冷的2 %、5 %、10 %、20 %、30 %、40 %的roG6000，使作用体系中PEG的终浓度分别为 1%、2.5%、5%、10%、15%、20%，静置沉淀1小时后，离心分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析，如图3所示。从图中可见，在所检测的浓度范围内，PEG沉淀后都能够使大量杂蛋 白留在上清中，沉淀中的IL-15得到显著纯化。
[0047] 3.重组人IL-15蛋白的复性
[0048]采用终浓度5%的PEG沉淀后，离心收集经过纯化的蛋白，再次溶解在变性液中 (50mM Tris-HCl，5mM EDTA，7M盐酸胍，pH 8.0,新鲜添加6mM DTE)。低速摇动溶解2小时后， 12000rpm，4°C，离心30min，取上清转移到干净容器中，待进行下一步的稀释复性。
[0049] 准备预冷的复性液（100禮1^8,2!111^0了4,0.511^精氨酸，？!19.5)，新鲜添加谷 胱甘肽GSSG、GSH各ImM，采用蠕动栗将变性液缓慢滴加到50倍体积的复性液中进行稀释复 性。在滴加结束后调整复性液的pH值至7.4，添加 NaCl浓度至1.2M，待进行下一步的疏水作 用层析。由于IL-15复性后若正确折叠能够恢复高级结构，在电泳过程，与未折叠的线性IL-15 在 SDS-PAGE 中泳动速度有差异， 因此可观察到两条带，如图 4 所示。泳道 1 为还原后的重组 人IL-15标准品对照。泳道2为复性后样品。从图中可见，重组人IL-15达到部分复性，未正确 折叠的部分可在后续纯化过程中去除。
[0050] 4.重组人IL-15蛋白的柱层析纯化
[0051 ] 重组人IL-15经过PEG沉淀纯化及复性后，经过三步纯化制得纯品，分别为Butyl HP疏水作用层析，Source 15Q阴离子层析，Superdex 75分子筛层析。详细过程如下：
[0052] (1)疏水作用层析
[0053]采用GE的Butyl HP填料，将层析柱首先用 100mM Tris-HCl，2mM EDTA，0.5M L-精 氨酸，1.2M NaCl，pH7.4的缓冲液进行平衡，上样后再采用1.2M NaCl，20mM Tris-HCl， pH7.4的缓冲液洗柱至基线平，再采用线性洗脱，10个柱体积过渡到洗脱缓冲液100mM盐酸 胍，20mM Tris-HCl，pH7.4。监测电导值及280nm紫外吸收值，如图5所示。收集紫外峰值处的 蛋白溶液，进行非还原的SDS-PAGE电泳分析，如图6所示。泳道R为重组人E-15标准品对照， 泳道P为复性液，泳道1-4对应色谱图中的1-4位置。图中箭头指示位置为正确折叠的IL-15， 可见复性后的IL-15被富集，绝大部分未复性的IL-15被去除。
[0054] (2)阴离子交换层析
[0055] 采用GE的Source 15Q填料，将层析柱首先用采用50mM Tris，lmM EDTA，100mM 恥(：1，？!17.4的缓冲液进行平衡，上样后5〇111]\11^8，1111]\^0了4，1]\1恥(：1，？!17.4的缓冲液作 为洗脱缓冲液，40个柱体积进行线性洗脱，监测电导值及280nm紫外吸收值，如图7所示。收 集紫外峰值处的蛋白溶液，进行还原样品的SDS-PAGE电泳分析，如图8所示，泳道a-j对应图 7色谱图中的位置。可见泳道e、f所对应的的峰值处重组人IL-15得到纯化，可去除高分子量 的杂蛋白。
[0056] (3)分子筛层析
[0057]采用GE公司的Superdex 75pg填料，将前步纯化的蛋白浓缩后进一步去除二聚体 等高分子量杂质。监测电导值及280nm紫外吸收值，如图9所示。收集紫外峰值处的蛋白溶 液，进行非还原样品的SDS-PAGE电泳分析，如图10所示，泳道Μ为分子量Marker;泳道R为重 组人IL-15标准品对照;泳道C为阴离子交换洗脱蛋白；泳道P为阴离子交换纯化蛋白浓缩后 样品；泳道1-4对应图10色谱图中的位置。从图中可见，重组人IL-15具有很高的纯度，可采 用高分辨率的RP-HPLC进一步分析。
[0058] 5.重组人IL-15蛋白的HPLC纯度分析
[0059]将本发明方法制备的重组人IL-15产品采用RP-HPLC方法进行纯度检测，具体方法 为:A相:去离子水(0.08%TFA，0.02%FA)
[0060] B相：乙腈ACN(0 · 08 % TFA，0 · 02 % FA)
[0061 ]柱子:XBridge 8册300(：18,3.54111，250臟，此^6^;双柱串联
[0062]柱温：20 Γ [0063] 检测波长：210nm
[0064] 流速：0· 14mL/min
[0065] 方法：
[0067]以重组人IL-15标准品及其进行脱酰胺处理后的样品作为对照，根据保留时间分 析本方法所纯化的IL-15产品的纯度，其色谱图如图11所示。根据分析，重组人IL-15产品的 纯度达到95%以上，脱酰胺部分少于5%。
[0068] 6.重组人IL-15蛋白的活性分析
[0069]采用本发明方法制备的重组人IL-15产品采用CTLL-2细胞增殖实验进行产品生物 学活性检测，具体方法为:CTLL-2细胞以20000细胞/1 OOyL/孔接种到96孔板，加入不同浓度 梯度的重组人IL_15(从0.01ng/mL到lng/mL)，37°C培养48小时后，每孔加入CCK-8试剂10μ L，继续在37°C孵育1小时，检测450nm的光吸收值，采用GraphPad软件绘制四参数非线性拟 合曲线，并计算EC50的值。以重组人IL-15标准品作为对照，如图12所示。软件计算得到标准 品的EC50为0.1176ng/mL，本方法产品的EC50为0.1104ng/mL，说明本方法所获得的重组人 IL-15的生物学活性与对照品相当。
[0070]应当注意的是，本发明的实施例有较佳的实施性，且并非对本发明作任何形式的 限制，任何熟悉该领域的技术人员可能利用上述揭示的技术内容变更或修饰为等同的有效 实施例，但凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的 任何修改或等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
【主权项】
1. 一种分离、纯化重组蛋白的方法，所述方法具体包括如下步骤： (1) 在大肠杆菌系统表达目的蛋白的包涵体； (2) 将步骤（1)所得包涵体成份中加入变性剂进行变性，得到目的蛋白包涵体的变性 液； (3) 使用PEG沉淀法，纯化步骤（3)所得目的蛋白包涵体变相液，得到纯化后的目的蛋 白； (4) 在步骤(3)所得纯化后的目的蛋白中，再次加入变性液进行变性，获得纯化后的目 的蛋白变性液； (5) 将步骤(4)所得目的蛋白变性液通过复性手段进行复性，得到目的蛋白的复性溶 液； (6) 将步骤(5)所得复性后目的蛋白依次进行色谱纯化，得到终产品。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯化步骤包括:在步骤(3)所得蛋白包 涵体的变性液中，加入PEG溶液，搅拌均匀后静置一段时间，离心，沉淀，得到纯化后的目的 蛋白。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述PEG的分子量根据所纯化目的蛋白 的特征进行优化。4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述PEG在变性溶液中的终浓度范围为 1%-25%〇5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述变性剂选自尿素或盐酸胍，所述变性 剂的用量为4-8M。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述复性手段包括稀释、透析及 柱上复性。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中所述色谱纯化包括疏水作用层 析、离子交换层析及分子筛层析步骤。8. -种如权利要求1-7任一所述的方法在表达、纯化生物大分子目的蛋白中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述生物大分子目的蛋白为基因重组药物 产品，包括细胞因子、酶、抗菌肽、抗体或抗体片段，所述细胞因子包括人IL-15。
【文档编号】C07K1/30GK105884859SQ201610281661
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】朱建伟, 路慧丽, 李宁环, 陈欢欢, 江华, 谢跃庆, 史斯玮, 张蕾, 丁凯
【申请人】上海交通大学, 美国杰科实验室有限公司, 杰科（天津）生物医药有限公司