专利名称：：小麦高分子量谷蛋白亚基的测定方法小麦高分子量谷蛋白亚基的测定方法一、故术领域本发明涉及小麦高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)的测定方法，属于农产品加工及品质检测
技术领域：
。具体说是一种从极少量的小麦中提取HMW-GS加予以分离，并对提取分离后的HMW-GS进行准确定量分析，可用于科研工作者进行HMW-GS的定量分析并探讨其与小麦加工品质间关系等方面的研究，同时可用于迅速了解小麦籽粒的HMW-GS组成与含量。二
背景技术：
：小麦是我国主要的粮食作物。随着经济发展和生活水平的提高，人们对优质面粉的需求量迅速增大，需加快优质专用小麦品种的选育并研发配套的栽培技术。同时，在小麦的收购与加工过程中，也需要快速准确简便的品质检测方法，以提高小麦品质评价效率，指导加工技术的确立。蛋白质和淀粉是小麦籽粒最主要的组分，分别占籽粒重的9-18%和65-70%，二者的含量和组成决定了小麦籽粒的品质和最终加工用途。因此，有关蛋白质和淀粉及其组分形成机理的研究一直是小麦品质生理生态领域的研究热点与核心，尤以蛋白质及其组分的研究更受重视。麦谷蛋白在小麦加工品质中起着主导作用。根据在不同溶剂中的溶解能力，可将蛋白质分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、麦谷蛋白和残留蛋白等组分。其中，麦谷蛋白和醇溶蛋白是小麦籽粒主要的储藏蛋白，各占胚乳总蛋白的40%以上，构成了面筋的主体，决定着面团的粘弹性，并以麦谷蛋白为主导因素。如小麦加工品质在储藏4年后烘焙品质达到最佳，这主要与储藏过程中醇溶蛋白提取率降低，麦谷蛋白提取率增加并进一步交联有关。高分子量麦谷蛋白亚基在小麦加工品质中至关重要。0rth和Bushuk(I"2)最早采用SDS-PAGE技术将麦谷蛋白分离为高分子量(HMW-GS)和低分子量(LMW-GS)两种蛋白亚基类型，这两种亚基的组成与含量决定着麦谷蛋白的加工性能，以HMW-GS的作用更为重要。研究发现，HMW-GS是天然麦谷蛋白具有弹性的分子基础，不同小麦品种面包烘焙品质变异的30一69"/。可归因于HMW-GS的变化，其中英国品种为47%，西班牙品种为43%，德国品为30%,中国品种为69%。再如，小麦储藏过程中品质的变化还与麦谷蛋白亚基组成改变有关LMW-GS储藏过程中因聚合而减少，HMW-GS相应增加。HMW-GS的亚基构成及对品质的贡献。HMW-GS分别由位于小麦染色体1A、IB和1D长臂上的Glu-Al、Glu-Bl和Glu-Dl三个位点上的等位基因控制。Glu-Al位点有3对等位基因，编码l、2*和化11亚基；Glu-Bl位点有11对等位基因，编码6、7、8、9、13、14、15、16、17、18、19、20、21和22亚基；Glu-Dl位点的6对等位基因，编码2、3、4、5、10和12亚基。大多数六倍体栽培小麦品种只有3—5条亚基，其中2条由1D控制，1或2条由1B控制，1或G条由1A控制。优质面包小麦品种的最优亚基构成为Glu-Al控制的1或2*亚基、Glu-Bl控制的7+8或17+18亚基；Glu-Dl控制的5+10亚基。这主要是因为Glu-Bl位点品质效应来源于7+8、7+9和17+18亚基的差异，Glu-Dl位点品质效应来自于5+10和2+12亚基的差异。在众多的HMW-GS评分系统中，均以5+10亚基得分最高，2*、7+8等亚基评分也较高。此外，陆燕和马传喜(2000)分析了国内外37个强筋和59个普通小麦品种，发现强筋小麦品种Glu-Al位点的1亚基频率为83.8%、2*亚基为10.8、Null亚基仅占5.4%,普通小麦品种则分别为48.3%、1.7%和50%。强筋小麦品种Glu-Bl位点的7+8和7+9亚基频率分别为43.2%和32.4%,普通小麦分别为25.4%和49.2%。强筋小麦品种Glu-Dl的2+12和5+10亚基分别为10.8%和86.5%,普通小麦分别为59.3%和28.8%。因此，很多育种工作者将优质HMW-GS组合做为筛选优质小麦品质的重要指示，并希期从小麦远缘种质中寻找更优质的亚基，通过转基因手段提高栽培小麦品质。HMS-GS积累量在小麦加工品质中起着更重要的作用。随着对小麦籽粒HMW-GS与品质形成关系研究的深入，人们发现与亚基组成相比，HMS-GS含量对小麦烘烤品质更重要。在很多情况下，含5+10亚基的小麦品种面包品质性状比含有2+12亚基的品种还差，进一步研究发现，这与各腦W-GS的积累量不同有关，即面包品质不仅取决于优质HMW-GS组合，更取决于各亚基积累量的综合作用。国外的研究结果表明，5、9、10'亚基含量与品质参数呈正相关。烘烤品质优良的小麦品种HMW-GS绝对表达量和相对表达量高于品质较差的品种，强筋型面粉的HMW-GS相对表达量远远高于劣质面粉。由此可见，HMW-GS表达量对烘烤品质有决定性的作用。如能明确小麦籽粒HMW-GS形成的基本规律、形成机理与调控途径，则可通过栽培措施，在现有小麦品种品质水平的基础上，进一步提高小麦籽粒品质。
发明内容技术问题本发明目的之一是在前人已有的基础上提供一个简单、快捷地从小麦籽粒中分离提取高分子量谷蛋白亚基并对其进行定量分析的方法；本发明的流程简单、效率高，而且测定分析方法精度高、重复性好，可以用于科研工作者进行HMW-GS的定量分析并探讨其与小麦加工品质间关系等方面的研究，同时可用于品质检测，迅速了解小麦籽粒的HMW-GS组成与含量。技术方案一种小麦高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)的测定方法，包括①取样在小麦开花期剪下几个穗子，将籽粒从穗子中拨出，105'C杀青20min后自然晒干或冷冻干燥或直接用小麦成熟期自然晒干的籽粒；②研磨取完整籽粒3-15粒研磨得全麦粉；③提取称取全麦粉40mg，加入lmL样品缓冲液，缓冲液为62.5mmolL—1Tris-HC1，pH6.8;10%丙三醇;2%SDS和5%-p巯基乙醇;立即振荡混匀lmin,摇床振荡30min，将离心管放入90。C的水浴中浸提5min,8000x^离心5min，收集上清液待用；④SDS-PAGE:步骤③中所得的上清用于SDS-PAGE,分离胶质量比浓度10%，浓缩胶质量比浓度为4%，胶厚度lmm;每板电流15raA,电泳完毕后，用质量比O.05%考马斯亮蓝R250染色24h,然后用蒸馏水脱色2d,采用蛋白凝胶成像系统对凝胶进行扫描；凝胶回收HMW-GS定量采取切胶比色法，将脱过色的胶置于白光透射仪上，用刀片从凝胶上切下染上色的蛋白质条带，置于玻璃试管中；条带洗脱向上述玻璃试管中加入体积比50%的含有质量比3%SDS的异丙醇，用封口膜封口，37。C水浴中静置Mh提取HMW-GS;⑦HMW-GS定量提取液于595nm测定吸光值，用不同点样量的标准蛋白116kD做标准曲线，计算各样品HMW-GS含量，并取各次电泳各样品的平均值作为该样品测定的HMW-GS含量。有兹效果本发明具有如下优点1、本发明使用的样品量少，仅需40mg全麦粉，也可使用单个籽粒进行测定，简单快捷，对籽粒中亚基含量的定量准确、完全。是小麦高分子量谷蛋白亚基组成及含量测定的一种理想的方法，对其相关研究具有重要的现实意义。2、本发明染色脱色过程中仅使用水作为溶剂，安全无毒，大大减轻了对实验人员的毒害和环境的污染。3、对HMW-GS含量的测定较为准确。目前开发的HMW-GS分析方法主要有SDS-PAGE、RP-HPLC、毛细管电泳、PCR方法和ELISA等，但上述几种方法多适于HMW-GS组成的定性分析，因此常用于品质育种工作中亲本的确定及含优质亚基后代的筛选。目前最常用的HMW-GS定量方法是SDS-PAGE结合凝胶图像分析软件进行，但目前所有软件均基于图像识别技术。而在具体研究中我们发现，该方法对凝胶质量要求很高，且易受背景干扰，重复测量误差较大，特别在条带图像的选取时，要求分析人员有较高的操作水平，有时同一凝胶图像不同次测量间误差也很大(特别是条带出现"皱眉"时)。此外，该方法缺少统一的单位，不同研究者的测定结果难以相互比较。如宋建民等(2003)以20mg面粉中不同亚基的扫描面积(mm2)为单位；于亚雄等(2004)则直接用GeneTool程序分析亚基含量，单位由软件内定；杜金哲等(2003)则以扫描谱带像素数(面积和净平均强度即灰度的乘积)表示亚基含量，单位为Pixel。本发明采用蛋白质组学中切胶的方法(将凝胶上各亚基条带分别切割提取)，用比色法进行定量(电泳中同步加入3个不同浓度梯度的标准蛋白，作为校正曲线)，实现了各HMW-GS的准确定量，单位为pg蛋白/mg面粉或籽粒，获得了面粉中的HMW-GS绝对含量，而不仅仅是相对含量。不仅测定重复性显著提高，不同研究者的测定结果还可相互比较。这为不同领域工作者开展HMW-GS相关研究奠定了技术基础。四图1为小麦高分子量谷蛋白亚基提取分离及定量分析的流程图。图2为电泳所得凝胶。图3为用本方法所得不同研究结果比较。不同水分处理下不同品种HMW-GS含量动态和不同氮素处理下籽粒总服W-GS积累动态五具体实施例方式本发明中所使用的样品是指小麦开花以后的籽粒。小麦高分子量谷蛋白亚基于开花10-15天开始形成，直至籽粒成熟。需要注意的是在小麦开花前期籽粒中的高分子量谷蛋白亚基含量较少，小麦HMW-GS形成初期积累较少，随着小麦灌浆成熟呈递增趋势，高峰出现在花后20d后，特别是花后25d至成熟期间。因此，在准备新鲜样品时应注意花前期样品量要大一些，中期和后期可相应减少。所述的提取分离过程及测定步骤主要包括1、取样在小麦开花期选择同日开花、长相一致的穗子进行标记，取样时视需要剪下几个穗子。及时将籽粒从穗子中拨出，1051C杀青20min后自然晒干，亦可釆用冻干方式。在大部分案例下，如用于小麦收购检测、品种间或处理间比较时，一般直接选择成熟期收获后自然干燥的籽粒。2、研磨选择大小一致、形状相同、无病虫害的完整籽粒3-5粒研磨(花期15天之前軒粒亚基含量较低，可取10-15粒)。3、提取称籽粒样品研磨所得全麦粉40mg,加入lmL样品缓冲液(62.5mmolL-lTris-HCl，pH6.8;10%丙三醇；2%SDS;5%-p巯基乙醇),立即振荡混匈lmin，摇床振荡30rain。将离心管放入90TC的水浴中浸提5min。8000xg离心5min，收集上清液待用。4、SDS-PAGE:步骤3中所得的上清用于SDS-PAGE。分离胶浓度10%，浓缩胶浓度为4%,胶厚度lmm;每板电流15mA。电泳完毕后，用0.05%考马斯亮蓝R250染色24h,然后用蒸馏水脱色2d。釆用美国伯乐公司生产的VersaDoc蛋白凝胶成像系统对凝胶进行扫描。试验中以中国春(null,7+8，2+12)和Marquis(1，7+9，5+10)为对照，对待测样品HMW-GS类型进行确定。用分子量与含量已知的标准蛋白(Sigma)作对照，用于各样品HMW-GS含量分析。其中标准蛋白占3个泳道，每泳道点样量成梯度。每个样品至少重复2-3次电泳(图2)。5、凝胶回收HMW-GS定量采取切胶比色法，将脱过色的胶置于白光透射仪上，用刀片从凝胶上切下染上色的蛋白质条带，置于玻璃试管中。6、条带洗脱向上述玻璃试管中加入50%含有3%SDS的异丙醇，用封口膜封口，37。C水洛中静置24h提取HMW-GS。7、HMW-GS定量提取液于595nm测定吸光值。用分子量与含量已知的标准蛋白(116kD)做标准曲线，经标准曲线换算即可得提取液样品测定的HMW-GS含量。具体方法为以不同点样量的标准蛋白(Sigraa)含量与吸光值做出标准曲线，对各切胶条带蛋白质含量进行校正。根据样品用量，得出样品中各亚基含量(表1)，单位为ug蛋白mg—t面粉或ug蛋白粒—1籽粒。表1本发明中HMW-GS定量方法与常规凝胶成像系统分析方法结果比较<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注(1)每个样品重复4次电泳的测定结果，每次电泳每个样品点二条泳道，取平均作为该样品各亚基的含量值，单位为ngmg—'。(2)常规方法电泳时也加入了三个不同浓度梯度的已知蛋白。(3)采用本发明专利方法，同一样品HMW-GS测定结果的极差、标准差和变异系数等均明显小于常规方法。权利要求1、一种小麦高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)的测定方法，包括①取样在小麦开花期剪下几个穗子，将籽粒从穗子中拨出，105℃杀青20min后自然晒干或冷冻干燥或直接用小麦成熟期自然晒干的籽粒；②研磨取完整籽粒3-15粒研磨得全麦粉；③提取称取全麦粉40mg，加入1mL样品缓冲液，缓冲液为62.5mmol·L-1Tris-HCl，pH6.8；体积比10％丙三醇；质量比2％SDS和体积比5％β-巯基乙醇；立即振荡混匀1min，摇床振荡30min，将离心管放入90℃的水浴中浸提5min，8000×g离心5min，收集上清液待用；④SDS-PAGE步骤③中所得的上清用于SDS-PAGE，分离胶质量比浓度10％，浓缩胶质量比浓度为4％，胶厚度1mm；每板电流15mA，电泳完毕后，用质量比0.05％考马斯亮蓝R250染色24h，然后用蒸馏水脱色2d，采用蛋白凝胶成像系统对凝胶进行扫描；⑤凝胶回收HMW-GS定量采取切胶比色法，将脱过色的胶置于白光透射仪上，用刀片从凝胶上切下染上色的蛋白质条带，置于玻璃试管中；⑥条带洗脱向上述玻璃试管中加入体积比50％且含有质量比3％SDS的异丙醇，用封口膜封口，37℃水浴中静置24h提取HMW-GS；⑦HMW-GS定量提取液于595nm测定吸光值，用不同点样量的标准蛋白116kD做标准曲线，经标准曲线换算即可得提取液样品测定的HMW-GS含量。全文摘要本发明公开了小麦高分子量谷蛋白亚基的测定方法，属于农产品加工及品质检测
技术领域：
。包括高分子量麦谷蛋白亚基的提取分离和定量分析两个方面的技术。取面粉(或单个籽粒)、总高分子量麦谷蛋白亚基提取、用SDS-PAGE分离各亚基、凝胶的染色脱色；所得凝胶切下各亚基所在条带，洗脱所得洗脱液测定吸光值，经标准曲线换算即可得其含量。能快速准确地测定小麦高分子粮谷蛋白亚基的组成，并测定其绝对含量。提取及测定过程快捷安全，可用于迅速了解小麦的HMW-GS组成与含量，指导新品种的选育、栽培措施及小麦收购与麦制品加工。文档编号G01N27/447GK101303292SQ20081012418公开日2008年11月12日申请日期2008年6月17日优先权日2008年6月17日发明者云伯,东姜,岳鸿伟,戴廷波,曹卫星,奇荆申请人:南京农业大学