专利名称：一种小麦凝集素类蛋白TaJRL1及其编码基因与应用的制作方法
一种小麦凝集素类蛋白TaJRLI及其编码基因与应用
技术领域：
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种来源于小麦的凝集素蛋白 TaJRLl及其编码基因与应用。
背景技术：
植物在整个生命周期中会面临各种细菌、真菌、病毒、蚜虫、蝗虫、螟虫、飞蛾等病 虫害的危害等，这些病虫害对植物生长发育产生诸多不利的影响。为了应对各种病虫害， 植物自身形成了一系列调控机制除了通过在侵染部位合成和积累木质素、植保素等物质 来阻止病菌的入侵和扩展之外，植物还通过诱导防卫反应产生广谱抗性来应对病原菌的侵 入。研究表明，植物的防卫反应受两类基因的控制，一类是R基因，一类是病程相关基因，前 者属于基础抗性，后者属于诱导型抗性。R基因产物作为受体，直接或者间接的参与病原蛋 白互作，从而启动植物体内的抗病信号途径。这类抗病反应产生的抗病性较强，但是由于R 基因的资源有限，尤其是对某些复杂的数量性状抗病性如小麦的赤霉病抗性，这类R基因 的获得尤其困难。除开资源有限较难获得之外，R基因介导的抗性具有病原种类和病原生 理小种的特异性，抗谱不广，抗性易于丧失。与R基因相比较，病程相关基因介导的抗性具 有抗性持久、抗谱广泛和资源丰富等优点。在缺乏R基因的情况下，通过克隆病程相关基因 提高植物的抗性显得尤为重要。这类病程相关基因的共同特点是在经过病原菌诱导后表达 量明显升高或减少。小麦是世界上重要的粮食作物之一，但病虫害的影响往往导致产量和品质的下 降。病原菌对植物的侵害及引起的一系列防卫反应在不同植物与病原菌之间存在相似性， 因此，我们可以通过抗病反应相关基因的应用来提高植物广谱及长效的抗性。抗病反应的 调控因子分为正调控因子和负调控因子两类。正调控因子的超量表达，可以快速而有效的 启动抗病反应，提高植物的抗病性，拓宽植物的抗谱；而抑制该基因的表达则会导致抗病性 的减弱。凝集素是一类非免疫起源的糖结合蛋白，各种生物中分布广泛、种类众多，家族内 各成员的结构和功能亦差异悬殊。根据特征性质的不同可以将植物凝集素分为七个亚家 族苋科凝集素、葫芦科韧皮部凝集素、橡胶蛋白结构域凝集素、豆科凝集素、单子叶植物甘 露糖结合凝集素、II型核糖体失活蛋白凝集素和jacalin相关凝集素。值得说明的是，本 发明的TaJRLl蛋白是来源于小麦的jacalin相关凝集素，在本发明提出之前，Genbank中 与TaJRLl的同源性最高的多肽链为大麦的mJRL蛋白LEM2，两者的同源性仅为48%。
发明内容
技术要求本发明所要解决的技术问题是提供一种抗病虫相关的小麦凝集素类蛋白TaJRLl。本发明还要解决的技术问题是提供上述蛋白的编码基因。本发明还要解决的技术问题是提供上述基因在培育抗病虫品种中的应用。
技术方案为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下—ft/J^II^S^SS TaJRLKTriticum aestivum Jacalin Related Lectin), 它是具有序列表中SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的蛋白质，或者是将SEQ ID NO :2的氨 基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO 2的氨 基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO :2衍生的蛋白质。 所述的小麦凝集素类蛋白TaJRLl优选具有序列表中SEQ ID NO 2所示的氨基酸 序列。该蛋白包含301个氨基酸，等电点为6. 36，含有2个jacalin结构域，一个结构域为 AA21-AA148，第二个结构域为AA163-AA298。在NCBI网站上进行序列比对没有发现与该多 肽链同源性超过50%的蛋白序列公布。在已公布的蛋白序列中，与该多肽链同源性最高的 蛋白质序列是大麦mJRL蛋白LEM2，两者之间的同源性仅为48%。因此，TaJRLl是一个新 的jccalin类似蛋白。上述小麦凝集素类蛋白TaJRLl的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列；2)编码序列表中SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO :1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸 序列。小麦凝集素类蛋白TaJRLl的编码基因优选序列表中SEQ ID NO 1所示的核苷酸 序列。小麦凝集素类蛋白TaJRLl的编码基因含有906bp的核苷酸。含有上述基因TaJRLl的表达载体和转基因细胞系也在本发明的保护范围之内， 利用现有分子生物学的方法可以得到不同的表达载体和转基因细胞系。上述基因TaJRLl在培育抗病虫品种中的应用。利用任何一种可以引导外源基因 在植物中超量表达的载体，将本发明所提供的凝集素类基因TaJRLl导入植物细胞，可获得 改变植物对白粉病、赤霉病和棉铃虫的抗性的转基因细胞系及转基因植株。为了便于对转 基因植物或转基因植物细胞进行筛选，可以对载体进行加工，如加入抗生素标记基因(如 潮霉素、卡那霉素和庆大霉素)，加入抗生素标记基因之后的载体用于转化，可以在转化后 的植物培养基中加入抗生素，抑制非转基因细胞系和植株的生长，有助于快速和有效的获 得转基因植株。为了便于观察外源基因的表达，可以在载体中启动子和外源基因之间加入 报告基因(GUS基因、GFP和荧火虫荧光素酶报告基因)，构建报告基因和外源基因融合表 达的载体，该载体用于遗传转化，可以通过观察报告基因的表达与否和表达量高低，推测外 源基因在植物体内表达情况。为了转基因植物释放的安全性，也可以构建载体时不携带任 何筛选标记基因，而在苗期进行PCR检测。含有本发明的TaJRLl表达载体可通过使用基因 枪法、农杆菌介导法、花粉管通道，电击，显微注射，Ti质粒，Ri质粒或植物病毒等常规生物 学方法转化植物细胞或组织，并将转化后的植物细胞培育成完整的植株。被转化的植株材 料既可以是双子叶植物，也可以是单子叶植物，如水稻、棉花、小麦、大豆、烟草、拟南芥、大 麦、高粱、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等。TaJRLl基因可提高南芥对赤霉菌的抗性。TaJRLl基因可提高烟草对棉铃虫的抗性。TaJRLl基因可提高小麦对白粉病的抗性。
有益效果通过基因工程的方法将本发明提供的小麦凝集素类蛋白转入植物中，可以提高植 物对棉铃虫、赤霉病和白粉病的抗性。由于该基因是粮食作物小麦本身存在的内源基因，因 此，该基因的超量表达不会影响植物的食品安全性，可以广泛应用于各种植物的抗病虫性 育种过程。
四
图IA为转基因拟南芥的PCR检测。图IB为转基因拟南芥的赤霉菌抗性得到了提高。图2A为转基因烟草的PCR检测。图2B为转基因烟草对棉铃虫的抗性得到了提高。图3为构建的TaJRLl基因的体外转录载体结构。图4A为VIGS处理后小麦中TaJRLl基因表达丰度降低。图4B为TaJRLl基因被沉默后小麦的白粉病抗性降低。
五具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发 明。实施例1 =TaJRLl蛋白的获得。在抗赤霉病材料望水白开花期，将赤霉菌孢子液用喷雾器喷洒到穗部，所用孢子 液为江苏省范围内强致病力赤霉菌菌株F4、F15, F17及F34的分生孢子混合液，接种后立即 将穗子套上塑料袋，保持湿度，以保证赤霉菌发病。在接种后6小时、12小时和24小时后 分别取麦穗，同时用水接种做为对照，取材后立即用液氮冷冻。取700mg冻存的麦穗，加入 70mg的PVP于液氮中磨成粉末，加入5mL 10%三氯醋酸/丙酮振荡混勻、-20°C沉淀1小 时；4°C 15，00(^离心151^11，沉淀重新悬浮于51^冷丙酮中，-201放置2小时；4°C 15，OOOg 离心15min，沉淀悬浮于80%的冷丙酮中，_20°C放置1小时，离心去丙酮，将沉淀干燥成 粉。按每mg干粉加入10 μ L裂解液(7Μ脲，2Μ硫脲，4% CHAPS，1% CA，0. 3%蛋白酶抑制 剂，50U/mL DNase I)的比例加入裂解液，4°C搅拌抽提15min后加入14mM的DTT ；4°C再搅 拌20min，然后35，00(^离心10!^11，上清即为蛋白抽提液。将蛋白提取液进行等电聚焦后， 进行SDS-PAGE电泳。电泳缓冲液用Tris-Glycine-SDS缓冲液，温度设为17°C;先用2. 5W/ 胶预电泳30min后，再用5W/胶电泳至溴酚蓝到玻璃板下缘为止。电泳结束后，取下凝胶进 行银染。分析在侵染后蛋白点的丰度与对照相比超过3倍的蛋白点，取一个分子量为31. 1 千道尔顿，等电点为6. 36的蛋白点即为TaJRLl蛋白。实施例2 编码TaJRLl蛋白的cDNA序列的获得。对实施例1得到的蛋白点进行质谱分析获得其氨基酸组成信息，根据对应肽片段 的EST用来搜索小麦EST数据库，得到了 3条EST序列CK163175，CK163203和CK163203， 将上述3条EST序列进行拼接，然后用MacVector软件设计引物Pl，Pl引物对如下F_5'-ATGGCCGGCGCTGTGAAGATTGGT-3 ‘ ；R-5' -GTCATCCAGCGGCACGACATA-3 ‘。以抗病种质望水白的穗部cDNA作为模板，用英俊公司的Trizol试剂盒提取小麦穗部的总RNA，采用Promega 公司的反转录试剂盒进行反转录，合成单链cDNA。用引物Pl进行PCR扩增，扩增体系为 25 μ L,包括 5ng 模板，F 和 R 引物各 5pmol，dATP, dTTP, dCTP 和 dGTP 各 5nmol，37. 3nmol MgCl2,0. 5单位的DNA聚合酶，Ix PCR缓冲液。扩增的程序是94°C变性3分钟；30个循环， 94°C变性20秒，60°C退火30秒，72°C延伸1. 2分钟；最后72°C延伸5分钟。通过PCR扩 增，获得了包含开放读码框的906bp的核苷酸序列，如SEQ ID N0:1所示。该序列编码301 个氨基酸，如SEQ ID N0:2所示，等电点为6.36，含有2个扭(^1111结构域，一个结构域为 AA21-AA148，第二个结构域为 AA163-AA298。
实施例3 转TaJRLl基因拟南芥的赤霉菌抗性得到提高。以抗病种质望水白的穗部cDNA作为模板，利用引物P2进行PCR扩增，P2弓丨物对 如下F-5' -TAATCTAGAATGGCCGGCGCTGTGAAGATT-3 ‘ ；R 5' -TAAGGATCCGTCATCCAGCGGCA CGACATA-3 ‘。将扩增得到的PCR产物用限制性内切酶XbaI和BamHI进行酶切后，与经过 同样限制性内切酶进行酶切的PBI121表达载体进行连接，获得由CaMV35S启动子启动的 TaJRLl超量表达的质粒载体。构建好的载体通过电击法转化到LBA4404农杆菌菌株中，通 过含有50 μ g/mL的卡那霉素和50 μ g/mL的利福平的LB培养基进行筛选，获得阳性克隆。 参照1998年Clough和Bent发表在Plant Journal第16期735-743页上的文章中的材料 与方法，在拟南芥花期将携带有TaJRLl超量表达载体的农杆菌菌液浸泡花器官进行遗传 转化，收获到的拟南芥种子种植于含有50 μ g/mL卡那霉素的1/2MS培养基上进行筛选，获 得TaJRLl超量表达的抗卡那霉素的转基因拟南芥。拟南芥自交繁殖后，将T3代转基因拟 南芥叶片和非转基因叶片同时接种赤霉菌，3天后进行赤霉病抗性鉴定，所用赤霉菌为江苏 省内感染小麦的强赤霉菌(F4，F15，F17，F34)菌株的混合物。结果表明，转基因植株对赤 霉菌的抗性增强，叶片上赤霉菌菌丝生长变慢(图1)。实施例4 转TaJRLl基因烟草对棉铃虫的抗性得到提高。按照Khodakovskaya 在 2006 年发表在 Plant Cell R印ort 第 25 期 1181-1192 页 的文章中的实验方法，取幼嫩的烟草叶片进行消毒后，于添加2mg/L 2,4-D的MS培养基上 进行诱导愈伤组织，15天后，将上述携带有TaJRLl超量表达载体的农杆菌菌液浸泡诱导获 得的愈伤组织，进行遗传转化，转化后用含有100 μ g/mL卡那霉素的培养基进行筛选，获得 抗性转基因植株。通过人工饲喂得到棉铃虫的3龄幼虫，停止喂食棉铃虫2小时后，称量棉 铃虫的初始体重，分别用T2代转基因烟草和野生型非转基因烟草叶片饲喂，每个叶片饲喂 6头3龄棉铃虫，36小时后再次称量棉铃虫的重量。用饲喂过程中增加的棉铃虫重量占棉 铃虫初始重量的比例来表示相对生长量，实验设置了 3次重复。发现转基因烟草饲喂的棉 铃虫的生长明显受到抑制(表1，图2)。表1转基因烟草和非转基因烟草饲喂棉铃虫对棉铃虫生长的影响 实施例5 沉默TaJRLl基因降低小麦对白粉病的抗性。以抗病种质望水白的穗部cDNA作为模板，用引物P3进行PCR扩增，引物P3如下 F-5' -ATATTAATTAACCTTCATCAGCGGCACCTAC-3' ；R-5' -CAGATAGCTAGTCATCCAGCGGCACGACA AAG-3 ‘。扩增产物用NotI和PacI进行双酶切，酶切后的基因片段和同样经NotI和PacI双 酶切的野生型BSMV ND18 γ质粒连接，(BSMV ND18 α、β及γ载体，引自美国堪萨斯州立大 学Scofield实验室)，构建体外转录载体(图3)，通过热激法将该载体转化大肠杆菌DH5 α 菌株中。提取野生型BSMV ND18 α、β、γ及BSMV =TaJRL的质粒DNA。用MluI单酶切BSMV ND18 α、γ及BSMV :TaJRL2质粒DNA，用SpeI单酶切BSMV ND18 β质粒DNA。将酶切完全的 线性化质粒DNA用体积比为25 24 1的苯酚氯仿；异戊醇进行纯化。以纯化好的线性 化质粒DNA为模板，用Ambion公司的Τ7. mMessage Machine Kit试剂盒的实验步骤体外合 成RNA。在小麦生长一周后，用体积比为0. 05%的Tween20溶液将叶片洗2_3遍，除去叶片 表面的蜡质，然后再用无菌水清洗2-3遍，待叶片表面晾干。配制FES溶液0. 2mol/L甘氨 酸，0. 6mol/L磷酸氢二钾，10g/L焦磷酸钠，10g/L膨润土(美国Fluka公司，货号#11959)和 10g/L硅藻土(美国Fluka公司，货号#22141)。将分别以野生型BSMV ND18 α、β及Υ为 模板体外转录的3种RNA与FES按1 1 1 22的比例混合，将以野生型BSMV ND18 α、 β及BSMV =TaJRLl为模板体外转录的3种RNA与FES也按1 1 1 22的比例混合。 用上述两种混合液分别涂抹处于同一生长期不同植株的叶片。涂抹病毒RNA 7天后取部分 接种植株的叶片提取RNA，反转录为cDNA，进行实时定量PCR检测，发现涂抹携带TaJRLl病 毒的植株中TaJRLl的表达明显受到抑制(图4A)。接着，接种白粉菌生理小种Bgtl9，7天 后，对每株接种白粉病的材料进行抗性调查，以未进行接种的材料和只接种不携带TaJRLl 的病毒作为对照，发现TaJRLl的沉默降低了小麦对白粉病的抗性(图4B)。
权利要求
一种小麦凝集素类蛋白TaJRL1，它是具有序列表中SEQ IDNO2所示的氨基酸序列的蛋白质，或者是将SEQ ID NO2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ IDNO2衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的小麦凝集素类蛋白TaJRLl，其特征在于，所述的小麦凝集素 类蛋白TaJRLl具有序列表中SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
3.小麦凝集素类蛋白TaJRLl的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQID NO 1所示的核苷酸序列；2)编码序列表中SEQID NO 2所示的氨基酸序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQID NO 1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的小麦凝集素类蛋白TaJRLl的编码基因，其特征在于小麦凝集 素类蛋白TaJRLl的编码基因是序列表中SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。
5.权利要求3所述的基因在培育抗病虫品种中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于TaJRLl基因在提高南芥对赤霉菌抗性中的应用。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于TaJRLl基因在提高烟草对棉铃虫抗性中的应用。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于TaJRLl基因在提高小麦对白粉病抗性中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种小麦凝集素类蛋白TaJRL1，它是具有序列表中SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的蛋白质，或者是将SEQ ID NO2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO2衍生的蛋白质。本发明还公开了上述小麦凝集素类蛋白TaJRL1的编码基因及该基因的应用。通过基因工程的方法将本发明提供的小麦凝集素类蛋白转入植物中，可以提高植物对棉铃虫、赤霉病和白粉病的抗性。由于该基因是粮食作物小麦本身存在的内源基因，因此，该基因的超量表达不会影响植物的食品安全性，可广泛应用于各种植物的抗病虫性育种过程。
文档编号C07K14/42GK101885765SQ20101022682
公开日2010年11月17日 申请日期2010年7月15日 优先权日2010年7月15日
发明者向阳, 宋敏, 贾海燕, 马正强 申请人:南京农业大学