专利名称：用于蛋白结合的改良的化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的结合化合物，特别是蛋白结合化合物。这种新的化合物对于将蛋白结合至包括膜在内的表面来说是特别有用的。在本发明的优选的形式中，提供引入这些蛋白结合化合物的生物传感器。本发明还涉及在本发明的结合化合物的合成中使用的中间体化合物。
1975年报道了在分离和纯化蛋白质的过程中使用金属-IDA配合物，此过程被称为固定化金属亲和色谱(IMAC)(5)。在该过程中将IDA的衍生物连接于固体载体如琼脂糖凝胶，然后将琼脂糖凝胶填充入柱子中。将金属离子加入到IDA部分(通过使金属离子的稀溶液通过柱子)，然后加入蛋白质混合物。除了与金属-IDA物种相互作用的蛋白质以外，洗脱蛋白质混合物将所有蛋白质除去。然后通过加入咪唑溶液、通过加入强金属螯合剂如EDTA或EGTA，或者通过降低pH至4.5-5.3(6)而将这种或者这些蛋白质从柱子中洗脱下来。
1987年Hochuli及其合作者采用Ni-NTA配合物来纯化蛋白质(7)，特别是重组设计的6位组氨酸标记的蛋白质(8)。组氨酸标记的蛋白质与带有NTA的固体载体之间的亲和力约为1013M-1(9)。
1996年报道了采用NTA衍生物将组氨酸标记的蛋白质连接到聚苯乙烯微孔板的孔上的方法(10)。
1997年，多个结合在石英载玻片表面的NTA的使用被描述为将蛋白质连接到表面的方法(11)。1998年报道了通过这种技术将组氨酸标记的5-羟色氨受体连接到石英片以通过全内反射荧光来研究(12)。
1995年，采用二齿、三齿和四齿金属螯合基团衍生化表面被描述为检测分析物的方法(13)。1996年报道了将组氨酸标记的蛋白质连接到带有金的侧基NTA部分上的混合自组装单分子层(SAM)的表面上以通过表面等离子体激光共振来进行研究(14)。
1997年报道了通过采用SPR作为测量方法的商品化的传感装置将组氨酸标记的蛋白质结合到具有NTA-镍部分的表面上(15)。
1997年报道了采用通过使用具有NTA部分的SAM将Fab片段结合到金涂层的表面上以通过FTIR进行研究(16)。还报道了通过使用具有NTA部分的SAM来检测金属离子(17)。
报道了通过使用具有IDA-Cu2+部分的单分子层将抗生物素蛋白链菌素结合至单分子层以通过X-射线晶体学(18)和电子显微镜法(19)进行研究。
1994年报道了通过使用具有NTA基团的脂质来制备金属敏感的脂质膜(20)。
1996年报道了使用含有在双分子层的表面具有芘部分和IDA-Cu2+部分的脂质的双分子层通过激基缔合物荧光检测富含组氨酸的蛋白质(21)。
在上述报道中所采用的物质具有许多缺点。第一，三元配合物的稳定性，即金属螯合物金属与蛋白质之间的相互作用对于使蛋白质被固定化足够长的时间以观察和研究来说太弱。第二，所采用的金属螯合物与其它未标记的蛋白质以非特异性的方式相互作用。另外，在某些分析系统中，在某种未知浓度的干扰物存在下三元配合物可能被破坏。
因此本发明是具有通式I的化合物Y-(Z)n分子式I其中，Y是分支部分，Z代表与金属离子配位的多齿配体螯合剂；且n是至少为2的整数，优选是2-9。
Z可以是多齿配体，其与如Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+的金属离子配位。给体原子Z可以是σ-给体原子或者π-给体原子。给体原子可以选自氮、氧、硫、磷和硅。给体原子优选是氮。Z可以是二齿、三齿(如IDA)或者四齿(如NTA)。Z优选是除环状的或者多环的之外的。Z优选是四齿配体如NTA。
Y优选提供至少三个用以直接地或者通过任选的连接基团间接地与Z共价连接的部分。分支基团Y的主链可以是化合物的残基、低聚物或聚合物。连接基团最优选具有直链主链。
另一方面，本发明提供如分子式II的化合物X-Y-(Z)n分子式II其中Y、Z和n如上所述，且X是间隔部分。
X可以是亲水的、疏水的或者既具有亲水区又具有疏水区。X可以是或者包含取代或未取代的烷基，任选地是被一个或多个杂原子(如氧、氮、硫或者它们的两个或多个的组合)分隔，例如低聚乙二醇或其它低聚烷基乙二醇、氨基酸序列、多肽或聚酰胺或低聚酰胺(如氨基己酰基低聚物)。X可以是或者包含脂质。该脂质可以是跨膜脂质(MSL)。优选的X包含亲水区，例如聚亚烷基低聚物，及疏水区，例如脂质，其中X通过疏水区，任选地通过间隔基团与Y相连。
又一方面，本发明提供如分子式III的化合物W-X-Y-(Z)n分子式III其中，X、Y、Z和n如上所述，且W是用以与其它分子连接，或者与表面连接，或者镶嵌入膜中的基团。
在优选的实施方案中，W是用以与其它分子包括聚合物如琼脂糖凝胶连接的基团(如胺官能团、羧酸官能团、醇官能团、卤素官能团)或者与表面连接的基团(如用以与金或者其它的造币金属表面连接的硫醇或者二硫化物，或者如用以与氧化物表面连接的硅烷衍生物)，或者镶嵌入膜中的基团(如脂质基团，或者可溶于膜的蛋白质，如短杆菌肽)。W也可以是能够产生非共价连接的基团，如生物素与抗生物素蛋白链菌素之间的非共价连接。
优选的Y是分支部分，其提供多个用以与Z共价结合的部分以及提供一个用以与X共价结合的部分。对Y的非限制性的说明性实例包括氨基多元醇，如TRIS，bis-homotris氨基酸，如3，5-二氨基苯甲酸、5-氨基间苯二甲酸、
含有多个游离酸和/或胺部分的肽，例如 在另一实施方案中，Y是分支部分，其含有多个用以与Z和X共价连接的部分。Y的非限制性的说明性实例包括多元胺，如亚精胺、精胺、五亚乙基六胺；多元酸如酒石酸、1，3，5-苯三酸、柠檬酸，Kemp′s三酸多羟基化的物质如糖dendron，如商品化的“Starburst”化合物， 含有多个环氧部分的化合物，或者含有易被亲核试剂(如卤素、甲苯磺酸盐或酯)取代的基团，或者亲核试剂易于加成的基团(如α，β-不饱和酮)的化合物，或者它们的组合。
本发明的化合物可以具有广泛的用途。特别是它们对于将蛋白质和其它的生物大分子结合到表面是有用的。要理解这是许多传感装置和分析的要求。
据信本发明的化合物将特别地应用于生物传感器。生物传感器在本领域中是公知的，并且在PCT/AU93/00620、PCT/AU96/00482、PCT/AU95/00763、 PCT/AU96/00368、 PCT/AU97/00071、PCT/AU98/00423、 PCT/AU98/00424、 PCT/AU97/00294、PCT/AU93/00509、 PCT/AU96/00304、 PCT/AU89/00352、PCT/AU97/00014、 PCT/AU92/00132、 PCT/AU97/00316、PCT/AU90/00025、 PCT/AU98/00417、 PCT/AU96/00369以及PCT/AU94/00202中有描述，这些文献引入本文作参考。
这些生物传感器具有包括离子载体和受体的膜。分析物与受体结合导致膜的电导或者阻抗的可检测的变化。这些生物传感器提供对特别的分析物的灵敏的检测。
通常，定向于所感兴趣的分析物的受体连接于离子载体和膜。通常受体是蛋白质如抗体或其抗原结合片段如Fab。据信本发明的结合化合物在将这种受体连接于生物传感器的离子载体和膜中将会有用。
因此在优选的实施方案中，本发明在于在本说明书中，“包含”这个词将被理解为意为包括一定的元素、整数或步骤，或者元素组、整数组或步骤组，而不是将任何其它的元素、整数或步骤，或者元素组、整数组和步骤组排除在外。
图26组氨酸CD40结合于J1.三NTA碎片。显示100、200、400、600和800纳摩尔/升的结合曲线(从下至上)。结合曲线是Fc1减去Fc2(对照，-Ni2+)的响应。
发明详述为了更清楚地理解本发明的性质，以下将参考实施例对本发明的优选形式进行描述。概述将6组氨酸CD40结合于三NTA有着比将其结合于NTA高12倍的亲和力。这主要是结合速率(Ka)高10倍的结果。但是，由于与金碎片上的三NTA相比(比较绝对结合程度)，NTA分子在BLAcore NTA碎片上的密度更高，因此NTA结合的脱离速率(offrate，Kd)可能被夸大。
本领域技术人员将会理解，在不背离如广泛描述的本发明的实质和范围的前提下，可以对本发明做多种改变和/或修改，如在具体的实施方案中所示。因此这些实施方案是说明性的的而非限制性的。1.一般过程N6-苄氧羰基-L-赖氨酸、2-三甲基甲硅烷基乙醇、盐酸1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、二环已基碳二亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰胺(NHS)及6-氨基己酸(X)购自Sigma-Aldrich化学公司。XXBoc是通过Xboc NHS酯(它自身是通过在标准条件下用BocON保护X的氨基，然后用DCC与NHS偶联而获得的)与X反应而获得。临用前将二氯甲烷用P2O5蒸馏。2.Z-赖氨酸NTA的合成 C18H24N2O8396.39396.153266C54.5％ H6.1％ N7.1％ O32.3％照Schmitt等1的过程合成Z-赖氨酸NTA。
将溴乙酸(4.17克，30.0毫摩尔)溶解在氢氧化钠水溶液(1.5摩尔/升，15毫升)中并冷却至0℃。在2小时内向反应混合物中逐滴加入Nε-Z-(L)-赖氨酸(2.0克，7.0毫摩尔)的氢氧化钠水溶液(1.5摩尔/升，25毫升)。将溶液暖至室温并在室温下搅拌过夜。将反应混合物在50℃加热2小时，然后冷至室温。将盐酸水溶液(1摩尔/升，40毫升)逐滴加入反应混合物中，然后将得到的白色沉淀过滤，并用盐酸(0.1摩尔/升，20毫升)和蒸馏水(2×20毫升)洗涤。得到的白色固体在高真空下干燥数天，得到Z-赖氨酸NTA的白色固体(2.68克，收率95％)。数据1H NMR(200MHz，d6-DMSO)δ7.42(5H，m，-C6H5)，5.09(2H，s，-CH2Ph)，3.56(4H，AB四重峰，2×-NCH2CO2H)，3.41(1H，重叠dd，-NCHCO2H)，3.06(2H，m，-NHCH2-)，1.75-1.25(6H，重叠多重峰，-NHCH2CH2CH2CH2-)ppm。13C NMR(50MHz，d4-MeOD)δ175.9(2×-C(O)O-)，175.8(-C(O)O-)，158.9(-C(O)NH)，138.4(-C6H5)，129.4(-C6H5)，128.9(-C6H5)，128.7(-C6H5)，67.3(-CH2Ph)，66.7(-NCHC(O)-)，55.3(2×-NCH2C(O)-)，41.5(-NHCH2)，30.7(-NHCH2CH2-)，30.5(-NHCH2CH2CH2CH2-)，24.6(-NHCH2CH2CH2-)ppm。电喷雾M/Sm/z 397(100％)(M+H+)，398(21％)，353(30％)，792(15％)。3.Z-赖氨酸NTA.TMSE3的合成照Gao等2的过程合成Z-赖氨酸NTA.TMSE3。 C33H60N2O8Si3697.10696.365752C56.9％ H8.7％ N4.0％ O18.4％ Si12.1％
在0℃将EDC(1.25克，12.5毫摩尔)加入Z-赖氨酸NTA(0.50克，1.25毫摩尔)、2-三甲基甲硅烷基乙醇(1.50克，12.5毫摩尔)及4-二甲基氨基吡啶(0.50克，4.15毫摩尔)在新蒸、干燥二氯甲烷(60毫升)中的溶液。反应在0℃下搅拌1小时，然后暖至室温并在室温下搅拌过夜。将蒸馏水(50毫升)加入反应混合物中，分离有机层。用二氯甲烷(2×50毫升)萃取水层，合并有机萃取液，以无水碳酸钠干燥。过滤混合物，减压除去所有挥发性物质，得到无色油状物。采用从二氯甲烷至含5％甲醇的二氯甲烷溶剂梯度在闪蒸二氧化硅上以柱色谱纯化，得到无色油状的Z-赖氨酸NTA.TMSE3(0.75克，86％)。数据Rf＝0.78(含5％甲醇的二氯甲烷)1H NMR(200MHz，CDCl3)δ7.34(5H，m，-C6H5)，5.08(2H，s，-CH2Ph)，4.91(1H，br t，-NH)，4.16(6H，m，3×-OCH2-)，3.60(4H，s，2×-NCH2C(O)-)，3.39(1H，t，-NCHC(O)-，3JH-H＝7.5Hz)，3.19(2H，m，-NHCH2-)，1.3-1.8(6H，重叠多重峰，-NHCH2CH2CH2CH2-)，0.93-1.04(6H，重叠多重峰，3×-CH2Si-)，0.04(9H，s，1×-Si(CH3)3)，0.03(18H，s，2×-Si(CH3)3)ppm。13CNMR(100MHz，CDCl3)δ173.6(-C(O)O-)，172.2(2×-C(O)O-)，157.1(-OC(O)NH)，137.5(-C6H5)，129.2(-C6H5)，128.7(-C6H5)，67.2(-CH2Ph)，65.4(-NCHC(O)-)，63.5(1×-OCH2-)，63.3(2×-OCH2-)，53.6(2×-NCH2C(O)-)，41.6(-NHCH2-)，30.8(-NHCH2CH2-)，30.1(-NHCH2CH2CH2CH2-)，23.8(-NHCH2CH2CH2-)，18.3(-CH2Si-)，18.1(2×-CH2Si-)，-0.8(3×-Si(CH3)3)ppm。电喷雾M/Sm/z 719.4(100％)(M+Na+)4.赖氨酸NTA.TMSE3的合成 C25H54N2O6Si3562.97562.328973C53.3％ H9.7％ N5.0％ O17.1％ Si15.0％将Z-赖氨酸NTA.TMSE3(0.167克，0.24毫摩尔)溶解在甲醇(5毫升)中，加入刮勺尖端量(spatule-tip)的10％Pd/C，给反应容器装上含有氢气的气囊。在室温下搅拌反应混合物75分钟，然后过滤，减压除去所有的挥发物。1H NMR分析显示发生完全氢化，得到无色油状的赖氨酸NTA.TMSE3(0.127克定量收率)。数据1H NMR(200MHz，CDCl3)δ4.16(6H，m，3×-OCH2-)，3.61(4H，s，2×-NCH2C(O)-)，3.40(1H，表观三重峰，-NCHC(O)-，3JH-H＝7.5Hz)，2.69(2H，brt，NH2CH2-，3JH-H＝6.1Hz)，1.3-1.8(6H，重叠多重峰，NH2CH2CH2CH2CH2-)，0.93-1.04(6H，重叠多重峰，3×-CH2Si-)，0.04(9H，s，1×-Si(CH3)3)，0.03(18H，s，2×-Si(CH3)3)ppm。13C NMR(100MHz，CDCl3)δ173.7(-C(O)O-)，172.2(2×-C(O)O-)，65.6(-NCHC(O)-)，63.5(2×-OCH2-)，63.3(1×-OCH2-)，53.6(2×-NCH2C(O)-)，42.7(NH2CH2-)，33.9(NH2CH2CH2-)，31.0(NH2CH2CH2CH2CH2-)，23.9(NH2CH2CH2CH2-)，18.3(-CH2Si-)，18.1(2×-CH2Si-)，-0.8(3×-Si(CH3)3)ppm。电喷雾M/Sm/z 563.3(100％)(M+H+)5.Z-三NTA.TMSE9的合成 C93H180N8O23Si92031.262029.108491C55.0％ H8.9％ N5.5％ O18.1％ Si12.4％将Z-赖氨酸NTA(60毫克，0.15毫摩尔)、4-二甲基氨基吡啶(60毫克，0.51毫摩尔)和赖氨酸NTA.TMSE3(0.37克，0.66毫摩尔)溶解在二氯甲烷(50毫升)中，将反应混合物冷至0℃。加入EDC(0.15克，0.75毫摩尔)，在0℃搅拌反应物1小时，然后暖至室温，在室温下搅拌过夜。向反应混合物中加入蒸馏水(40毫升)，分离有机层。水层以二氯甲烷(2×40毫升)萃取，合并有机萃取液，并且用无水碳酸钠干燥。过滤混合物，减压除去所有挥发物，得到无色的油状物。采用从100％的二氯甲烷至含5％甲醇的二氯甲烷的溶剂梯度在闪蒸二氧化硅上以柱色谱纯化，得到无色油状的Z-三NTA.TMSE9(0.235克，76％)。数据Rf＝0.24(含5％甲醇的二氯甲烷)1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.37(2H，br t，NH)，7.34(5H，m，-C6H5)，7.26(1H，br t，NH)，5.15(1H，br t，NH)，5.08(2H，s，-CH2Ph)，4.17(18H，m，9×-OCH2-)，3.60(12H，二个比率为2∶1的重叠单峰，6×-NCH2C(O)O-)，3.39-3.34(5H，重叠多重峰)，3.26-3.16(10H，重叠多重峰)，3.07(1H，三重峰)，1.85-1.30(24H，重叠多重峰，12×-CH2)，0.97(18H，重叠多重峰，9×-CH2Si-)，0.05(27H，s，3×-Si(CH3)3)，0.04(54H，s，6×-Si(CH3)3)ppm。-OC(O)NHCH2-13C NMR(100MHz，CDCl3)δ173.5(2×-C(O)O-)，173.5(-C(O)O-)，172.9(3×-C(O)NH-)，172.2(4×-C(O)O-)，172.1(2×-C(O)O-)，157.2(-OC(O)NH)，137.4(-C6H5)，129.1(-C6H5)，128.6(-C6H5)，67.1(-CH2Ph)，66.4(-NCHC(O)NH-)，65.5(-NCHC(O)O-)，65.4(2×-NCHC(O)O-)，63.4(6×-OCH2CH2-)，63.3(3×-OCH2CH2-)，56.9(2×-NCH2C(O)NH-)，53.7(4×-NCH2C(O)O-)，53.4(2×-NCH2C(O)O-)，41.2(-OC(O)NHCH2-)，39.9(3×-C(O)NCH2-)，30.7，30.5，30.2(4×-NHCH2CH2-)，29.9，29.5，28.9(4×NHCH2CH2CH2CH2-)，24.7，24.0，23.8(4×-NHCH2CH2CH2-)，18.3(3×-CH2Si(CH3)3-)，18.0(6×-CH2Si(CH3)3-)，-0.8(9×-Si(CH3)3)ppm。电喷雾M/Sm/z 2054.3(100％)(M+Na+)，1038.8(20％)，613.3(36％)6.Z-三NTA的合成 C48H72N8O23准确质量1128.47分子量1129.13C51.06； H6.43； N9.92； O32.59将Z-三NTA.TMSE9(0.12克，0.06毫摩尔)冷至0℃，加入三氟乙酸(3毫升)。在0℃下搅拌反应混合物3小时，然后减压除去所有挥发物。以反相HPLC，在40分钟内采用从100％水/0.05％TFA至含50％乙腈/0.05％TFA的水/0.05％TFA的溶剂梯度纯化反应混合物。收集保留时间为21分钟的HPLC色谱的主峰，得到纯的Z-三NTA的白色固体(20毫克，30％收率)。数据1H NMR(400MHz，D2O)δ7.38(5H，m，-C6H5)，5.08(2H，s，-CH2Ph)，4.06-3.78(20H，m，8×-NCH2C(O)-+4×-NCHC(O)-)，3.23(6H，表观三重峰，3×-C(O)NHCH2-)，3.08(2H，表观三重峰，1×-OC(O)NHCH2-)，2.00-1.76(8H，重叠多重峰，4×-CH2)，1.60-1.40(14H，重叠多重峰，7×-CH2)，1.38-1.22(2H，多重峰，1×-CH2)ppm。13C NMR(100MHz，D2O)172.3，171.2，170.8，168.6，159.0，137.5，129.5，129.0，128.3，118.0，115.5，67.8，67.5，56.0，55.5，41.0，39.6，39.0，28.5，27.4，23.7，23.0ppm。电喷雾M/Sm/z 1151.4(100％)(M+Na+)，1129.2(88％)(M+H+)，1130.3(56％)(M+2H+)，1152.4(53％)(M+Na++H+)，1165.3(53％)，1143.3(52％)，755.5(50％)，907.2(41％)，393.2(26％)。7.三NTA TMSE9的合成 C85H174N8O21Si9准确质量1895.07分子量1897.10C53.81； H9.24； N5.91； O17.71； Si13.32将Z-三NTA TMSE9(38毫克，0.0187毫摩尔)溶解在甲醇(10毫升)中，加入催化量的披钯木炭(10％)。在真空下以氢气冲洗混合物，并且在氢气氛中搅拌2小时。过滤反应混合物，蒸发滤液，得到三NTA TMSE9的澄清的油(34毫克，96％)。数据1H n.m.r.(CDCl3)δ0.00(81H，m，Si(CH3)3)，0.96(18H，m，CH2Si)，1.2-2.0(24H，m)，3.1-3.7(28H，m)，4.15(18H，m，OCH2)及7.4(2H，NH2)。8.三NTA TMSE9半琥珀酰胺的合成 C89H178N8O24Si9准确质量1995.09分子量1997.17C53.52； H8.98； N5.61； O19.23； Si12.66在0℃下搅拌三NTA TMSE9(0.5克)、半琥珀酸苄酯(71毫克)、DMAP(64毫克)的二氯甲烷溶液。将EDC(101毫克)加入反应混合物中，在室温下继续搅拌16小时。减压除去溶剂，采用二氯甲烷-甲醇(96∶4)进行色谱分离剩余物，分离出537毫克的苄酯的中间体。将500毫克该物质溶解在甲醇(60毫升)中，以10％Pd/C(60毫克)为催化剂在常温下氢化4小时。得到474毫克纯的产物。数据1H n.m.r.(CDCl3)δ0.04(81H，m，Si(CH3)3)，0.96(18H，m，CH2Si)，1.2-2.0(24H，m)，2.5(2H，m)，2.65(2H，m)，3.2-3.45(16H，m)，3.59(s，12)，4.16(18H，m，OCH2)。电喷雾M/Sm/z 2019.8(35％)，(M+Na+)，1997.8(100％)(M+)。9.三NTA的合成 用甲苯研制三NTA TMSE9(34毫克，0.0179毫摩尔)，在高真空条件下蒸发和干燥。加入三氟乙酸(1毫升)，在0-5℃下在氮气氛中搅拌2小时，然后在室温下搅拌过夜。蒸发除去三氟乙酸，再次以甲苯研制剩余物，蒸发和干燥后得到三NTA(20毫克，100％)。数据1H n.m.r.(CD3OD)δ1.2-2.0(24H，m)，3.07(6H，m，CH2NHCO)和3.1-3.7(22H，m)。10.短杆菌肽琥珀酸酯的制备将短杆菌肽(75毫克，0.0398毫摩尔)溶解在吡啶(0.5毫升)中，加入琥珀酸酐(20毫克，0.200毫摩尔)。混合物在50℃下在氮气氛中搅拌20小时，然后蒸发。将粗产物的甲醇溶液通过sephadexLH-20柱，蒸发洗脱液，并且以闪蒸二氧化硅柱用二氯甲烷/甲醇/水/乙酸(400∶50∶4∶1)纯化。产物用水离心进行进一步的纯化。滗去水后，在高真空下干燥产物，得到短杆菌肽琥珀酸酯(53毫克，67％)。数据1H n.m.r.(CD3OD)δ0.4-1.8(66H，m)，2.0-2.2(4H，m)，2.56(4H，s，CH2CO)，2.9-3.4(10H，m)，3.90(2H，dd，CH2-gly)，4.0-4.8(16H，m)，6.8-7.6(20H，m)和8.18(1H，s，CHO)。11.短杆菌肽琥珀酸NHS酯的制备将短杆菌肽琥珀酸酯(21毫克，0.0105毫摩尔)、N-羟基琥珀酰胺(12毫克，0.1042毫摩尔)和4-二甲氨基吡啶(2.5毫克，0.0204毫摩尔)与蒸馏的四氢呋喃(10毫升)合并。在氮气中搅拌下加入二环己基碳二亚胺(22毫克，0.1066毫摩尔)。混合物加热回流1小时。蒸发混合物，使混合物在甲醇中通过Sephadex LH-20柱。将适当的部分蒸发并且干燥，得到短杆菌肽琥珀酸NHS酯(22毫克，100％)。数据1H n.m.r.(CD3OD)δ0.4-1.8(66H，m)，2.0-2.2(4H，m)，2.56(4H，s，CH2CO)，2.82(4H，s，NHS)2.9-3.4(10H，m)，3.90(2H，dd，CH2-gly)，4.0-4.8(16H，m)，6.8-7.6(20H，m)和8.18(1H，s，CHO)。12.短杆菌肽琥珀酸酯三NTA的制备 将赖氨酸三NTA(20毫克，0.0201毫摩尔)溶解在甲醇(1毫升)中，加入三乙胺(2滴)中和。然后加入短杆菌肽琥珀酸酯NHS(15毫克，0.0072毫摩尔)的甲醇(2毫升)溶液。反应混合物在50℃加热24小时，然后在甲醇中用Sephadex LH-20柱纯化。得到短杆菌肽琥珀酸酯赖氨酸三NTA(14毫克，65％)。数据1H n.m.r.(CD3OD)δ0.4-1.8(90H，m)，2.0-2.2(4H，m)，2.52(4H，m，CH2CO)，3.0-3.8(38H，m)，3.90(2H，dd，CH2-gly)，4.0-4.8(16H，m)，6.8-7.6(20H，m)和8.18(1H，s，CHO)。MALDI m.s.2963.4((M+Na+)-H2O)，2982.9(M+Na+)，2998(M+K+)。13.gA赖氨酸-XXBOC的制备 gA赖氨酸XXBOC
将短杆菌肽赖氨酸(15毫克，0.0076毫摩尔)溶解在甲醇(2毫升)中，并加入一当量三乙胺，将其与XXBOC的N-羟基琥珀酰胺酯(10毫克，0.0226毫摩尔)(通过在干燥的二氯甲烷中将XXBOC与1当量DCC和NHS及1当量DMAP反应而制备)反应。反应混合物在室温下搅拌18小时。蒸发反应混合物，并在甲醇中通过Sephadex LH-20柱。将含有合适部分的洗脱液蒸发，并在闪蒸二氧化硅柱上用二氯甲烷/甲醇/水/乙酸(400∶40∶4∶1)纯化，得到gA赖氨酸2XBOC(12毫克，68％)。数据1H n.m.r.(CD3OD)δ0.4-1.8(84H，m)，1.41(9H，s，BOC)，2.0-2.2(4H，m)，2.9-3.4(14H，m)，3.90(2H，dd，CH2-gly)，4.0-4.8(15H，m)，6.8-7.6(20H，m)和8.18(1H，s，CHO)。14.gA赖氨酸XXBOC半琥珀酸酯的制备 将短杆菌肽赖氨酸2XBOC(12毫克，0.0052毫摩尔)用甲苯研制，在真空下蒸发并干燥。加入三氟乙酸(1毫升)，在氮气中蒸发并干燥。再次加入甲苯，在真空中蒸发并干燥。将粗胺溶解在吡啶(0.5毫升)中，并与琥珀酸酐(2.6毫克，0.0259毫摩尔)反应。将反应混合物在室温下搅拌20小时。高真空下除去吡啶，剩余物在甲醇中通过Sephadex LH-20柱。产物在闪蒸二氧化硅柱上用甲醇洗脱进行进一步纯化，得到gA赖氨酸2X琥珀酸酯(10毫克，83％)。数据1H n.m.r.(CD3OD)δ0.4-1.8(84H，m)，2.0-2.2(8H，m)，2.58(4H，dd，CH2-CO)，2.9-3.4(14H，m)，3.90(2H，dd，CH2-gly)，4.0-4.8(15H，m)，6.8-7.6(20H，m)和8.18(1H，s，CHO)。15.gA赖氨酸2X三NTA的合成 将短杆菌肽赖氨酸2X琥珀酸酯(8.5毫克，0037毫摩尔)、N-羟基琥珀酰胺(4.2毫克，0.0364毫摩尔)和4-二甲基氨基吡啶(1毫克，0.0081毫摩尔)在蒸馏过的四氢呋喃(5毫升)中搅拌，并加入二环己基碳二亚胺(7.5毫克，0.0363毫摩尔)。混合物在氮气中回流1小时。蒸发混合物，并在甲醇中通过sephadex LH-20柱纯化。蒸发合适的部分，加入赖氨酸三NTA(8.5毫克，0.0085毫摩尔)。混合物在室温下搅拌18小时。蒸发反应混合物，在甲醇(X2)中通过sephadex LH-20柱纯化。得到gA赖氨酸2X三NTA(2.6毫克，19％)(因为溶解度低，所以损失一些化合物)。数据1H n.m.r.(CD3OD)δ0.4-1.8(108H，m)，2.0-2.2(8H，m)，2.62(4H，dd，CH2CO)，3.0-3.8(42H，m)，3.90(2H，dd，CH2-gly)，4.0-4.8(15H，m)，6.8-7.6(20H，m)和8.18(1H，s，CHO)。MALDI m.s. 3291.17(M+Na+)，3309.02(M+K+)。16. 三NTA.TMSE9的合成 C85H174N8O21Si91897.121895.071711C53.8％ H9.2％ N5.9％ O17.7％ Si13.3％将Z-三NTA.TMSE9(0.1克，50微摩尔)溶解在甲醇(10毫升)中。加入披钯木炭(10％)(约10毫克)并装上含有氢气的气囊。在室温下搅拌反应混合物90分钟，这段时间之后TLC分析显示起始物质已完全消失。反应混合物通过铁钙酸四钙石的短塞过滤，减压从反应混合物中除去所有的挥发物，得到三NTA.TMSE9的无色油状物(0.09克，定量)。数据电喷雾M/Sm/z 1898.3(100％)(M+H+)17.生物素三NTA.TMSE9的合成 C95H188N10O23SSi92123.422121.149311C53.7％ H8.9％ N6.6％ O17.3％ S1.5％ Si11.9％将生物素(20毫克，0.08毫摩尔)、4-二甲氨基吡啶(12毫克，0.1毫摩尔)和三NTA.TMSE9(0.10克，0.1毫摩尔)加入到干燥、新蒸的二氯甲烷(5毫升)中，并将反应混合物冷至0℃。加入EDC(40毫克，0.2毫摩尔)，反应在0℃搅拌1小时，然后暖至室温并在室温下搅拌3天。减压从反应混合物中除去所有挥发物，混合物用Sephadex LH-20柱以甲醇为洗脱液纯化。合并含有在5％的甲醇/二氯甲烷中Rf＝0.1的斑点的部分。得到生物素三NTA.TMSE9的无色的油状物(73毫克，0.03毫摩尔，34％)。数据电喷雾M/Sm/z 1173.9(100％)，2146.4(25％)(M+Na+)18.生物素三NTA的合成 C50H80N10O23S1221.291220.511851C49.2％ H6.6％ N11.5％ O30.1％ S2.6％在0℃下将三氟乙酸(2毫升)加入生物素三NTA TMSE9(19毫克，9微摩尔)中。在0℃下搅拌反应混合物3小时，然后减压除去所有挥发物。通过在Vydac C18柱上的反相HPLC采用在40分钟内自100％的溶剂A至含50％溶剂B的溶剂A梯度(溶剂A水/0.05％TFA；溶剂B乙腈/0.05％TFA)分析反应混合物，显示保留时间Rt＝24.1分钟的一个主峰。用反相制备HPLC分离反应混合物，得到生物素三NTA的白色固体(1.0毫克，0.8微摩尔，9％)。数据电喷雾M/Sm/z 1221.5(100％)(M+H+)，1243.4(33％)(M+Na+)19．脂质-三NTA的合成 C72H127N9O231486.841485.904482C58.2％ H8.6％ N8.5％ O24.7％在室温下将二十四胺(100毫克)的二氯甲烷(5毫升)溶液加入到琥珀酸酐(120毫克)和三乙胺(40毫克)的二氯甲烷(5毫升)溶液中。反应搅拌过夜，真空除去溶剂，剩余物用二氯甲烷-甲醇( )进行色谱分离，得到60毫克二十四胺半琥珀酰胺。将该物质加入三NTA TMSE9的二氯甲烷(10毫升)溶液中，随后加入DMAP(14毫克)。反应混合物冷至0℃，加入EDC(22毫克)，混合物在室温下搅拌3天。然后除去溶剂，剩余物用SephadexLH-20柱纯化，用甲醇洗脱，得到97毫克纯物质。将10毫克该物质溶解在TFA(1毫升)中，在氮气中搅拌3小时。真空除去溶剂，用水(1毫升)洗涤剩余的固体，真空干燥。该物质通过制备HPLC(C18 Alltime柱，含1％TFA的乙腈)纯化，分离得到期望产物(4毫克)。数据电喷雾M/Sm/z 1486.6(100％)(M+H+)，1508.8(62％)(M+Na+).20.跨膜磷酸胆碱脂(MSL-PC)的合成 C124H220NO24PS2准确质量2202.52分子量2204.17C67.57； H10.06； N0.64； O17.42； P1.41； S2.91将MSL-OH3(895毫克，0.44毫摩尔)溶解在含有喹啉(0.12毫升，2.2当量，用磷酸钠干燥，用前以锌粉蒸馏)的氯仿(6毫升)中。室温下将其缓慢加入新蒸的POCl3(0.09毫升，2.2当量)中。混合物在45℃下搅拌30分钟。冷却后加入溶解在干燥的吡啶(1毫升)中的甲苯磺酸胆碱(363毫克，1.3毫摩尔)，反应混合物在室温下搅拌过夜。加入水(0.5毫升)，混合物另外搅拌1小时。向反应混合物中加入氯仿(50毫升)，然后用每部分40毫升的水(×2)、3％碳酸钾(×2)、水(×2)、5％盐酸(×2)及水(×2)依次洗涤。(注意由于每次洗涤都会形成乳浊液，因此相分离过程是相当费时的。为了改善该过程，加入甲醇是必须的。)合并有机相，并用磷酸钠干燥。减压除去溶剂，剩余物通过硅胶柱色谱纯化[(洗脱液二氯甲烷∶丙酮∶甲醇∶氢氧化氨(8∶5∶5∶3))，得到122毫克无色蜡状的物质。数据1H n.m.r.δ(CDCl3∶CD3OD(3∶1))0.82-0.92(m，30H，植烷基CH3)，0.92-1.80(m，100H，植烷基CH2和CH)，2.61(t，2H，CH2CH2S)，2.65(s，8H，琥珀酸H)，3.20(s，9H，-N(CH3)3)，3.35-3.74(m，44H，-OCH2，-OCH，CH2N)，3.85(s，2H，SCH2Ph)，3.92(t，2H，CH2OP)，4.10(m，2H，POCH2CH2)，4.20(m，8H，酯的H)，6.90和7.43(d，8H，联苯基)，7.30(s，5H，PhCH2)。电喷雾M/Sm/z 2206(M+2)，1112，587，48821.二(N-甲基)-C38二胺的合成 准确质量1373.29分子量1374.31C78.66；H12.32；N2.04；O6.99向冷却至0℃的溶解在THF(10毫升)中的勃拉两亲物C38二醇(bola-amphiphile C38-diol3)(300毫克)的THF(10毫升)溶液中加入三乙胺(92微升)和甲烷磺酰氯(51微升)。溶液在室温下搅拌过夜，并用乙醚(30毫升)稀释。有机相用饱和碳酸氢钠(2×20毫升)和水(2×60毫升)洗涤，干燥(硫酸钠)并真空浓缩。将得到的物质(315毫克)加入压力管中，冷却至-80℃，加入急冷的甲胺(12毫升)。封上耐压管，并将混合物暖至室温。在室温下放置过夜后，蒸发掉过量的甲胺，将剩余物溶解在二氯甲烷中，与碳酸钾一起搅拌。过滤除去固体，滤液真空干燥。剩余物用二氯甲烷-甲醇-氨( )进行色谱分离，得到242毫克纯的产物。数据1H n.m.r.(CDCl3)δ0.80-0.95(30H，m，植烷基CH3)，0.95-1.70(100H，m，植烷基CH2和CH)，2.45(6H，s)，2.69(4H，m)，3.40-3.80(14H，m，CH-O和CH2-O)，3.98(4H，t，CH2OAr)，6.93，7.43(8H，AA′XX′多重峰，芳香-H)。22.XXFmoc的合成 C27H34N2O5准确质量466.25分子量466.57C69.50；H7.35；N6.00；O17.15在氮气中用TFA(5毫升)处理2X-Boc(420毫克)20分钟。减压除去TFA，并在高真空下干燥。然后将该剩余物溶解在9％的碳酸钠水溶液(6毫升)中，并将溶液冷却至0℃。将溶解在DMF(3毫升)中的Fmoc-NMS酯(购自CALBIOCHEM)(420毫克)加入到上面的在0℃搅拌的溶液中，并在室温下搅拌30分钟。加入水(100毫升)，用乙酸乙酯(2×50毫升)萃取水溶液，弃去有机萃取液。水层用浓盐酸(2-3毫升)酸化，并在冰浴中冷却，其间出现沉淀。过滤该沉淀物并干燥，得到白色粉末(210毫克)。数据NMR(CDCl3)1.2-1.8(m，12H)，2.20(t，2H)，2.35(t，2H)，3.25(m，4H)，4.259m，1H)，4.40(m，1H)，5.05(m，1H)，5.53(m，1H)，6.65(m，1H)，7.3-7.5(m，4H)，7.6(d，2H)，7.25(d，2H)EI质谱483.9(M+Na+)23.C38(NCH3)2单BOC的合成 将C38二胺(320毫克)、BOC-ON(63毫克)、三乙胺(37毫克)、THF(3毫升)和水(2毫升)的混悬液在室温下搅拌过夜。反应混合物用水(50毫升)稀释，并用二氯甲烷(2×80毫升)萃取。合并有机萃取液，用盐水(50毫升)洗涤，用硫酸镁干燥，并减压除去溶剂。粗产物用色谱纯化(含5-7％甲醇的二氯甲烷)。得到粘稠液体状的纯物质(150毫克)。数据NMR(CDCl3)0.7-0.9(m，30H)，1.0-1.9(m，109H)，2.51(s，3H)，2.7(m，2H)，2.91(s，3H)，3.1-3.7(m，16H)，4.0(t，4H)，6.9(d，4H)，7.4(d，4H)ES质谱1474.9(M+，100％)24.Boc-C38-2X-Fmoc的合成 C122H208N4O12准确质量1921.58分子量1922.98C76.20；H10.90；N2.91；O9.98
将2X-Fmoc(47毫克)、DCC(35毫克)、DMAP(3毫克)、C38-单Boc(150毫克)和DCM(10毫升)的混合物在室温下搅拌24小时。减压除去溶剂，粗产物用柱色谱(含5％甲醇的二氯甲烷)纯化，得到纯产物(200毫克)。数据NMR(CDCl3)0.8-0.9(m，30H)，0.95-2.5(m，125H)，2.9，2.95，3.05(3xs，6H)，3.1-3.75(m，m，22H)，4.0(t，4H)，4.1-4.4(m，3H)，6.9(d，4H)，7.3-7.4(m，4H)，7.5(d，4H)，7.6(d，2H)，7.75(d，2H)ES质谱1923.3(M+)，1945.1(M+Na+)25.MSL-三-NTA的合成 将Fmoc保护的物质(200毫克)溶解在哌啶DMF(20∶80)的溶液中，在室温下搅拌10分钟。减压除去DMF，以柱色谱(甲醇∶氨水∶DCm 10∶2∶88)纯化粗产物。分离得到无色半固体状的纯产物(148毫克)。
将一部分该C38衍生物(210毫克)、三NTA衍生物(135毫克)、DCC(33毫克)和DMAP(3毫克)溶解在干燥的二氯甲烷(3毫升)中，在室温下放置18小时。减压除去溶剂，以柱色谱纯化粗产物，得到无色粘稠液体状的纯物质(179毫克)。
将Boc和TMSE保护的物质(100毫克)溶解在TFA(2毫升)中，在室温下搅拌4小时。减压除去TFA，并在真空下干燥样品。
分子式如下的二硫化物酸的合成已在其它地方4被报导。 通过在DCC(15毫克)和DMAP(2.6毫克)的存在下，将酸(50毫克)与NHS(8毫克)在二氯甲烷(3毫升)中反应4小时，并以甲醇为洗脱液用Sephadex LH-20柱纯化，制备该物质的NHS酯。
将该活性酯在甲醇中与以上制备的完全脱保护的物质C38二胺-三NTA(100毫克)反应。室温下搅拌16小时后，除去溶剂，粗物质以甲醇为洗脱液用Sephadex LH-20柱被部分纯化。所获得的物质用制备HPLC(C18 Alltima柱，含0.05％TFA的甲醇-二氯甲烷)进一步纯化。26.6位组氨酸标记的蛋白与三NTA结合的动力学分析采用BIAcore技术进行结合的表面等离子体激光共振(SPR)分析。将商品化的J1芯片(BIAcore，乌普萨拉，瑞典)通过涂覆脂质层进行修饰。在一个超净防护罩中，将BIAcore J1芯片拔出以暴露金表面。将含有1.2微摩尔/升MSL三NTA、24微摩尔/升MSLPC的乙醇溶液(100微升)直接分散在金上。在保温1小时期间，每隔10-15分钟加入乙醇以防止乙醇的完全蒸发。然后通过移液管量取10×100微升的乙醇洗涤金表面，并在超净防护罩中风干。然后将芯片重新套上并用塑料薄膜(Parafilm)密封。
将该J1.三NTA芯片连接入BIAcore2000机器，在21℃用泵冲洗，流速为40微升/分钟的HBS/EDTA流动缓冲液(50毫摩尔/升HEPES，300毫摩尔/升氯化钠，50微摩尔/升EDTA，pH8.0)进行试验。相对于对照流通池1(Fc1)，流通池2(Fc2)用作试验池。因此，含有500微摩尔/升氯化镍的流动缓冲液仅注入通过Fc2，然后用缓冲液洗涤Fc25分钟。然后将感兴趣的蛋白质(100-600纳摩尔/升)注入(用KINJECT功能)，通过Fc1和Fc2 3-7分钟，然后用解离相7-15分钟。然后表面用含有350毫摩尔/升EDTA的流动缓冲液再生以除去氯化镍，从而将6位组氨酸标记的蛋白质从三NTA分子中释放出来。对各蛋白质，在所示浓度(
图1，图2)的范围内重复步骤2-4。采用的阴性对照是与6位组氨酸标记的蛋白质。结果表明三NTA与6位组氨酸标记的蛋白质以高亲和力结合(图1，图2)。6组氨酸核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶和6组氨酸CD40与三NTA结合的平衡常数分别是300皮摩尔/升和2.9纳摩尔/升。在没有Ni2+的存在下这些蛋白质不与三NTA结合，并且没有用6位组氨酸标记的蛋白质也不与三NTA结合。
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本领域技术人员将会理解，在没有背离如广泛描述的本发明的实质和范围的前提下，可以对如具体实施方案所示的本发明做多种变化或修改。因此在任何方面，这些实施方案都是说明性的而非限制性的。
权利要求
1.通式I的化合物Y-(Z)nI其中Y是分支部分，Z代表与金属离子配位的多齿配体螯合剂；且n是至少为2的整数。
2.如权利要求1所述的化合物，其中n是2至9的整数。
3.如权利要求2所述的化合物，其中n至少是3。
4.如前述任一权利要求所述的化合物，其中n是4。
5.如前述任一权利要求所述的化合物，其中Z的给体原子是氮。
6.如权利要求5所述的化合物，其中Z是四齿配体。
7.如权利要求7所述的化合物，其中Z是NTA残基。
8.如前述任一权利要求所述的化合物，其中Y提供至少三个部分，每个部分直接地共价连接于Z，或者通过任选的连接基团间接地连接于Z。
9.如前述任一权利要求所述的化合物，其中Y具有自低聚物或聚合物形成的主链。
10.如权利要求9所述的化合物，其中的主链是直链的。
11.如权利要求1-8中任一权利要求所述的化合物，其中Y选自由氨基多元醇、氨基酸、氨基多元羧酸、多元胺、多元酸和多羟基化合物组成的组。
12.如权利要求9所述的化合物，其中Z选自由肽和dendron组成的组。
13.如前述任一权利要求所述的化合物，具有分子式IIX-Y-(Z)nII其中Y、Z和n如前定义，X是分隔部分。
14.如权利要求13所述的化合物，其中X是亲水的、疏水的或者具有疏水区和亲水区。
15.如权利要求14所述的化合物，其中X是或者包含选自由取代或未取代的烷基组成的组的部分，任选地被一个或多个杂原子、低聚烯化氧、氨基酸序列、多肽、低聚酰胺、聚酰胺和脂质分隔。
16.如权利要求15所述的化合物，其中X选自由低聚乙二醇、氨基己酰低聚物和跨膜脂质(MSL)组成的组。
17.如权利要求13-16中任一权利要求所述的化合物，其中X包含亲水区、疏水区。
18.如权利要求13-17中任一权利要求所述的化合物，其中Y是分支部分，它提供多个用以共价连接于Z的部分和一个用以共价连接于X的部分。
19.如权利要求18所述的化合物，其中Y选自由氨基多元醇、氨基酸、含有多个游离酸和/或胺部分的肽、多羟基化物质和含有易于被亲核试剂取代的基团或者亲核试剂易于加成其上的基团的化合物或它们的组合组成的组。
20.如权利要求19所述的化合物，其中Y选自由TRIS、bis-homotris、3，5-二氨基苯甲酸、5-氨基间苯二甲酸、 糖、dendron和α，β-不饱和酮组成的组。
21.如权利要求13-20中任一权利要求所述的化合物，具有分子式IIIW-X-Y-(Z)nIII其中X、Y、Z和n如前定义，W是允许连接于其它分子、连接于表面或者镶嵌入膜中的基团。
22.如权利要求21所述的化合物，其中W包含选自胺官能团、羧酸官能团、醇官能团、卤素官能团、硫醇、二硫化物、硅烷衍生物、可溶于膜的蛋白质、允许非共价连接的基团、离子载体或脂质基团的一个或多个官能团。
23.如权利要求22所述的化合物，其中W是短杆菌肽或生物素。
24.包含自组装膜的生物传感器，所述的膜包含多个如权利要求13-23中任一权利要求所述的分子式III的结合化合物，其中W是嵌入膜中的离子载体。
25.如权利要求24所述的生物传感器，其中的离子载体是短杆菌肽。
26.如权利要求24或25所述的生物传感器，其中的膜包含第二种多个分子式III的结合化合物，其中的W是嵌入膜中的双亲物。
27.如权利要求1-23中任一权利要求所述的化合物在金属亲和色谱中的用途。
28.包含如权利要求1-23中任一权利要求所述的化合物的金属亲和色谱柱。
全文摘要
本发明涉及分子式(III)的新的蛋白结合化合物:W－X－Y－(Z)
文档编号C07B61/00GK1345301SQ00803375
公开日2002年4月17日 申请日期2000年2月8日 优先权日1999年2月8日
发明者殷萍, 克里斯托弗·约翰·伯恩斯, 马修·彼得·威尔金森 申请人:澳大利亚膜和生物技术研究所, 悉尼大学