专利名称：一种鉴定小麦低分子量谷蛋白亚基的质谱方法
技术领域：
本发明属于生命科学蛋白质组技术领域，特别涉及小麦低分子量谷蛋白亚基分子量的精确鉴定以及基于此技术方法对麦谷蛋白亚基的进一步表征。
背景技术：
小麦是世界上栽培面积最大、产量最高、地理分布最广的重要农作物，其种植面积和产量约占谷物作物的30％，被广泛应用于食品加工业与家畜饲养业。小麦种子中含有其他粮食作物中所欠缺的面筋蛋白，可制作面包、面条、饼干、糕点和馒头等多种专用食品。因此，种子蛋白的组成和含量在很大程度上决定小麦加工品质的优劣。
Osborne(1907)根据溶解特点的不同将小麦种子蛋白分为以下四类清蛋白和球蛋白、麦醇溶蛋白、麦谷蛋白。研究表明，小麦谷蛋白多聚体是自然界最大的蛋白分子(Wrigley，1996；Stevenson和Preston，1996)。通常所说的小麦贮藏蛋白是指醇溶蛋白和麦谷蛋白，其中麦谷蛋白约占贮藏蛋白的40％左右。根据还原条件下在SDS-PAGE中的迁移率不同，又可将麦谷蛋白分为两类高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)。HMW-GS的组成和含量直接影响小麦面粉的烘烤质量，而LMW-GS则与面团弹性密切相关。
大量研究表明，LMW-GS位点的等位变异与小麦的品质差异具有高度相关性。1984年Payne等首先发现LMW-GS组成与四倍体小麦品质有直接关系，例如具有LMW-1型电泳图谱的品种往往拥有较差的加工品质，而具有LMW-2型电泳图谱的品种则恰恰相反，往往具有优良的品质特性。1997年Nieto-Taladriz等发现构成LMW-1、LMW-2型的亚基由Glu-3、Glu-2位点上的等位基因控制。Luo等(2001)在比较普通小麦HMW-GS和LMW-GS等位变异对面粉品质影响时发现，Glu-3位点的等位变异对小麦品质相关的技术参数具有显著的影响，如面粉蛋白含量、SDS沉淀值、子粒硬度等。迄今为止，研究单个LMW-GS对小麦品质的影响还比较少。1998年Sissons等用RP-HPLC分离了一些LMW-GS进行品质研究，发现N-端为METSHIPGL-的LMW-GS可以改善面粉的混合特性。1999年Lee等对细菌表达的3个LMW-GS进行了品质的研究，发现来自一粒小麦A基因组的LMW-E2和LMW-E4比来自一粒小麦D基因组的LMW-16/10能够更有效地提高面粉合面特性，增加面团的延展性。
基于在SDS-PAGE中迁移率的不同，可将LMW-GS分为B、C和D型亚基。B型亚基的相对分子质量为40000-50000Da，C型亚基的相对分子质量为30000-40000Da，D型亚基是很微小的一部分，仅在少数小麦品种中出现。编码B型亚基的基因位点在第一部分同源群染色体短臂的Glu-3位点。编码C型亚基的基因位点可能在第一部分同源群染色体短臂的Gli-1位点或在第6部分同源群染色体短臂上的Gli-2位点。D型亚基也许在Gli-1位点。研究表明低分子量谷蛋白亚基基因位点与醇溶蛋白的基因位点紧密相连，如Gli-1位点，含有3种蛋白质基因ω醇溶蛋白基因、γ醇溶蛋白基因和低分子量谷蛋白亚基基因。
B型亚基和C型亚基有相似的结构。中央重复区都全部由脯氨酸和谷氨酞胺的重复序列组成，这些重复序列主要形成β转角。N端是一个非常短的非重复序列，C端也由非重复序列组成，其二级结构主要为α螺旋，且包含其所有的半胱氨酸残基。C端的8个半胱氨酸残基的位置是高度保守的。B型亚基中有1～8号中的6个半胱氨酸残基(1-5和7号)，另外还有一个6’在C端。对B型低分子量谷蛋白亚基的测序发现一些B型低分子量谷蛋白亚基还含有另外一个半胱氨酸残基。对编码B型低分子量谷蛋白亚基的基因序列分析表明，其N端应有一个半胱氨酸残基，但是在大多数小麦品种的B型低分子量谷蛋白亚基中却没有发现，而在中央重复区的N端发现有一个半胱氨酸残基。
C型低分子量谷蛋白亚基和α或γ醇溶蛋白结构相似。可能是由于醇溶蛋白基因发生了突变，使其可以形成分子间二硫键，所以属于谷蛋白类。醇溶蛋白是单体蛋白，不能形成聚集体。Cα型和Cγ型分别含有6个和8个保守的半胱氨酸残基，然而Cα型亚基的基因序列显示在N端应有一个半胱氨酸残基。在Cγ型中央重复区的N端有一个半胱氨酸残基。另外，在Cγ型亚基中央重复区，一些小麦品种中另外出现了一个半胱氨酸残基。
D型低分子量麦谷蛋白亚基和C型亚基一样与醇溶蛋白有相似的生化特性，甚至氨基酸序列也是如此。D型亚基和ω型醇溶蛋白一样属于贫硫蛋白，由很小的N端、C端和中央重复区组成。中央重复区富含谷氨酰胺，脯氨酸和苯丙氨酸，由交搭β转角组成。一般认为D型低分子量谷蛋白亚基可能是由ω型醇溶蛋白编码基因突变而造成一个半胱氨酸残基能够形成分子间二硫键，形成聚合体而导致的。
与HMW-GS相比，低分子量麦谷蛋白亚基的组成更为复杂，一个品种一般具有20-50个基因。因此，长期以来由于缺乏有效的分离方法，与HMW-GS相比，国内外对LMW-GS的研究相对滞后，由于常规分离方法SDS-PAGE分辨度不高，操作复杂，所得到的分子量往往与实际的分子量相差较大，因此急需建立新的、更加有效的分离鉴定技术。
发明内容
本发明的目的在于确立一种稳定、快速的质谱方法，从而可以对小麦低分子量谷蛋白亚基进行精确的分子量测定。通过这一蛋白质组学技术，可快速准确的鉴定出小麦低分子量谷蛋白亚基的分子量，分析小麦谷蛋白的低分子量亚基组成，从而鉴定并表征不同品种的小麦。
本发明采用的技术方案是一种鉴定小麦低分子量谷蛋白亚基的质谱方法，包括如下步骤1.在制备小麦低分子量谷蛋白亚基的质谱样品时，先用35-45％的丙酮沉淀蛋白提取液，离心后取上清，再用75-85％的丙酮沉淀清液中低分子量谷蛋白亚基；2.在获得低分子量谷蛋白亚基沉淀后，用溶解液溶解小麦低分子量谷蛋白亚基，溶解液的配比为以溶解液体积为计量基准，溶解液中乙腈溶液的体积为溶解液体积的15-25％，TFA所占的体积为溶解液体积的0.1％，其余为水。
在制备小麦低分子量谷蛋白亚基的质谱样品时，先用35-45％的丙酮沉淀蛋白提取液，目的在于先去除蛋白提取液中的高分子量谷蛋白亚基。
目前小麦低分子量谷蛋白亚基分子量的测定主要采用SDS-PAGE凝胶电泳方法。但SDS-PAGE测定蛋白质的分子量是根据蛋白质的迁移率和分子量的对数间的线性关系对其进行分子量的测定，但有一部分蛋白质在SDS体系中的相对迁移率与其分子量不呈线性关系，如电荷异常或构象异常的蛋白质，组蛋白F1本身带有大量的正电荷，结合的SDS不足以消除原来正电荷的影响，带有较大辅基的蛋白质(如某些糖蛋白)以及一些结构蛋白(例如胶原蛋白)和一些含二硫键较多的蛋白质，电泳的相对迁移率与分子量的对数不呈线性关系。所以传统的SDS-PAGE对蛋白分子量的测定存在很大误差。质谱是通过测定样品离子的质荷比来进行分子量测定的方法，其精确度极高。本发明以质谱技术为核心，建立了一套精确测定小麦低分子量谷蛋白亚基分子量的方法。
质谱是通过测定样品离子的质荷比来进行成份和结构分析的方法，其发展得益于两种软电离技术的发展(张国安等，2003)电喷雾电离和基质辅助激光解吸电离(MALDI)。电喷雾电离方法是利用高电场使质谱进样端的毛细管柱流出的液滴带电在N气流的作用下，液滴爆裂并最终成喷雾状，分析物离子化以带电荷方式进入质量分析器。MALDI离子源产生的离子多为单电荷离子，质谱图中的谱峰与样品各组分中的质量数有一一对应关系，且MALDI对盐和表面活性剂有较强耐受力，适合高通量分析。因此MALDI-MS最适合分析多肽以及蛋白质混合物，这种仪器是现今灵敏度最高的质谱仪，能够对极微量样品进行分析。
质谱主要用于解决两个分析问题精确测定生物大分子，如蛋白质、核苷酸、糖类等的分子量，并提供分子结构信息；对存在于生命复杂体系中的微量或痕量小分子生物活性物质进行定性或定量分析(吴世荣等，2004)。蛋白质类生物大分子分子量的测定有着十分重要的意义，如对均一蛋白质一级结构的测定，既要测定蛋白质的分子量，又要测定亚基和寡聚体的分子量，以及水解、酶解片段的分子量。常规的分子量测定主要有渗透压法、光散射法、超速离心法、凝胶层析及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。这些方法存在样品消耗量大，精确度低、易受蛋白质的形状影响等缺点(赵善楷等，1996)。
本发明是利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)，快速表征小麦LMW-GS，并确定其精确分子量的一种新方法，该方法具有以下特征(1)样品用量少，一般半粒种子(约20mg)即可满足需要。
(2)提取方法简单，无有毒试剂，而SDS-PAGE提取液中常常含有有毒试剂，样品制备时间长。
(3)所用时间短，分离迅速，适合高通量分析。SDS-PAGE分离LMW-GS一般需要1-2个小时(小槽薄层胶)或10多个小时(大槽)，经过染色、脱色，得到最后电泳图谱往往需要1-2天，而MALDI-TOF-MS分析一个样品只需要几分钟。
(4)分辨率高。在SDS-PAGE图谱中很难区分的亚基在质谱中很容易区分。
(5)检测灵敏敏度。一般只需10-100pmol蛋白样品即可检测，而SDS-PAGE的上样量至少需要微升级。
(6)可检测的相对分子质量范围广(上限可达几十万)。
(7)分辨率(可达600m/Δm)和精确度高(内标法可达0.01％)。
(8)结果保存分析容易。直接以图片方式存贮，只需做简单处理即可用于分析比较。
(9)可获得精确分子量信息，精度远远高于SDS-PAGE方法。
获得精确的分子量信息对进一步研究蛋白质的结构与功能非常重要，特别是蛋白质翻译后修饰(Protein translational modifications，PTMs)的研究。因此，质谱技术很有可能成为一种高灵敏度鉴定小麦低分子量谷蛋白亚基的微量技术，具有广阔的应用前景。
图1六倍体面包小麦品种“京411”(Triticum aestivum L.)低分子量谷蛋白亚基SDS-PAGE(A)和质谱鉴定(B)，图1A中，1为全部的麦谷蛋白，2为低分子量麦谷蛋白，3为高分子量麦谷蛋白(含部分低分子量谷蛋白)；图2四倍体野生二粒小麦(Triticum dicoccoides)YS-5和YS-13低分子量谷蛋白亚基的质谱鉴定；图3二倍体粗山羊草(Aegilops tauschii)低分子量谷蛋白亚基的质谱鉴定；图4栽培一粒小麦(Triticum monococcum)TM-1和TM-3低分子量谷蛋白亚基的质谱鉴定。
具体实施例方式
实施例1小麦低分子量谷蛋白亚基的SDS-PAGE鉴定(1)植物材料小麦品种“京411”。
(2)LMW-GS的提取20mg种子砸成粉末状放入1.5ml离心管，加入70％乙醇150μl，涡旋30-60min，10000g离心10min，去上清。加入异丙醇250μl，65℃水浴30min，10000g离心10min，去上清并用滤纸吸干，重复3次。加入0.1ml 50％异丙醇(含80mM Tris-HCl[pH8.0]+1％DTT)涡旋混匀，65℃水浴30min。再加入0.1ml50％异丙醇(含80mM Tris-HCl[pH8.0]+1.4％的4-乙烯吡啶)涡旋混匀，65℃水浴30min，12000g离心15min。取上清用40％丙酮室温沉淀3小时，12000g离心15min，收集上清；将上清用80％丙酮在-20℃沉淀过夜，13000g离心15min，收集沉淀，沉淀即为小麦低分子量谷蛋白亚基。
(3)LMW-GS的SDS-PAGE分离与鉴定①SDS-PAGE电泳样品的制备在沉淀中加入100μl的样品缓冲液(2％SDS，0.02％溴酚蓝，0.08M Tris-HCl，pH8.0，40％甘油)，65℃水浴中振荡30分钟，12000g离心10分钟，作SDS-PAGE上样用。
②SDS-PAGE电泳利用Boi-Rad Mini-PROTEAN 3电泳槽、5％浓缩胶、12％分离胶，Tris-甘氨酸缓冲液系统，15mA电泳2小时，0.1％考马斯亮蓝R-250染色，10％乙醇和10％乙酸脱色，电泳图谱如图1A所示。
实施例2LMW-GS的MALDI-TOF-MS鉴定(1)植物材料六倍体面包小麦(Triticum aestivum L.，AABBDD)品种“京411”。
四倍体野生二粒小麦(Triticum dicoccoides，AABB)YS-5、YS-13二倍体粗山羊草(Aegilops tauschii，DD)TD121、TD128、TD132二倍体栽培一粒小麦(Triticum monococcum L.，AmAm)TM1、TM3(2)质谱分析样品的制备20mg种子砸成粉末状放入1.5ml离心管，加入0.5M NaCl溶液100μl，涡旋30-60min，5000g离心10min，去上清。加入ddH2O 200μl，涡旋30min，5000g离心10min，去上清，重复3次。加入0.4ml 50％正丙醇涡旋混匀，室温放置30min，12000g离心5min，去上清，并用滤纸吸干净，此步骤重复3次。加入0.2ml 50％正丙醇(含80mM Tris-HCl[pH8.5]+1％DTT)，振荡混匀，65℃水浴30min。取上清用40％丙酮室温沉淀3小时，13000g离心15min，收集上清。将上清用80％丙酮在-20℃沉淀过夜，13000g离心15min，收集沉淀，沉淀即为小麦低分子量谷蛋白亚基。然后用真空干燥仪干燥沉淀，加入50μl 20％乙腈溶液(含0.1％TFA)溶解。
(3)MALDI-TOF-MS使用岛津AX1MA-CFRTMPlus型基质辅助激光解析电离飞行质谱仪(配有软件用于系统操作和数据处理)，全自动样品处理，软件控制精确定位，具有延迟提取(DE)、源后裂解(PSD)功能。
①靶板的清洗(384型)用棉球沾取甲醇，擦去靶板上的样品，1％甲酸超声10-15min，ddH2O冲洗，加丙酮超声10-15min，加甲醇超声10-15min，加水超声10-15min，取出靶板，用甲醇冲洗，通风橱中干燥。
②基质的选择与制备基质选用芥子酸SA(3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸，3，5-Dimethexycinnamic acid)，10mg基质溶于1ml50％乙腈+0.05％TFA中，避光保存。
③标样的制备与选择LMW-GS分子量的测定Albumin-Aldrase(66431.08、33216.0、39212.88)，0.1％TFA溶解。
④上样前处理1％TFA平衡ZIPtip，过滤样品，反复抽吸5-10次，1％TFA过滤，0.4μl Elution Buffer洗脱样品。
⑤参数的设置分子量的测定采用线性模式，分子量范围10000-100000Da。
⑥点样(三明治法)基质0.5μl，样品0.5μl，基质0.5μl。
⑦质谱测定待样品干燥后将靶板放入质谱的样品舱，依以下程序进行靶板位置的校正→标样的测定、校正(选用Average、Threshold-Apex)→样品的校正、测定(选择与标样一致的仪器参数)→数据保存。
⑧图像处理利用KratosAnalytical ltd.lanchpad V2.4.0软件进行图像处理。根据处理结果，可获得不同品种LMW-GS组成图谱和各亚基的精确分子量，如图1B所示。
实施例3低分子量谷蛋白亚基质谱鉴定方法的应用(1)LMW-GS表征与小麦品种鉴定普通小麦为异源六倍体种(2n＝6x＝42)，有许多丰富的近缘种质资源，包括二倍体粗山羊草(DD)、二倍体栽培一粒(AA)、四倍体野生二粒和栽培二粒小麦(AABB)等，在这些近缘种中，LMW-GS变异非常丰富，蕴藏着大量的优质候选基因，是面包小麦品质改良的重要基因资源。因此有效的鉴定手段是充分利用这些资源的关键。同时，LMW-GS图谱可作为品种鉴定的可靠标记，对育种中的标记辅助选择和品种权益保护具有重要意义。利用所建立的LMW-GS质谱鉴定方法，对不同倍性的小麦进行低分子量谷蛋白亚基的鉴定，获得了高分辨度的LMW-GS图谱(结果如图1-图4所示)。根据这些低分子量谷蛋白亚基的质谱图谱，可以对不同的小麦品种或种质进行表征与鉴定。鉴于质谱技术的高灵敏度和高精确度，对LMW-GS的分离鉴定效果明显优于传统的SDS-PAGE方法。
(2)LMW-GS的精确分子量确定MALDI-TOF-MS方法可准确测定小麦低分子量谷蛋白亚基的分子量，为进一步研究其结构与功能奠定基础。小麦不同近缘种低分子量谷蛋白亚基分子量的测定结果见图2-4图。质谱方法检测的LMW-GS的数量比SDS-PAGE多，测得的分子量精度也要高得多，因此该技术是精确测定小麦低分子量谷蛋白亚基分子量的有效方法。
(3)LMW-GS翻译后修饰(PTMs)鉴定小麦的面粉品质与麦谷蛋白亚基的组成密切相关，不同类型的麦谷蛋白亚基对于面筋品质的贡献不同。然而，也有研究表明，即使同一亚基，在不同的小麦品种中对面粉品质的贡献也不完全相同。针对这一现象，推测小麦麦谷蛋白亚基可能存在翻译后修饰现象，不同程度的修饰，如糖基化和磷酸化等有可能导致不同品种中同一亚基对面粉品质的贡献不同。然而，近年来在对小麦麦谷蛋白亚基的翻译后修饰的研究中，获得了不同的研究结果。有人认为小麦麦谷蛋白亚基存在糖基化和磷酸化修饰的现象，且发生修饰的程度较高，而有人则认为麦谷蛋白亚基不存在翻译后修饰。产生这一结果的原因在很大程度上是由于研究方法的不同造成的。MALDI-TOF-MS精确分子量测定方法的建立将进一步促进低分子量谷蛋白亚基翻译后修饰的深入研究。
通过比较用质谱方法测出的谷蛋白亚基的分子量大小和用基因序列推导得到的谷蛋白亚基分子量大小的差异，可以初步判断小麦谷蛋白亚基翻译后的修饰状况。当分子量差异超过基因序列推导的0.1％(质谱仪允许误差)时，可初步推断谷蛋白亚基可能发生了某种形式的翻译后修饰。
根据以上设想，我们采用一对等位基因特异PCR引物对栽培一粒小麦(Triticum monococcum L.，AmAm，2n＝2x＝14)TM-1和TM-3的基因组DNA进行扩增，得到2个不同的全基因编码序列，包括上游启动子、开放阅读框和下游序列，无内含子。根据推导出的氨基酸序列，2个基因LMW-M1和LMW-M3均为典型的LMW-i型亚基，分子量分别为38708.7Da和38720.8Da。然后提取TM-1和TM-3的LMW谷蛋白亚基，利用MALDI-TOF-MS分析获得了上述2个亚基的精确分子量，分别为38789.6Da和39026.9Da(结果见图4)。经过比较，发现LMW-M1亚基的分子量与基因推导的十分接近(小于0.1％)，而LMW-M3亚基的分子量差异大于允许误差，由此推测LMW-M1亚基没有发生翻译后修饰，而LMW-M3亚基则存在某种形式的翻译后修饰，如糖基化和磷酸化修饰等。在此基础上可进一步进行LMW-GS翻译后修饰类型、修饰位点及其功能研究。
权利要求
1.一种鉴定小麦低分子量谷蛋白亚基的质谱方法，包括如下步骤(1)在制备小麦低分子量谷蛋白亚基的质谱样品时，先用35-45％的丙酮沉淀蛋白提取液，离心后取上清，再用75-85％的丙酮沉淀清液中低分子量谷蛋白亚基；(2)在获得低分子量谷蛋白亚基沉淀后，用溶解液溶解小麦低分子量谷蛋白亚基，溶解液的配比为以溶解液体积为计量基准，溶解液中乙腈溶液的体积为溶解液体积的15-25％，TFA所占的体积为溶解液体积的0.1％，其余为水。
2.如权利要起1所述的鉴定小麦低分子量谷蛋白亚基的质谱方法，其特征在于在制备小麦低分子量谷蛋白亚基的质谱样品时，先用40％的丙酮沉淀蛋白提取液，离心后取上清，然后用80％的丙酮沉淀清液中的低分子量谷蛋白亚基。
3.如权利要起1所述的鉴定小麦低分子量谷蛋白亚基的质谱方法，其特征在于用溶解液溶解小麦低分子量谷蛋白亚基，溶解液的优选配比为以溶解液体积为计量基准，溶解液中乙腈溶液的体积为溶解液体积的20％，TFA所占的体积为溶解液体积的0.1％，其余为水。
全文摘要
本发明公开了一种鉴定小麦低分子量谷蛋白亚基的质谱方法，属于生命科学蛋白质组技术领域，特别涉及小麦低分子量谷蛋白亚基分子量的精确鉴定以及基于此技术方法对麦谷蛋白亚基的进一步表征。本发明一种鉴定小麦低分子量谷蛋白亚基的质谱方法，包括如下步骤(1)制备小麦低分子量谷蛋白亚基的质谱样品时，先用35－45％的丙酮沉淀蛋白提取液，离心后取上清，再用75－85％的丙酮沉淀清液中低分子量谷蛋白亚基；(2)在获得低分子量谷蛋白亚基沉淀后，用溶解液溶解小麦低分子量谷蛋白亚基，以溶解液体积为计量基准，溶解液中乙腈溶液的体积为溶解液体积的15－25％，TFA所占的体积为溶解液体积的0.1％，其余为水。
文档编号G01N23/00GK1800812SQ20051013531
公开日2006年7月12日 申请日期2005年12月28日 优先权日2005年12月28日
发明者晏月明, 张倩, 李巧云, 安学丽, 张艳贞, 王爱丽 申请人:首都师范大学