一种银耳胶原蛋白肽的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明公开了一种银耳胶原蛋白肽的提取方法，属于胶原蛋白肽制备技术领域。
【背景技术】
[0002]胶原蛋白是一种高分子蛋白质，丝状的胶原蛋白纤维，能使皮肤保持结实而有弹性。胶原蛋白具有很强的生物活性和生物功能，能参与细胞的迀移、分化和增殖，使骨骼、肌腱、软骨和皮肤具有一定的机械强度。胶原蛋白肽是胶原蛋白在一定的化学作用或酶的作用下发生“水解”反应后得到的分子量在1000dalton以下的产物。胶原蛋白肽具有独特的生理活性，它不仅有蛋白质的营养特性，消化吸收率可达100%，而且有保护胃粘膜、抗溃疡、抗氧化、抗过敏、抗肿瘤、抗衰老、降血压、降胆固醇、增强骨强度、预防骨质疏松、预防关节炎、促进伤口愈合、促进角膜上皮细胞的修复和生长、促进皮肤胶原代谢、免疫调节等多种生理功能。
[0003]近年来，胶原蛋白肽已广泛应用于生物、医疗、食品、化妆品等诸多领域。胶原蛋白肽的用范围也日趋广泛，其需求量正逐年增长。以往提取胶原蛋白肽的原料它们主要来源于畜禽动物组织，但由于宗教和习俗等原因，有些地区不能使用。再加上近年来，由于疯牛病和口蹄疫的影响，人们已经开始转向从鱼类中提取胶原蛋白肽，因为其所提取的胶原蛋白肽更为安全。
[0004]目前胶原蛋白肽的制备主要方法有:高温高压蒸煮法、酸法、酶法、酸法和酶法相全士么云口口 ο
[0005](I)高压蒸煮法能够快速提取胶原蛋白肽，然而该工艺的高压在生产中易引发安全问题，制备的样品分子量分布广，均匀度较差；
(2)酶法提取是目前用得较多的方法，根据胶原蛋白的结构特点选择合适当的酶提取；但该工艺制备的产品分子量较集中，产品附加值较高，但由于鱼鳞除了胶原蛋白外还含有大量的无机盐、脂肪等杂质，这些杂质影响酶的酶活，使得酶提取胶原蛋白肽的产率太低，难以满足产业化大规模生产；
(3)酸法提取虽降低成本，但单一的酸法提取得到的产品分子量分布广，均匀度差；
(4)酸法与酶法结合提取可以提高产率，制备产品的分子量较集中，但产率仍然很低，造成浪费。
[0006]上述的传统方法存在以下问题:
①工艺复杂:这些方法都需要经历除杂蛋白、去除脂肪，提取胶原蛋白再酶解胶原蛋白得到胶原蛋白肽这几个程序，工艺复杂；
②污染环境:为了去除皮上的杂蛋白和脂肪，需要加入化学试剂，带来了环境污染的问题；
③成本高:以上这些方法，程序多工艺复杂，生产成本高，再加上需要加入昂贵的蛋白酶，进一步增加了生产成本。
【发明内容】
[0007]本发明主要解决的技术问题:针对目前传统方法在提取胶原蛋白肽的过程中，原料主要源于畜禽动物组织，由于疯牛病和口蹄疫的影响，原料对于人体危害较大，且在制备过程中程序工艺复杂，需要加入化学试剂，带来了环境污染的问题，另外还需要加入昂贵的蛋白酶，增加了生产成本的现状，提供了一种以淀粉和磁性粉末制得固定化蛋白酶，将银耳作为原材料，经预处理后酶解，干燥，从而得到银耳胶原蛋白肽。该方法工艺简便，原料易得，在制备过程中避免了漂白剂、氧化剂等化学试剂，对环境无任何污染问题，利用固定化蛋白酶代替游离蛋白酶，使用后可以回收，降低了生产成本，使得最终制得的蛋白酶产率高达90 %以上、纯度高达95 %以上，适合大规模应用。
[0008]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
(1)称取30?40g可溶性淀粉溶于300?400mL去离子水中，装入带有搅拌器和温度计的IL三口烧瓶中，再加入I?2mL浓度为0.2mol/L氯化亚铁溶液和2?3mL质量浓度为30%双氧水，启动搅拌器以300?400r/min转速进行搅拌；
(2)在搅拌过程中滴加35?45mL浓度为lmol/L的烧碱溶液，控制滴加速度使其20?30min内滴加完毕，再将三口烧瓶移入油浴锅，加热升温至100?110°C，保持油浴温度不变，继续搅拌反应3?4h后放入温度为4?6°C冰水浴中，静置沉淀10?12h后过滤得到滤渣，干燥后得到磁性淀粉微球；
(3)称取5?1g木瓜蛋白酶和3?5g碱性蛋白酶加入400?500mL磷酸缓冲液中，放置在超声振荡仪中，以100?200W功率超声振荡25?35min后，加入20?30g上述制得的磁性淀粉微球，继续振荡8?10h，将反应液用卧式离心机以8000?9000r/min的转速离心10?15min，分离去除上清液，得到固定化蛋白酶，备用；
(4)称取400?500g干银耳放入40?50°C的温水中浸泡I?2h，待其充分溶胀后，用蒸馏水将其表面污物清洗干净，用剪刀将洗净后的银耳剪成I cm X I cm的小块，分别用I?2L浓度为0.2mol/L烧碱和I?2L无水乙醇浸泡I?2天，最后用去离子水冲洗5?7遍，得到预处理后的银耳；
(5)将300?400g上述预处理后的银耳装入高压反应釜中，按料液比为1:2向釜内加入去离子水，升高釜内温度至100?200°C并提高压力至0.2?0.3MPa，保温保压处理30?40min后出料；
(6)将上述物料移入酶解罐，加入物料总质量I?2%的备用的固定化蛋白酶，用保鲜膜密封罐口后放入恒温箱中，升温至40?50°C，保温酶解6?Sh后，在酶解罐周围施加匀强磁场，分离回收磁性固定化蛋白酶，再将酶解液用孔径为0.4?0.5μπι的纳滤膜进行过滤，得到大分子胶原蛋白肽滤液，经喷雾干燥后研磨过100目标准筛，即可得到银耳胶原蛋白肽粉末。
[0009]本发明的应用方法是:使用时，取2?5g本发明制得的银耳胶原蛋白肽粉末放入50?10mL化妆品乳液中，充分混合均匀，在每日早晚洁面后，取3?5mL混合液涂抹在脸上各个部位，轻轻拍打使得完全吸收为止，长期使用，不仅可修复皮肤断裂老化的弹力纤维网，使皮肤弹性挥发，柔韧充盈，而且还可消除体内自由基，多途径抗氧化，减缓皮肤衰老。
[0010]本发明的有益效果是: (1)本发明方法独特新颖，原料简单易得，在制备过程中避免了漂白剂、氧化剂等化学试剂，对环境无任何污染问题；
(2)本发明在制备的过程中利用固定化蛋白酶代替游离蛋白酶，降低了生产成本；
(3)本发明制得的银耳胶原蛋白肽粉末无色无味，分子量为1200?3200D，可广泛应用于保健食品、生物医药、化妆品等与人体健康相关的行业。
【具体实施方式】
[0011]首先称取30?40g可溶性淀粉溶于300?400mL去离子水中，装入带有搅拌器和温度计的IL三口烧瓶中，再加入I?2mL浓度为0.2mol/L氯化亚铁溶液和2?3mL质量浓度为30%双氧水，启动搅拌器以300?400r/min转速进行搅拌;然后在搅拌过程中滴加35?45mL浓度为lmol/L的烧碱溶液，控制滴加速度使其20?30min内滴加完毕，再将三口烧瓶移入油浴锅，加热升温至100?110°C，保持油浴温度不变，继续搅拌反应3?4h后放入温度为4?61冰水浴中，静置沉淀10?12h后过滤得到滤渣，干燥后得到磁性淀粉微球；随后称取5?1g木瓜蛋白酶和3?5g碱性蛋白酶加入400?500mL磷酸缓冲液中，放置在超声振荡仪中，以100?200W功率超声振荡25?35min后，加入20?30g上述制得的磁性淀粉微球，继续振荡8?10h，将反应液用卧式离心机以8000?9000r/min的转速离心10?15min，分离去除上清液，得到固定化蛋白酶，备用;接下来称取400?500g干银耳放入40?50°C的温水中浸泡I?2h，待其充分溶胀后，用蒸馏水将其表面污物清洗干净，用剪刀将洗净后的银耳剪成IcmXI cm的小块，分别用I?2L浓度为0.2mol/L烧碱和I?2L无水乙醇浸泡I?2天，最后用去离子水冲洗5?7遍，得到预处理后的银耳;之后将300?400g上述预处理后的银耳装入高压反应釜中，按料液比为1:2向釜内加入去离子水，升高釜内温度至100?200°C并提高压力至0.2?0.3MPa，保温保压处理30?40min后出料;最后将上述物料移入酶解罐，加入物料总质量I?2%的备用的固定化蛋白酶，用保鲜膜密封罐口后放入恒温箱中，升温至40?50°C，保温酶解6?8h后，在酶解罐周围施加匀强磁场，分离回收磁性固定化蛋白酶，再将酶解液用孔径为0.4?0.5μπι的纳滤膜进行过滤，得到大分子胶原蛋白肽滤液，经喷雾干燥后研磨过100目标准筛，即可得到银耳胶原蛋白肽粉末。
[0012]实例I
首先称取30g可溶性淀粉溶于300mL去离子水中，装入带有搅拌器和温度计的IL三口烧瓶中，再加入ImL浓度为0.2mol/L氯化亚铁溶液和2mL质量浓度为30%双氧水，启动搅拌器以300r/min转速进行搅拌;然后在搅拌过程中滴加35mL浓度为lmol/L的烧碱溶液，控制滴加速度使其20min内滴加完毕，再将三口烧瓶移入油浴锅，加热升温至100°C，保持油浴温度不变，继续搅拌反应3h后放入温度为4°C冰水浴中，静置沉淀1h后过滤得到滤渣，干燥后得到磁性淀粉微球;随后称取5g木瓜蛋