白酶和3g碱性蛋白酶加入400mL磷酸缓冲液中，放置在超声振荡仪中，以100W功率超声振荡25min后，加入20g上述制得的磁性淀粉微球，继续振荡8h，将反应液用卧式离心机以8000r/min的转速离心1min，分离去除上清液，得到固定化蛋白酶，备用；接下来称取400g干银耳放入40°C的温水中浸泡lh，待其充分溶胀后，用蒸馏水将其表面污物清洗干净，用剪刀将洗净后的银耳剪成IcmX Icm的小块，分别用IL浓度为0.2mol/L烧碱和IL无水乙醇浸泡I天，最后用去离子水冲洗5遍，得到预处理后的银耳;之后将300g上述预处理后的银耳装入高压反应釜中，按料液比为1: 2向釜内加入去离子水，升高釜内温度至100°〇并提高压力至0.2 MPa，保温保压处理30min后出料;最后将上述物料移入酶解罐，加入物料总质量1%的备用的固定化蛋白酶，用保鲜膜密封罐口后放入恒温箱中，升温至40°C，保温酶解6h后，在酶解罐周围施加匀强磁场，分离回收磁性固定化蛋白酶，再将酶解液用孔径为0.4μπι的纳滤膜进行过滤，得到大分子胶原蛋白肽滤液，经喷雾干燥后研磨过100目标准筛，即可得到银耳胶原蛋白肽粉末。
[0013]本实例操作简单易行，使用时，取2g本发明制得的银耳胶原蛋白肽粉末放入50mL化妆品乳液中，充分混合均匀，在每日早晚洁面后，取3mL混合液涂抹在脸上各个部位，轻轻拍打使得完全吸收为止，长期使用，不仅可修复皮肤断裂老化的弹力纤维网，使皮肤弹性挥发，柔韧充盈，而且还可消除体内自由基，多途径抗氧化，减缓皮肤衰老。
[0014]实例2
首先称取35g可溶性淀粉溶于350mL去离子水中，装入带有搅拌器和温度计的IL三口烧瓶中，再加入1.5mL浓度为0.2moI/L氯化亚铁溶液和2.5mL质量浓度为30%双氧水，启动搅拌器以350r/min转速进行搅拌;然后在搅拌过程中滴加35?45mL浓度为lmol/L的烧碱溶液，控制滴加速度使其25min内滴加完毕，再将三口烧瓶移入油浴锅，加热升温至105°C，保持油浴温度不变，继续搅拌反应3.5h后放入温度为5°C冰水浴中，静置沉淀I Ih后过滤得到滤渣，干燥后得到磁性淀粉微球;随后称取Sg木瓜蛋白酶和4g碱性蛋白酶加入450mL磷酸缓冲液中，放置在超声振荡仪中，以150W功率超声振荡30min后，加入25g上述制得的磁性淀粉微球，继续振荡9h，将反应液用卧式离心机以8500r/min的转速离心13min，分离去除上清液，得到固定化蛋白酶，备用;接下来称取450g干银耳放入45°C的温水中浸泡1.5h，待其充分溶胀后，用蒸馏水将其表面污物清洗干净，用剪刀将洗净后的银耳剪成IcmX Icm的小块，分别用1.5L浓度为0.2mol/L烧碱和1.5L无水乙醇浸泡1.5天，最后用去离子水冲洗6遍，得到预处理后的银耳;之后将350g上述预处理后的银耳装入高压反应釜中，按料液比为1:2向釜内加入去离子水，升高釜内温度至150°C并提高压力至0.25MPa，保温保压处理35min后出料；最后将上述物料移入酶解罐，加入物料总质量1.5%的备用的固定化蛋白酶，用保鲜膜密封罐口后放入恒温箱中，升温至45°C，保温酶解7h后，在酶解罐周围施加匀强磁场，分离回收磁性固定化蛋白酶，再将酶解液用孔径为0.45μπι的纳滤膜进行过滤，得到大分子胶原蛋白肽滤液，经喷雾干燥后研磨过100目标准筛，即可得到银耳胶原蛋白肽粉末。
[0015]本实例操作简单易行，使用时，取4g本发明制得的银耳胶原蛋白肽粉末放入SOmL化妆品乳液中，充分混合均匀，在每日早晚洁面后，取4mL混合液涂抹在脸上各个部位，轻轻拍打使得完全吸收为止，长期使用，不仅可修复皮肤断裂老化的弹力纤维网，使皮肤弹性挥发，柔韧充盈，而且还可消除体内自由基，多途径抗氧化，减缓皮肤衰老。
[0016]实例3
首先称取40g可溶性淀粉溶于400mL去离子水中，装入带有搅拌器和温度计的IL三口烧瓶中，再加入2mL浓度为0.2mol/L氯化亚铁溶液和3mL质量浓度为30%双氧水，启动搅拌器以400r/min转速进行搅拌;然后在搅拌过程中滴加45mL浓度为lmol/L的烧碱溶液，控制滴加速度使其30min内滴加完毕，再将三口烧瓶移入油浴锅，加热升温至110°C，保持油浴温度不变，继续搅拌反应4h后放入温度为6°C冰水浴中，静置沉淀12h后过滤得到滤渣，干燥后得到磁性淀粉微球;随后称取1g木瓜蛋白酶和5g碱性蛋白酶加入500mL磷酸缓冲液中，放置在超声振荡仪中，以200W功率超声振荡35min后，加入30g上述制得的磁性淀粉微球，继续振荡1011，将反应液用卧式离心机以90001'/1]1；[11的转速离心151]1；[11，分离去除上清液，得到固定化蛋白酶，备用；接下来称取500g干银耳放入50°C的温水中浸泡2h，待其充分溶胀后，用蒸馏水将其表面污物清洗干净，用剪刀将洗净后的银耳剪成IcmX Icm的小块，分别用2L浓度为0.2mol/L烧碱和2L无水乙醇浸泡2天，最后用去离子水冲洗7遍，得到预处理后的银耳;之后将400g上述预处理后的银耳装入高压反应釜中，按料液比为1: 2向釜内加入去离子水，升高釜内温度至200°C并提高压力至0.3MPa，保温保压处理40min后出料;最后将上述物料移入酶解罐，加入物料总质量2%的备用的固定化蛋白酶，用保鲜膜密封罐口后放入恒温箱中，升温至50°C，保温酶解Sh后，在酶解罐周围施加匀强磁场，分离回收磁性固定化蛋白酶，再将酶解液用孔径为0.5μπι的纳滤膜进行过滤，得到大分子胶原蛋白肽滤液，经喷雾干燥后研磨过100目标准筛，即可得到银耳胶原蛋白肽粉末。
[0017]本实例操作简单易行，使用时，取5g本发明制得的银耳胶原蛋白肽粉末放入10mL化妆品乳液中，充分混合均匀，在每日早晚洁面后，取5mL混合液涂抹在脸上各个部位，轻轻拍打使得完全吸收为止，长期使用，不仅可修复皮肤断裂老化的弹力纤维网，使皮肤弹性挥发，柔韧充盈，而且还可消除体内自由基，多途径抗氧化，减缓皮肤衰老。
【主权项】
1.一种银耳胶原蛋白肽的提取方法，其特征在于具体提取步骤为: (1)称取30?40g可溶性淀粉溶于300?400mL去离子水中，装入带有搅拌器和温度计的IL三口烧瓶中，再加入I?2mL浓度为0.2mol/L氯化亚铁溶液和2?3mL质量浓度为30%双氧水，启动搅拌器以300?400r/min转速进行搅拌； (2)在搅拌过程中滴加35?45mL浓度为lmol/L的烧碱溶液，控制滴加速度使其20?30min内滴加完毕，再将三口烧瓶移入油浴锅，加热升温至100?110°C，保持油浴温度不变，继续搅拌反应3?4h后放入温度为4?6°C冰水浴中，静置沉淀10?12h后过滤得到滤渣，干燥后得到磁性淀粉微球； (3)称取5?1g木瓜蛋白酶和3?5g碱性蛋白酶加入400?500mLpH7.0的磷酸缓冲液中，放置在超声振荡仪中，以100?200W功率超声振荡25?35min后，加入20?30g上述制得的磁性淀粉微球，继续振荡8?1h，将反应液用卧式离心机以8000?9000r/min的转速离心1?15min，分离去除上清液，得到固定化蛋白酶，备用； (4)称取400?500g干银耳放入40?50°C的温水中浸泡I?2h，待其充分溶胀后，用蒸馏水将其表面污物清洗干净，用剪刀将洗净后的银耳剪成I cm X I cm的小块，分别用I?2L浓度为0.2mol/L烧碱和I?2L无水乙醇浸泡I?2天，最后用去离子水冲洗5?7遍，得到预处理后的银耳； (5)将300?400g上述预处理后的银耳装入高压反应釜中，按料液比为1:2向釜内加入去离子水，升高釜内温度至100?200°C并提高压力至0.2?0.3MPa，保温保压处理30?40min后出料； (6)将上述物料移入酶解罐，加入物料总质量I?2%的备用的固定化蛋白酶，用保鲜膜密封罐口后放入恒温箱中，升温至40?50°C，保温酶解6?Sh后，在酶解罐周围施加匀强磁场，分离回收磁性固定化蛋白酶，再将酶解液用孔径为0.4?0.5μπι的纳滤膜进行过滤，得到大分子胶原蛋白肽滤液，经喷雾干燥后研磨过100目标准筛，即可得到银耳胶原蛋白肽粉末。
【专利摘要】本发明公开了一种银耳胶原蛋白肽的提取方法，属于胶原蛋白肽制备技术领域。本发明以淀粉和磁性粉末制得固定化蛋白酶，将银耳作为原材料，经预处理后酶解，干燥，从而得到银耳胶原蛋白肽的提取方法。本发明工艺简便，原料易得，在制备过程中避免了漂白剂、氧化剂等化学试剂，对环境无任何污染问题，利用固定化蛋白酶代替游离蛋白酶，降低了生产成本，使得最终制得的蛋白酶产率高达90％以上、纯度高达95％以上，适合大规模应用。
【IPC分类】C12P21/06, C07K14/78, C07K1/34, C12N11/14, C12N11/10
【公开号】CN105524964
【申请号】CN201610088324
【发明人】陈蓉蓉, 张帆, 林大伟
【申请人】常州市庆发工业气体有限公司
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2016年2月17日