专利名称：一种重组蛋白a的分离纯化方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种以IgG的Fc片段为亲和配基的亲和层析 技术纯化重组蛋白A的方法。
背景技术：
金黄色葡萄球菌蛋白A (Staphylococcus aureus protein A, SPA)为金黄色葡萄 球菌细胞壁相关蛋白，为单链多肽结构，具有与人类和其它哺乳动物血液中免疫球蛋白分 子的Fc段特异性结合的能力，主要吸附IgG和含IgG的免疫复合物。正是因为蛋白A与 人类和其他哺乳动物的多种免疫球蛋白具有特异性结合能力，因此被广泛用作免疫学试剂 (与多种报告分子偶联后用于组织化学、WesterruELISA等的抗体检测)；与固相载体相连， 用于抗体的分离纯化；临床上用于治疗抗体相关性疾病的血液净化吸附剂等等。最早获得蛋白A的方法是从金黄色葡萄球菌中直接纯化获得，然而这种方法存在 一些问题，例如天然蛋白A只占菌体总蛋白的1.7%，难以满足大规模生产的需要，且金黄 色葡萄球菌为致病菌，大规模生产危险性较大。为避免这些问题，另一基于基因工程方法生 产重组蛋白A的工艺最近已经得到了开发。蛋白A的用途广，需求量大，但目前的情况是蛋白A主要依靠进口，如美国的 Repligen Corporation，价格昂贵。而国内在蛋白A研发方面起步较晚，产量低，成本高，产 品质量不稳定，远远不能满足市场的需求，其中最关键的问题就是纯化工艺还有待提高，因 此急需建立一种改进的适合于大规模生产的分离纯化工艺，以降低成本，提高产品质量。目前，报导的对蛋白A的纯化方法主要有两种，一种是采用IgG亲和层析的方法， 第二种则采用的是多步纯化的方法。早在1972年，Hjelm等人就提出了采用IgG亲和层析的方法纯化蛋白A。具体方法 是以交联琼脂糖凝胶为载体，采用溴化氰活化工艺，以IgG为功能基制成亲和层析柱，亲 和层析纯化蛋白A。该方法操作简单，且一步层析操作即可使纯化的蛋白A纯度达到95%。 然而，由于IgG属生物大分子，分子量大(Mr = 150000)，因此为减少空间位阻，单位体积载 体上只能偶联少量的IgG，造成亲和层析柱动态载量低，难以大规模生产，多用于实验室规 模纯化。而且偶联IgG时利用的是IgG表面大量的氨基，属于多点偶联工艺，必然导致固定 化的蛋白空间取向不均一，增大了空间位阻。US 5075423公开了一种纯化蛋白A的方法。该方法是在IgG亲和层析的基础上， 通过增加一步离子交换层析以去除痕量的污染物。然而，与上述方法存在相似的问题，IgG 亲和层析柱空间位阻大，动态载量低，成本高，难以大规模应用。Sjoquist等人在1972年提出了多步操作组合的方法纯化蛋白A，主要包括酸沉 淀，硫酸铵沉淀，超滤，DEAE弱阴离子交换层析以及凝胶过滤层析。该方法操作步骤多，纯 化过程复杂，回收率低，周期长成本高，而且凝胶过滤层析生产能力有限，这些都限制了其 大规模应用的可能。US 5314993公开了一种能大规模纯化重组蛋白A的方法，该方法包括加热处理，离子交换层析及乙醇沉淀三个步骤。该方法工艺简单，但产品回收率不高。Hammond等人也发表了一种能大规模纯化重组蛋白A的方法，该方法包括加热处 理，除盐柱除盐，DEAE弱阴离子交换层析以及苯基疏水作用层析，该方法操作复杂，总回收 率低。WO 2007/035341A1，公开了一种纯化蛋白A的方法，该方法包括过滤，渗滤，以及 两步连续的层析操作，第一步为阴离子交换层析、疏水作用层析或陶瓷羟基磷灰石层析中 的一种，第二步为阳离子交换层析。该方法同样操作复杂，效率低。CN 1432578A，公开了一种人工合成的蛋白A基因及其表达产物的制备方法。所用 的纯化方式为一步分子筛纯化，处理量小，产品纯度不高，不适宜大规模生产。CN 101050464A和CN 101298476A公开的重组蛋白A纯化方法类似。其都是在基 因构建时加入了由6个组氨酸组成的标签，因此采用镍离子螯合层析纯化重组蛋白A。但 这种方法需要在纯化过程中加入特定的酶来切除组氨酸标签，且这种方法得到的产品纯度 低。综上所述，利用IgG为配基的亲和层析方法虽然存在一些缺陷，但在单次获得产 品纯度上仍高于其他方法。因此，本发明针对IgG为配基的亲和层析柱在重组蛋白A纯化 中存在的吸附柱空间位阻大、载量低等不足，提出了一种以定向固定化IgG的Fc片段为亲 和配基的亲和层析技术纯化重组蛋白A的新方法。
发明内容
本发明提供了一种以定向固定化IgG的Fc片段为亲和配基的亲和层析介质的制 备方法，在实现重组蛋白A的高选择性分离纯化的同时，显著提高层析柱的载量和使用寿 命，降低生产成本。本发明的技术方案包括以下步骤(1)采用木瓜蛋白酶酶解IgG为Fc片段和Fab片段，并通过固定重组蛋白A的亲 和层析柱纯化Fc片段；(2)采用高碘酸钠氧化Fc片段糖侧链，利用反应后得到的醛基实现Fc片段的定向 固定化；(3)采用琼脂糖凝胶为基质，以羰基二咪唑(⑶I)活化，通过双功能团间隔臂分子 将氧化后的Fc片段固定，合成了可以特异性结合重组蛋白A的亲和层析材料，该材料对重 组蛋白A的吸附容量为10-20mg/ml gel。本发明的有益效果如下1、采用Fc片段为亲和配基制备成亲和层析柱，由于Fc片段大小只占完整IgG分 子的三分之一，因此单位体积载体上可以偶联更多的配基，相比IgG亲和层析介质动态载 量明显提高，从而降低了生产成本；2、采用高碘酸钠氧化Fc片段糖侧链，利用反应后得到的醛基实现Fc片段的定向 固定化。由于采用了定向偶联工艺，降低了空间位阻，因此可以在使用更高流速的条件下增 加动态载量；3、相对于传统的IgG亲和层析和其他多步纯化的方法，该工艺的特点是低成本、 高效率和操作简便，该工艺既可用于实验室规模纯化蛋白A，也可用于工业化蛋白A的生产。按上述方法，最终获得的蛋白A利用SDS-PAGE和HPLC检测产物纯度达95%以上。
附图1为通过重组蛋白A亲和层析柱纯化Fc片段的SDS-PAGE凝胶电泳结果，其 中泳道1为IgG，泳道2为木瓜蛋白酶酶解液，泳道3为穿透，泳道4为双蒸水冲洗样，泳道 5为纯化后的Fc片段。附图2为纯化后SDS-PAGE凝胶电泳结果，其中泳道1为低分子量蛋白marker，泳 道2为纯化后的重组蛋白A。
具体实施例方式以下结合技术方案和附图详细叙述本发明的具体实施例。实施例1Fc片段的制备(1)木瓜蛋白酶酶解IgG以IOmM pH 7. 4的PBS缓冲液溶解适量的木瓜蛋白酶一定时间，过滤。加入一定量 的激活剂半胱氨酸和螯合剂EDTA，使其终浓度分别达到0. 02mol/L和0. 01mol/L,加入IgG 使其浓度保持在0. 5-10mg/ml，加入反应物后调节pH值到6_7之间，40°C水浴反应3_6h。最 后加入终止剂碘乙酰胺使其浓度达到0. 03mol/L。(2)利用重组蛋白A亲和层析柱纯化Fc片段取以重组蛋白A为配基的亲和层析填料装柱，用5倍柱体积平衡缓冲液(IOmM PBS，pH 7.4)平衡柱子，检测280nm吸光度，直到基线平衡为止。将上述所得的酶解液缓慢 过柱，接着用5倍柱体积平衡缓冲液冲洗柱子，再改用双蒸水冲洗，以洗去因疏水作用而非 特异吸附的杂蛋白，最后使用2-4倍柱体积的洗脱缓冲液(IOOmM柠檬酸，pH 2. 3)洗脱，收 集洗脱峰，并立即用中和缓冲液(500mM Tris-HCl，pH 8.0)中和至中性。Fc片段的定向固定化(I)Fc片段的氧化反应对上述洗脱液进行透析除盐，浓缩后转入铝箔纸包裹的锥形瓶中，加入高碘酸钠 至终浓度为2-10mg/ml，轻微摇晃，室温避光反应20-40min后快速透析除去高碘酸钠以终 止反应，并对透析后的溶液进行浓缩。(2)⑶I法活化琼脂糖凝胶取5ml全沉降后的S印harose CL-4B凝胶，用蒸馏水洗去胶中的防腐剂等。称取 0. 5g⑶I溶解在约IOml丙酮中。将洗好的凝胶加到⑶I丙酮溶液中，300C、150rpm,恒温摇 床反应lh。反应后的凝胶用丙酮反复冲洗，除去反应过程中产生的咪唑。(3)手臂的连接IOml无水丙酮中加入2ml的乙二胺、1，6-己二胺或二氨基二丙基亚胺(DADPA)，再 加入已经活化的⑶I凝胶，300C、150rpm,恒温摇床反应2h。用大量的蒸馏水冲洗反应后的 凝胶，再用150mM pH 8. 2硼酸缓冲液抽滤。(4)Fc片段的固定取一定量活化后的凝胶，加入等体积的150mM pH 8. 2的硼酸缓冲液，加入含氧化后Fc片段的溶液，30°C、150rpm，恒温摇床反应3h。反应后的凝胶用大量蒸馏水抽滤后， 放入乙醇胺溶液中封闭未反应的醛基，30°C，150rpm，恒温摇床过夜。最后加入硼氢化钠， 30°C，150rpm，摇床反应30min左右，还原后的凝胶用大量蒸馏水抽滤清洗，然后放入含有 0. 02%的叠氮钠溶液中，4°C保存待用。合成的以Fc片段为配基的亲和层析介质的配基密 度为 5-15mg/ml gel。重组蛋白A的分离纯化(1)将发酵液4000rpm离心15min，去掉上清培养基，将菌体溶于5倍体积的裂 解液(50mM Tris, IOOmM NaCl, pH 8.0)中，加入溶菌酶使其终浓度为0. 2mg/mL，37°C温浴 15min后超声破碎，将破碎后的菌液IOOOOrpm离心20min，获取上清液。(2)取以IgG的Fc片段为配基的亲和填料装柱，用5倍柱体积平衡缓冲液(IOmM PBS,0. 5M NaCl,pH 7.4)平衡柱子，检测210nm吸光度，直到基线平衡为止。将上述处理后 的蛋白上清液缓慢过柱，接着用5-10倍柱体积平衡缓冲液冲洗柱子，直到210nm处吸光度 回到基线并稳定为止，再用2-4倍柱体积的洗脱缓冲液(IOOmM柠檬酸，pH 2. 3)洗脱，收集 洗脱峰，并立即用中和缓冲液(500mM Tris-HCl, pH 8.0)中和至中性。最终获得的蛋白A经SDS-PAGE及HPLC检测蛋白A纯度为95%以上。
权利要求
一种重组蛋白A的分离纯化方法，其特征包括如下步骤(1)采用木瓜蛋白酶酶解IgG为Fc片段和Fab片段，并通过固定重组蛋白A的亲和层析柱纯化Fc片段；(2)采用高碘酸钠氧化Fc片段糖侧链，利用反应后得到的醛基实现Fc片段的定向固定化；(3)采用琼脂糖凝胶为基质，以羰基二咪唑活化，通过双功能团间隔臂分子将氧化后的Fc片段固定，合成了特异性结合重组蛋白A的亲和层析材料。
2.根据权利要求1所述的一种重组蛋白A的分离纯化方法，其特征还在于所述木瓜 蛋白酶酶解IgG的条件为激活剂半胱氨酸和螯合剂EDTA的终浓度分别为0. 02mol/L和 0. 01mol/L,加入IgG的浓度保持在5-lOmg/ml，酶解pH值6-7，酶解温度37-45°C，酶解时间 6h ；最后加入终止剂碘乙酰胺的浓度为0. 03mol/L。
3.根据权利要求1所述的一种重组蛋白A的分离纯化方法，其特征还在于所述高碘 酸钠氧化Fc片段糖侧链条件为溶液IgG浓度为0. 5-10mg/ml，加入高碘酸钠的终浓度为 2-lOmg/ml。
4.根据权利要求1所述的一种重组蛋白A的分离纯化方法，其特征还在于双功能团 间隔臂分子为乙二胺、1，6_己二胺或二氨基二丙基亚胺。
5.根据权利要求1所述的一种重组蛋白A的分离纯化方法，其特征还在于合成的以 Fc片段为配基的亲和层析介质的配基密度为5-15mg/ml。
全文摘要
本发明涉及一种重组蛋白A的分离纯化方法，包括批量IgG Fc片段的制备，Fc片段的定向固定化以及利用以Fc片段为配基的亲和色谱技术分离纯化重组蛋白A的方法，属生物工程技术领域。最终获得的蛋白A经SDS-PAGE及HPLC检测蛋白A纯度为95％以上。该方法具有低成本、高效率和操作简便的优点，既可用于实验室规模纯化蛋白A，也可用于工业化蛋白A的生产。
文档编号C07K1/22GK101921320SQ201010227638
公开日2010年12月22日 申请日期2010年7月15日 优先权日2010年7月15日
发明者任军, 侯率, 张嘉玉, 林雪, 谢键, 贾凌云 申请人:大连理工大学