专利名称：小麦高分子量谷蛋白亚基的酸性毛细管电泳鉴定方法
技术领域：
本发明涉及小麦高分子量谷蛋白亚基的鉴定方法，特别是涉及通过酸性毛细管电泳(A-CE)技术对小麦高分子量谷蛋白亚基进行鉴定的方法。
背景技术：
小麦种子贮藏蛋白主要由醇溶蛋白和谷蛋白组成，它们在组成上具有高度的异质性和复杂性。醇溶蛋白分子量约在30000-80000道尔顿之间，在酸性凝胶电泳条件下，一个品种可分离出15-30个组分，根据其相对迁移率可分为α、β、γ和ω四种醇溶蛋白，它们分别占其总量的25％、30％、30％和15％。麦谷蛋白包括高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)两种，它们分别占胚乳总蛋白含量的10％和30％左右。
大量研究证明，小麦贮藏蛋白，特别是高分子量谷蛋白亚基的组成和含量对品质具有十分重要的作用。面粉可以加工成各种面包、面条、饼干、糕点、馒头等多种专用食品，其特殊的制面特性主要是由贮藏蛋白的二硫键多聚体结构决定的，其中谷蛋白主要决定面团的弹性，而醇溶蛋白则决定面团的延展性。目前已清楚HMW-GS由第1部分同源群染色体上的Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位点编码。每个位点均有二个紧密连锁基因，分别控制分子量较大的x型亚基和分子量较小的y型亚基(用SDS-PAGE方法测得的分子量为90-150KD)。由于部分基因处于沉默和不表达状态，多数普通小麦品种在SDS-PAGE图谱上仅能检测到3-5个高分子量谷蛋白亚基，其中2个由Glu-D1控制，1个或2个由Glu-B1控制，1个或0个由Glu-A1控制。在各个位点上均存在广泛的等位基因变异，目前已在面包小麦中鉴定和命名了20多个HMW-GS等位基因。不同的亚基及其等位基因对小麦品质的作用各异，在已经检测到的高分子量谷蛋白亚基中，1Dx5+1Dy10(4)、1Bx17+1By18(3)、1Bx7+1By8(3)与1Bx13+1By16(3)、1Ax1(3)、1Ax2*(3)等亚基对或亚基与小麦优质品质有关(括号内为品质评分)，而1Dx2+1Dy12为劣质亚基对，亚基对1Dx4+1Dy12对品质有重要作用，其品质评分仅次于1Dx5+1Dy10。在我国推广品种中1Dx5+1Dy10、1Bx17+1By18等优质亚基对的频率很低，这可能是造成品质差的重要原因之一。当前在小麦品质育种工作中的重点是对HMW-GS组成的改良，特别是要提高优质高分子量谷蛋白亚基或亚基对的频率。
近年来，尽管通过基因工程和分子标记辅助选择手段改良小麦品质已显示出很大的应用前景，但这些方法往往费用昂贵、分析成本高、费工费时，而且针对优质贮藏蛋白基因的基因工程和分子标记辅助选择方法离实际应用还有一定距离，目前还难以满足品质育种工作的要求。因此急需研发新的更为可靠的优质基因标记辅助选择技术。目前常规育种方法与标记辅助选择技术相结合是小麦品质改良的主要手段，其中杂交早期世代优质贮藏蛋白亚基快速、微量、准确的鉴定是提高育种效率的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用酸性毛细管电泳技术快速鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，主要任务是解决针对小麦种子中贮藏的高分子量谷蛋白亚基的鉴定给出酸性毛细管电泳的缓冲液的类型和添加成分、电泳条件参数和毛细管冲洗程序，该方法能在小麦杂交早期世代对小麦种子优质贮藏蛋白亚基作出快速、准确的鉴定与筛选。
本发明的技术方案包括材料取样、样品制备、高效毛细管电泳和数据处理分析，其中材料取样、样品制备以及数据处理采用的是常规方法，其特征是高效毛细管电泳时的电泳缓冲液(buffer)为100-120mm磷酸-甘氨酸缓冲液，该缓冲液pH值为2.5-2.8，添加有18-22％乙腈和0.04-0.06％羟脯氨酰甲基纤维素(HPMC)，具体电泳条件参数为毛细管内径25或50μm毛细管长度24-28cm电压10.0-13.5KV温度37-40℃进样8-12KV，6-10sec在上述的技术方案中，为了能够连续检测样品和保证检测结果的准确性，在进行高效毛细管电泳时，对毛细管进行冲洗必须按冲洗程序操作，按照冲洗目的的不同，冲洗程序具体分为以下四种情况1、对于新的毛细管在使用前要进行预处理冲洗，冲洗程序如下H2O 4-6min0.1MNaOH 9-12minH2O 4-6min1MH3PO48-12minBuffer 50-75min2、进样前对毛细管进行冲洗，冲洗程序如下
H2O 1.5-2.5min0.1MNaOH 4-6minH2O 4-6min1MH3PO44-6minBuffer 16-24min3、当一次鉴定测定多个样品时，两次样品检测之间要进行冲洗，冲洗程序如下1MH3PO41.5-3minBuffer 1.5-2.5min4、检测结束后对毛细管进行冲洗，冲洗程序如下1MH3PO44-6minH2O 4-6min0.1MNaOH 1.5-2.5minH2O 13-17minN29-11min通过本发明可以建立重要HMW-GS标准毛细管电泳图谱，进而形成对优质亚基进行鉴定的一套完整的技术体系。
本发明的优点在于(1)样品用量少微量检测是开展杂交早期世代优质基因选择的关键。本技术只需单粒种子无胚端10-15mg胚乳面粉，并可进行5次以上重复分析。另外，所提取的蛋白质干样可长期保持而不影响分离效果。
(2)分离时间短利用上述电泳参数，单个样品一般在12min分离完成，而常规SDS-PAGE方法一般需要1-2天时间。
(3)亚基电泳模式分辨度高、易于应用在酸性缓冲液条件下，多数HMW-GS表现为一个主峰和1-3个副峰(如附图所示)。理论上A-CE技术每米理论塔板数远远高于高效液相色谱和SDS-PAGE方法。该技术可对目前所鉴定的优质HMW谷蛋白亚基进行快速分离和鉴定，包括一些SDS-PAGE和HPLC方法难以区分的亚基，如17+18，2和2*和近年来发现的一些迁移率很相似的新亚基，以及10和12，2和5等(RP-PLC不能有效分离)。通过与优质亚基标准图谱以及单样与混合样的比较分析，能准确鉴定5+10与2+12以及14+15、13+16、17+18、7+8、1、2*等亚基。
(4)重复性好利用上述冲洗方法可以获得较好的重复性分离。重复间峰迁移时间和峰高的相对标准偏差(RSD)分别小于1％和3％，无峰拖尾现象。
(5)分离自动化程度高毛细管电泳从进样到结果分析自动化程度高，简便易于操作，这是传统SDS-PAGE方法所无法比拟的。
(6)分析成本低除了毛细管电泳仪器较贵以外，分析成本低，一般只需一些常用试剂，所有试剂均用量很少，而且不需使用丙稀酰胺等有毒药品。因此，与传统方法相比，A-CE技术的分析成本较低。
此外，该鉴定方法对小麦流通与加工以及品种权益保护等领域也具有重要的应用价值。
图1小麦品种Hope(1，6+8，5+10)高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)的酸性毛细管电泳(A-CE)连续20次分离重复性比较图谱。图中显示第1、5、10、15和20次分离的电泳图谱。
图2小麦品种中国春、Hope和硬粒小麦品种Simeto高分子量谷蛋白亚基的酸性毛细管电泳分离图谱。
A中国春(N，7+8，2+12)B Hope(1，6+8，5+10)C Simeto(N，7+8)图3密穗小麦(Triticum compactum L.，2n＝6x＝42，AABBDD)Club20(N，17+18，2+12)和面包小麦品种Kontrast(N，17+18，5+10)单样及混合样(1∶1)HMW-GS酸性毛细管电泳分离与鉴定图谱。
具体实施例方式
实施例11.材料取样用小麦品种Hope的种子作为试验材料，随机选取种子无胚乳端10-15mg用于谷蛋白提取和毛细管电泳。
2.样品制备高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)提取方法备用试剂A.50％正丙醇
B.50％正丙醇+1％DTTC.丙酮(分析纯)D.20％乙腈+0.1％三氟乙酸(TFA)操作方法(1)取单粒种子，用刀片切取无胚乳端(约10-15mg)，准确称量后用硫酸纸和小铁锤扎碎成细粉，放入1.5ml离心管中；(2)加入50％正丙醇1ml，45℃水浴提取10分钟，10000rpm离心5分钟，去掉上清液；(3)重复上述步骤三次，搀留的上清液用滤纸吸干；(4)加入50％正丙醇+1％DTT 800μl，45℃震荡提取30分钟，1200rpm离心10分钟，取上清液转入干净的1.5ml新离心管中；(5)加入预冷分析纯丙酮至终浓度40％，室温静置沉淀30分钟，12000rpm离心15分钟，所得沉淀即为HMW-GS；(6)按比例(w/v1mg+10μl)加入20％乙腈+0.1％w/v三氟乙酸(TFA)，充分溶解、离心后即可进行毛细管电泳分析；同时也可将沉淀放入-20℃中保存，待需要时溶解进行毛细管电泳分析。
3.高效毛细管电泳(HPCE)仪器设备Bio-Rad(Biofocus 3000)公司生产的高效毛细管电泳系统(配有软件用于系统操作和数据处理)。弹性石英毛细管柱内径为50μm，长度为25.5cm，外层涂有聚酰亚胺保护层，内壁均未涂层。
备用试剂毛细管电泳缓冲液100mm磷酸-甘氨酸缓冲液(该缓冲液pH值为2.50，添加有20％乙腈和0.05％羟脯氨酰甲基纤维素(HPMC))；双蒸水。
毛细管柱冲洗液A.0.1MNaOHB.1MH3PO4C.双蒸水D.电泳缓冲液毛细管冲洗程序a.新毛细管预处理程序H2O 5min0.1MNaOH 10minH2O 5min1MH3PO410minBuffer60minb.样品间冲洗程序1MH3PO42minBuffer2minc.每天实验冲洗程序进样前冲洗H2O2min0.1MNaOH5minH2O5min1MH3PO45minBuffer 20mind.结束实验冲洗1MH3PO45minH2O5min0.1MNaOH2minH2O15minN210min毛细管电泳条件电压12.5KV温度40℃进样10KV，8sec电极由+向-。
数据处理利用Biofocus Integrator软件进行数据处理，同时将电泳结果数据转换成ASC码，进行Excel处理分析。
对小麦品种Hope(1，6+8，5+10)高分子量谷蛋白亚基连续20次重复分离得到的电泳图谱如图1所示。
实施例21.材料取样分别用小麦品种中国春、Hope和硬粒小麦种子作为试验材料，随机选取种子无胚乳端10-15mg用于谷蛋白提取和毛细管电泳。
2.样品制备高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)提取方法选用的备用试剂和操作方法与实施例1相同，得到的HMW-GS沉淀可以按比例(w/v1mg+10μl)加入20％乙腈+0.1％w/v三氟乙酸(TFA)，充分溶解、离心后即可进行毛细管电泳分析；也可将沉淀放入-20℃中保存，待需要时溶解进行毛细管电泳分析。
3.高效毛细管电泳(HPCE)仪器设备Bio-Rad(Biofocus 3000)公司生产的高效毛细管电泳系统(配有软件用于系统操作和数据处理)。弹性石英毛细管柱内径为50μm，长度分别为28cm，外层涂有聚酰亚胺保护层，内壁均未涂层。
备用试剂毛细管电泳缓冲液110mm磷酸-甘氨酸缓冲液(该缓冲液pH值为2.60，添加有18％乙腈和0.04％羟脯氨酰甲基纤维素(HPMC))；双蒸水。
毛细管柱冲洗液A.0.1MNaOHB.1MH3PO4C.双蒸水D.电泳缓冲液毛细管冲洗程序
a.新毛细管预处理程序H2O 4min0.1MNaOH 9minH2O 4min1MH3PO48minBuffer50minb.样品间冲洗程序1MH3PO41.5minBuffer1.5minc.每天实验冲洗程序进样前冲洗H2O 1.5min0.1MNaOH 4minH2O 4min1MH3PO44minBuffer16mind.结束实验冲洗1MH3PO44minH2O 4min0.1MNaOH 1.5minH2O 13minN29min毛细管电泳条件电压10KV温度37℃进样8KV，10sec电极由+向-。
数据处理利用Biofocus Integrator软件进行数据处理，同时将电泳结果数据转换成ASC码，进行Excel处理分析。
中国春、Hope和硬粒小麦品种Simeto高分子量谷蛋白亚基的酸性毛细管电泳分离图谱如图2所示。
实施例31.材料取样分别用密穗小麦Club20和面包小麦品种Kontrast的种子作为试验材料，随机选取种子无胚乳端10-15mg用于谷蛋白提取和毛细管电泳。然后再用分别由密穗小麦Club20和Kontrast的种子提取的高分子量谷蛋白亚基按1∶1混合后制成的样品作为试验材料。
2.样品制备高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)提取方法选用的备用试剂和操作方法与实施例1相同，得到的HMW-GS沉淀可以按比例(w/v1mg+10μl)加入20％乙腈+0.1％w/v三氟乙酸(TFA)，充分溶解、离心后即可进行毛细管电泳分析；也可将沉淀放入-20℃中保存，待需要时溶解进行毛细管电泳分析。
3.高效毛细管电泳(HPCE)仪器设备Bio-Rad(Biofocus 3000)公司生产的高效毛细管电泳系统(配有软件用于系统操作和数据处理)。弹性石英毛细管柱内径为50μm，长度分别为24cm，外层涂有聚酰亚胺保护层，内壁均未涂层。
备用试剂毛细管电泳缓冲液120mm磷酸-甘氨酸缓冲液(该缓冲液pH值为2.80，添加有22％乙腈和0.06％羟脯氨酰甲基纤维素(HPMC))；双蒸水。
毛细管柱冲洗液A.0.1MNaOHB.1MH3PO4C.双蒸水D.电泳缓冲液毛细管冲洗程序a.新毛细管预处理程序
H2O6min0.1MNaOH12minH2O6min1MH3PO412minBuffer 75minb.样品间冲洗程序1MH3PO43minBuffer 2.5minc.每天实验冲洗程序进样前冲洗H2O2.5min0.1MNaOH6minH2O6min1MH3PO46minBuffer 24mind.结束实验冲洗1MH3PO46minH2O6min0.1MNaOH 2.5minH2O17minN211min毛细管电泳条件电压13.5KV温度38℃进样12KV，6sec电极由+向-。
数据处理利用Biofocus Integrator软件进行数据处理，同时将电泳结果数据转换成ASC码，进行Excel处理分析。
密穗小麦Club20(N，17+18，2+12)和面包小麦品种Kontrast(N，17+18，5+10)单样及混合样(1∶1)HMW-GS的酸性毛细管电泳分离与鉴定图谱如图3所示。
权利要求
1.一种小麦高分子量谷蛋白亚基的酸性毛细管电泳鉴定方法，包括材料取样、样品制备、高效毛细管电泳和数据处理分析，其中材料取样、样品制备以及数据处理采用的是常规方法，其特征是高效毛细管电泳时的电泳缓冲液为100-120mm磷酸-甘氨酸缓冲液，该缓冲液pH为2.5-2.8，添加有18-22％腈和0.04-0.06％羟脯氨酰甲基纤维素，具体电泳条件参数为毛细管的内径为25或50μm，长度为24-28cm电压10.0-13.5KV温度37-40℃进样8-12KV，6-10sec。
2.根据权利要求1所述的小麦高分子量谷蛋白亚基的酸性毛细管电泳鉴定方法，其特征在于为了能够连续检测样品和保证检测结果的准确性，在进行高效毛细管电泳时，对毛细管进行冲洗必须按冲洗程序操作，按照冲洗目的的不同，冲洗程序具体分为以下四种情况(1)对于新的毛细管在使用前要进行预处理冲洗，冲洗程序如下H2O 4-6min0.1M NaOH 9-12minH2O 4-6min1M H3PO48-12minBuffer 50-75min(2)进样前对毛细管进行冲洗，冲洗程序如下H2O 1.5-2.5min0.1M NaOH 4-6minH2O 4-6min1M H3PO44-6minBuffer 16-24min(3)当一次鉴定测定多个样品时，两次样品检测之间要进行冲洗，冲洗程序如下1M H3PO41.5-3minBuffer 1.5-2.5min(4)检测结束后对毛细管进行冲洗，冲洗程序如下1M H3PO44-6minH2O 4-6min0.1M NaOH 1.5-2.5minH2O 13-17minN29-11min
3.根据权利要求2所述的小麦高分子量谷蛋白亚基的酸性毛细管电泳鉴定方法，其特征在于通过本发明能够建立小麦HMW-GS的标准毛细管图谱，进而形成对小麦高分子量谷蛋白亚基进行鉴定的一套完整的技术体系。
全文摘要
本发明涉及小麦高分子量谷蛋白亚基的鉴定方法，特别是涉及通过酸性毛细管电泳(A－CE)技术对小麦高分子量谷蛋白亚基进行鉴定的方法。小麦贮藏蛋白，特别是高分子量谷蛋白亚基的组成和含量对品质具有十分重要的作用。当前在小麦品质育种工作中的重点是对HMW－GS组成的改良，特别是要提高优质高分子量谷蛋白亚基或亚基对的频率。目前常规育种方法与标记辅助选择技术相结合是小麦品质改良的主要手段，其中杂交早期世代优质蛋白亚基快速、微量、准确的鉴定是提高育种效率的关键。本发明的主要任务是解决针对小麦种子中贮藏的高分子量谷蛋白亚基的鉴定给出酸性毛细管电泳的缓冲液类型和添加成分、电泳条件参数和毛细管冲洗程序。
文档编号G01N30/38GK1570623SQ20041003725
公开日2005年1月26日 申请日期2004年4月30日 优先权日2004年4月30日
发明者晏月明, 余建中, 姜怡, 安学丽, 胡英考 申请人:首都师范大学