一种普通小麦高分子量谷蛋白1By18基因的分子标记及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种普通小麦高分子量谷蛋白1By18基因的分子标记及应用。所述分子标记由SEQ ID No.1所示和SEQ ID No.2所示的DNA分子组成和/或由SEQ ID No.1所示和SEQ ID No.3所示的DNA分子组成。通过实验证明该分子标记准确可靠、重复性好，可以用于1By18亚基的筛选，为小麦品质改良过程中高分子量谷蛋白优质亚基的有效鉴定和选择提供了简单、准确的检测方法，对小麦品质改良具有重要意义。
【专利说明】-种普通小麦高分子量谷蛋白1 By18基因的分子标记及应 用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种普通小麦高分子量谷蛋白IBylS基因的 分子标记及应用。
【背景技术】
[0002] 小麦、玉米、水稻是世界三大主要粮食作物，小麦的面粉可广泛用于制作面包、馒 头、面条、饼干、蛋糕等食物。小麦面粉中85%的贮藏蛋白赋予面团粘弹性，使面粉具有特殊 的和面加工特性，可以制作各种专用食品。C藏蛋白包括醇溶蛋白（gliadins)和麦谷蛋白 (glutenins)，其中麦谷蛋白主要决定面团的弹性，而醇溶蛋白则决定面团的延展性。随着 人们生活水平的不断提高，对优质小麦的需求越来越多，优质品种选育成为重要的小麦育 种目标，特别是对贮藏蛋白组成的改良是提高小麦加工品质的关键，对小麦品质育种具有 重要意义。
[0003] 麦谷蛋白是一种溶于稀酸和稀碱的多聚体蛋白，其氨基酸序列富含半胱氨酸，易 形成分子内或者分子间二硫键，从而赋予面团弹性。麦谷蛋白分子量较大，根据其迁移率 可以分为高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS)和低分子量谷蛋白亚基（LMW-GS)，用SDS-PAGE 可以将二者区分开。高分子量谷蛋白亚基编码基因位于第一部分同源群染色体长臂上的 Glu-I位点，分别为Glu-Al，Glu-Bl和Glu-Dl，每个位点编码两个紧密连锁的分子量较大 的X-型和分子量较小的y-型亚基，理论上每个普通小麦品种具有6个不同的高分子量谷 蛋白亚基，但由于个别位点基因的沉默导致在普通小麦品种中一般存在3-5个高分子量谷 蛋白亚基。研究表明Glu-I位点存在广泛的等位变异，Payne和Lawrence (1983)鉴定并命 名了面包小麦三个Glu-I位点的等位基因，如Glu-Al位点的Glu-Ala(I)、Glu-Alb (2*)和 Glu-Alc (Null) ;Glu-Bl 位点有 Glu-Bla-k 等位基因，分别编码 7、7+8、7+9、6+8、20、13+16、 13+19、14+15、17+18、21和22等亚基；Glu-Dl位点有Glu-Dla-g等位基因，分别编码2+12、 3+12、4+12、5+10、2+10、2· 2+12 和 2+11 等亚基。
[0004] 尽管HMW-GS约占小麦贮藏蛋白的12%，但其在决定面团的弹性方面发挥着重 要作用，这在很大程度上决定小麦的加工品质，不同的位点其等位变异和组合对小麦品 质影响不同。Glu-Al、Glu-Bl、Glu-Dl不同位点对面团特性的影响不同。自Payne和 Corfield(1979)发现IAxl亚基与小麦面粉的烘烤品质相关以来，国内外学者开始对小麦 HMW-GS组成与加工品质的关系进行了大量研究。毛沛等（1995)利用242份小麦品种的多 个指标分析了 HMW-GS对面包烘烤品质的影响，表明单个亚基贡献大小分别为2* > I > N， 5+10 > 4+12 > 2+12, 7 > 7+8 > 7+9。在 10 个常见的 HMW-GS 亚基组合中（7+8, 5+10)、 (NyLl，7+9,5+10)、（NyLl、l，7+9,5+10)和（1，7+8,5+10)这 4 个组合的品质效应最佳。 许自成等（1998)认为，对小麦加工品质正向效应最大的是5+10亚基组合，7+8、2*和4+12 亚基次之，而6+8、2+12、20以及NyLl亚基的作用较小。fcanlard等（2001)对162份欧 洲小麦品种（系）进行了研究，发现在Glu-Bl位点上不同亚基组合的品质效应依次是： 13+16彡17+18彡7+9 = 7+8 = 7 = 6+8。Bronneke等（2000)发现通过对高分子量谷蛋 白和醇溶蛋白分析发现基因型为1、2*、7+9、14+15、17+18、5+10的面包品质较好烘烤品质。 刘丽等（2003)发现，13+16对面粉品质具有重要作用。一般认为含有5+10、1、8和13+16亚 基及组合的小麦其面粉具有较好的弹性，更适合烘烤面包，而20和2+12亚基及组合对面粉 品质具有不利影响。Mondal(2008)等通过研究9个GluAl、GluBl、GluDl近等基因系，发现 仅17+18亚基的近等基因具有较好的面粉的加工品质，能够增大墨西哥玉米饼的直径；1， 5+10组合也能在一定程度上提高面团的延展性，提高西哥玉米饼直径。并且包含17+18亚 基的近等基因系面团品质打分最商。Meng等（2008)发现基因型1，17+18, 5+10具有较好的 加工品质，非常适合做拉面。Mao等（2012)在川麦107中引入过量表达的IAxl基因，通过分 析杂交得到的8个转基因株系，发现过表达IAxl能够明显的提高面团的强度，抗拉伸能力 及和面特性。含1，17+18, 2+12亚基组合的C4过表达株系表现出最高的蛋白指数（gluten index)和Zeleny沉降值。说明可以引入过表达基因来提高小麦面团特性。目前已有研究 从代换系中引入优质亚基，提高面包的烘烤品质。Wang等（2012)以中国春和中国春-高 大山羊草（Aegilops longissima，S1S1Jn = 14) ISVlB 代换系（CS-ISVlB)为材料，发现 CS-IS1ZlB的和面特性和面团弹性显著提高，面包体积增大，显著提高了面包品质。
[0005] SNP是继RFLP、SSR及多重PCR检测技术之后的第三代分子标记技术，以其准确和 高通量等优点逐步受到育种家的重视。SNP主要是建立在单核苷酸突变的基础上，通过一次 反应能够对目的基因进行准确的鉴定与选择，在小麦分子标记辅助选择中具有广阔的应用 前景。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供一种用于鉴定小麦品种是否含有IBylS基因的引物对。
[0007] 本发明提供的用于鉴定小麦品种是否含有lByl8基因的引物对由SEQ ID No. 1所 示和SEQ ID No. 2所示的DNA分子组成和/或由SEQ ID No. 1所示和SEQ ID No. 3所示的 DNA分子组成。
[0008] 上述引物对中，所述IBylS基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 4所示。
[0009] 上述所述引物对在鉴定或辅助鉴定小麦品种是否含有IBylS基因中的应用也是 本发明的保护范围。
[0010] 本发明的另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定小麦品种是否含有IBylS基因 的试剂盒。
[0011] 本发明提供的鉴定或辅助鉴定小麦品种是否含有IBylS基因的试剂盒包含上述 所述的引物对。
[0012] 本发明还有一个目的是提供上述所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定小麦品种是否 含有lByl8基因中的应用。
[0013] 本发明的最后一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定小麦品种是否含有IBylS基 因的方法。
[0014] 本发明提供的鉴定或辅助鉴定小麦品种是否含有IBylS基因的方法包括如下步 骤：
[0015] (1)提取待测小麦品种的基因组DNA ;
[0016] (2)以所述基因组DNA为模板，采用上述所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩 增产物；
[0017] 如采用SEQ ID No. 1所示和SEQ ID No. 2所示的DNA分子组成的引物对，得到PCR 扩增产物的大小为284bp，则待测小麦品种含有或候选含有lByl8基因；
[0018] 如采用SEQ ID No. 1所示和SEQ ID No. 3所示的DNA分子组成的引物对，得到PCR 扩增产物的大小为365bp，则待测小麦品种含有或候选含有lByl8基因。
[0019] 上述方法中，以所述引物对进行PCR扩增的退火温度为55°C。
[0020] 本发明通过在普通小麦CB037中克隆得到高分子量谷蛋白亚基lByl8的基因序 列，并根据lByl8基因单核苷酸突变位点设计两对特异性引物TF1/TR1和TF1/TR2。通过实 验证明该分子标记准确可靠、重复性好，可以用于IBylS亚基的筛选，为小麦品质改良过程 中高分子量谷蛋白优质亚基的有效鉴定和选择提供了简单、准确的检测方法，对小麦品质 改良具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1为分子标记TF1/TR1和TF1/TR2在24个包含lByl8和By8亚基材料中特异 性扩增的检测结果。
[0022] 图2为分子标记TF1/TR2对Glu-Bl位点不同亚基中的检测结果。
[0023] 图3为分子标记TF1/TR2特异性引物在CB037AXCS-1SV1B重组自交系中的检测 结果。
【具体实施方式】
[0024] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0025] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026] 实验材料 CS、CB037A、CB037B 和 CB037C 在文献 "Zitong Yu, Caixia Han, Xing Yan，Xiaohui Li, Guoliang Jiang， and Yueming Yan， Rapid Characterization of Wheat Low Molecular Weight Glutenin Subunits by Ultraperformance Liquid Chromatography (UPLC)，Journal of Agricultural and Food Chemistir，2013, 61，4026-4034. "中公开过，公众可从首都师范大学生命科学学院获得。
[0027] 实验材料 CS-ISl (IB)代换系在文献 "Wang Shunli，Yu Zitong，Cao Min，Shen Xxij Li Ningj Li Xiaohuij Ma Wujunj Wei β gerber H，Zeller F，Hsam S，Yan Yueming，Molecular mechanisms of HMW glutenin subunits from IS1 genome of Aegilops longissima positively affecting wheat breadmaking quality.PloS One 2013, 8 (4) : e58947. "中公开过，公众可从首都师范大学生命科学学院获得。
[0028] 实验材料 Hanno 和 Imbros 在文献 "LIYAN GA0, WUJUNMA，JING CHEN，KEWANG，JING LIjSHUNLI WANGjFRANKBEKES, RUDIAPPELS, YUEMING YANjCharacterization and Comparative Analysis of Wheat High Molecular Weight Glutenin Subunits by SDS-PAGE，RP-HPLC，HPCE，and MALDI-TOF-MS，J. Agric. Food Chem，2010, 58, 2777 - 2786. " 中公开过，公众可从首都师范大学生命科学学院获得。
[0029] 实施例1、鉴定普通小麦品种中是否含有lByl8基因的方法
[0030] I、DNA 提取
[0031] 用CTAB法提取普通小麦（CB037)叶片的DNA，提取所得DNA拿ddH20溶解，DNA经 1 %琼脂糖凝胶电泳进行质量检测，提取的DNA要求无明显杂质、条带清晰、无降解。
[0032] 2、PCR 扩增
[0033] 以上述步骤1获得的小麦基因组DNA为模板，分别采用TF1/TR1和TF1/TR2引物 进行PCR扩增，引物序列如表1所示。
[0034] 表1、用于鉴定普通小麦IBylS基因等位变异的引物序列
[0035]
【权利要求】
1. 一种用于鉴定小麦品种是否含有lByl8基因的引物对； 所述引物对由SEQ ID No. 1所示和SEQ ID No. 2所示的DNA分子组成和/或由SEQ ID No. 1所示和SEQ ID No. 3所示的DNA分子组成。
2. 根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述lByl8基因的核苷酸序列如序列表 中 SEQ ID No. 4 所示。
3. 权利要求1或2所述的引物对在鉴定或辅助鉴定小麦品种是否含有lByl8基因中的 应用。
4. 一种鉴定或辅助鉴定小麦品种是否含有lByl8基因的试剂盒，该试剂盒包含权利要 求1所述的引物对。
5. 权利要求4所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定小麦品种是否含有lByl8基因中的应 用。
6. -种鉴定或辅助鉴定小麦品种是否含有lByl8基因的方法，包括如下步骤： (1) 提取待测小麦品种的基因组DNA ; (2) 以所述基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物； 如采用SEQ ID No. 1所示和SEQ ID No. 2所示的DNA分子组成的引物对，得到PCR扩 增产物的大小为284bp，则待测小麦品种含有或候选含有lByl8基因； 如采用SEQ ID No. 1所示和SEQ ID No. 3所示的DNA分子组成的引物对，得到PCR扩 增产物的大小为365bp，则待测小麦品种含有或候选含有lByl8基因。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，以所述引物对进行PCR扩增的退火温度为 55。。。
8. 权利要求1所述引物对或权利要求6所述方法在鉴定含有高分子量谷蛋白亚基的小 麦中的应用。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，含有lByl8基因的小麦为含有高分子量谷 蛋白亚基的小麦。
【文档编号】C12Q1/68GK104388564SQ201410668307
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月20日 优先权日:2014年11月20日
【发明者】晏月明, 梁晓娜, 甄守民, 李小辉 申请人:首都师范大学