使用磺酸化合物降解蛋白质的方法

专利名称：使用磺酸化合物降解蛋白质的方法
技术领域：
本发明涉及一种降解蛋白质的方法，及一种用蛋白酶处理样品中糖化蛋白并使用一种氧化还原反应确定糖化蛋白的量的方法。
背景技术：
常规地，为检测样品中的靶蛋白(包括肽)或者灭活影响测定的蛋白质的功能，在各种测定方法中已经应用了一种用蛋白酶降解蛋白质的方法。
例如，现在尝试通过酶促方法测定在糖尿病等的诊断、治疗中作为A重要指示剂的血细胞中的糖化蛋白，尤其是反映病人既往血糖水平的红细胞中的糖化血红蛋白。在这种情况下，也使用蛋白酶降解糖化蛋白的方法。在酶促方法中，使一种果糖基氨基酸氧化酶(后文称作FAOD)作用于溶血样品中糖化蛋白的糖化部分，由此产生过氧化氢。这种过氧化氢的量相应于糖化蛋白的量。然后，向已经用FAOD处理过的样品中加入一种过氧化物酶(后文称作POD)和一种通过氧化而生色的底物，以便以POD作为催化剂在过氧化氢和所述底物之间产生氧化还原反应。此时，由于底物被氧化时生色，因此可以通过产生的颜色确定过氧化氢的量。结果，可以确定样品中糖化蛋白的量。
然而，作用于糖化部分的FAOD作用于糖化氨基酸和较短的糖化肽比作用于糖化蛋白和糖化肽更容易。因此，通过预先用蛋白酶降解糖化蛋白和糖化肽以便FAOD可更容易地作用于糖化的部分，可以改良测定的精确性。
然而，由于蛋白酶具有底物特异性并显示出根据所处理的底物而具有不同的降解活性，因此存在这样一个问题，即根据靶蛋白的种类，所述降解也许耗时很长而且不能迅速进行测定。另外，如在上述糖化蛋白的情况下那样，靶蛋白被糖化时，由于其位阻等原因而有时难以降解。为此，例如当以上述方式测定所述糖化蛋白时，由于预先进行蛋白酶处理的原因导致测定方法总体上也耗时很长。因此，从在临床试验等领域可利用的角度出发，需要一种可以更迅速测定糖化蛋白的方法。

发明内容
因此，本发明的一个目的在于提供一种产生蛋白质降解产物的方法，通过这种方法蛋白质被迅速而有效地降解，本发明还提供了一种降解样品中糖化蛋白及确定该糖化蛋白的量的方法。
为实现上述目的，本发明的产生蛋白质降解产物的方法包括在存在磺酸化合物的情况下用一种蛋白酶处理蛋白质。在本发明中，术语“蛋白质”也包括肽，术语“蛋白质降解产物”包括上述肽的降解产物。
以此方式在存在磺酸化合物的情况下进行蛋白酶处理使得可以迅速降解样品中的蛋白质。
接下来，本发明的测定糖化蛋白的方法包括在存在磺酸化合物的情况下进行蛋白酶处理，其中通过用一种蛋白酶处理含有糖化蛋白的样品以降解该糖化蛋白，使得通过降解获得的糖化蛋白降解产物的糖化部分与FAOD彼此反应，并对这个氧化还原反应进行测定，从而确定糖化蛋白的量。附带提及的是本发明中术语“糖化蛋白”还包括糖化的肽。
在不存在磺酸化合物的情况下进行的常规方法中，蛋白酶处理必需使用足够的蛋白酶耗时例如大约6-40小时来降解糖化蛋白，以便使FAOD易于作用于糖化的部分。因此，上述酶促方法需要长时间才能测定糖化蛋白，因此不是非常实用。相反，根据本发明的测定方法，由于可以在短时期内降解糖化蛋白等，因此可以迅速地测定糖化蛋白等。例如，在与常规方法中除了加入磺酸化合物之外的相同条件下，本发明的测定方法可以将测定所需的时间缩短为在没有磺酸化合物的情况下测定所需的时间的1/10至1/2000。因此，本发明的测定方法是一种更迅速及更精确的测定方法，其可用在如上述的各种临床试验中。
进行本发明的最佳模式在本发明的产生蛋白质降解产物的方法及测定糖化蛋白的方法中，所述磺酸化合物可以是例如由通式R-SO3X表示的一种化合物。在上述通式中，X是例如Na、K、Li、H等，R优选是一个疏水性基团，例如CH3(CH2)n-、CH3(CH2)n-C6H4、C6H5-、C6H5-N＝N-C6H4-、C6H5-CH＝CH-C6H4-等。例如在所述R中，n在1-20范围内。在上述R中，H可以由一个酰基基团、硝基基团、亚硝基基团、苯基基团、烷基基团、烷基醚基团等取代。
磺酸化合物的特殊实例包括例如十二烷基硫酸钠(后文称作SLS)、十二烷基苯磺酸钠盐(后文称作SDBS)、十二烷基硫酸锂(后文称作LiLS)、4-氨基偶氮苯-4’-磺酸钠盐(后文称作ABSA)、4-氨基-4’-硝基茋-2，2’-二磺酸二钠盐(后文称作ANDS)、4，4’-二叠氮茋-2，2’-二磺酸二钠盐(后文称作DADS)、N-环己基-2-氨基乙磺酸、N-环己基-3-氨基丙烷磺酸、N-环己基-2-羟基-3-氨基丙烷磺酸、哌嗪-1，4-二(2-乙磺酸)、红菲绕啉磺酸等，所述磺酸化合物优选是SLS、SDBS、或LiLS。
由于这些磺酸化合物通常具有高度溶解性，因此即使当样品中糖化蛋白的浓度很高时也易于处理。另外，从便宜的角度来看，所述磺酸化合物也是非常有用的。
另外，在本发明的产生方法和测定方法中，优选在存在磺酸化合物和硝基化合物这二者的情况下进行蛋白酶处理，因为这样可以进一步促进糖化蛋白的降解。
上述硝基化合物非特殊限制性地是例如硝基苯化合物或二硝基苯化合物。这些化合物的苯环优选不仅具有硝基基团，而且还具有一个取代基如-NH2、-OH、-COOH、-SO3或-(CH2)nCH3(n＝2至9)。所述取代基也可例如是一个卤素基团、醚基团或苯基基团。
硝基化合物的特异性实例包括例如2，4-二硝基苯酚(2，4-DNP)、2，5-二硝基苯酚、2，6-二硝基苯酚、4，6-二硝基-2-甲基苯酚、2-氨基-4-硝基苯酚、2-氨基-5-硝基苯酚、2-氨基-4-硝基苯酚、对硝基苯酚(p-NP)、2，4-二硝基苯胺(2，4-DNA)、对硝基苯胺(p-NA)、亚硝酸钠(NaNO2)、亚硝酸钾(KNO2)、4-氨基-4’-硝基茋-2，2’-二磺酸二钠盐(后文称作ANPS)、硝基苯等。当所述磺酸化合物和硝基化合物均如上述存在时，其组合没有特别限制。
在本发明的产生方法和测定方法中，所述蛋白酶没有特别的限制，例如可以是丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶等。更特异地，可优选使用胰蛋白酶、蛋白酶K、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、枯草蛋白酶、弹性蛋白酶、氨基肽酶等。在被降解的糖化蛋白是糖化血红蛋白的情况下，更优选使用选择性降解糖化血红蛋白的一种蛋白酶，例如菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、衍生自猪胰腺的胰蛋白酶、金属蛋白酶及衍生自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的蛋白酶。衍生自枯草芽孢杆菌的蛋白酶例如包括蛋白酶N(商品名，例如由Fluka Chemie AG生产)、蛋白酶N“AMANO”(商品名，由Amano Enzyme Inc.生产)等。金属蛋白酶例如包括衍生自芽孢杆菌属的金属蛋白酶(EC 3.4.24.4)等。在这些蛋白酶之中，更优选金属蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶，最优选金属蛋白酶。通过使用如上述可选择性进行降解的蛋白酶，可以选择性制备一种特异的糖化蛋白的降解产物。
如上所述，本发明的产生蛋白质降解产物的方法，其特征在于在存在一种磺酸化合物的情况下用一种蛋白酶处理蛋白质。
加入的磺酸化合物的量没有特别限制，但可根据例如所述蛋白酶的种类和加入量、样品的种类、样品中包含的蛋白质的量等而适当确定。
更特异地，就1μL的样品而言，加入的磺酸化合物优选在0.01-1000μmol范围，更优选在0.03-200μmol范围，特别优选在0.05-40μmol范围内。
在既加入磺酸化合物又加入硝基化合物的情况下，1μL的样品中加入的磺酸化合物优选在0.005-20μmol范围，加入的硝基化合物优选在0.005-25μmol范围，前者更优选在0.02-4μmol范围，后者更优选在0.01-5μmol范围。
蛋白酶处理的条件没有特别限制，但优选例如根据所使用的酶的最佳条件而定。当蛋白酶是金属蛋白酶时，温度范围是10℃-37℃，处理时间为30秒至60分钟。优选温度范围是20℃-37℃，处理时间为30秒至10分钟，更优选温度范围是25℃-37℃，处理时间为30秒至5分钟。
接下来，如上所述，本发明的测定糖化蛋白的方法包括在存在磺酸化合物的情况下进行蛋白酶处理，其中通过用一种蛋白酶处理含有糖化蛋白的样品以降解该糖化蛋白，使通过降解获得的糖化蛋白的降解产物与一种果糖基氨基酸氧化酶彼此相互反应，并对这个氧化还原反应加以测定，从而确定糖化蛋白的量。
在本发明的测定方法中，加入的磺酸化合物的量没有特别限制，但可根据例如所述蛋白酶的种类和加入量、样品的种类、样品中包含的蛋白质的量等而适当确定。
更特异地，就1μL的样品而言，加入的磺酸化合物优选在0.01-1000μmol范围，更优选在0.03-200μmol范围，特别优选在0.05-40μmol范围内。
在既加入磺酸化合物又加入硝基化合物的情况下，就1μL的样品而言，加入的磺酸化合物优选在0.005-20μmol范围，加入的硝基化合物优选在0.005-25μmol范围，前者更优选在0.02-4μmol范围，后者更优选在0.01-5μmol范围。
在本发明的测定方法中，对样品没有特别限限制。除了血液样品如全血、血浆、血清和血细胞之外，样品还可以是例如生物学样品如尿液、脊髓液和唾液，饮料如果汁，或食物如酱油和Worcestershire酱油。在上述样品中，优选血液样品如全血和血细胞。
在本发明的分析物中，被蛋白酶降解的糖化蛋白是例如糖化血红蛋白、糖化白蛋白等，其中优选糖化血红蛋白。由于血液中血红蛋白的浓度高达大约60-200g/L及因此而难以降解，因此蛋白酶处理要花费几个小时至几天时间。本发明的测定方法使得可以在例如20秒至2小时内进行蛋白酶处理，可以快速测定糖化血红蛋白。
另外，在本发明的测定方法中，优选在不仅存在磺酸化合物而且还存在硝基化合物的情况下进行蛋白酶处理，因为这样可以进一步促进糖化蛋白的降解。
在本发明的测定方法中，优选所述氧化还原反应是通过确定所述糖化蛋白的糖化部分与FAOD反应而产生的过氧化氢的量而测定的。还优选所述过氧化氢的这个量是使用氧化酶如POD来还原所产生的过氧化氢，并氧化一种通过氧化可生色的底物(后文称作生色底物)，及测定底物生色程度而确定。
所述生色底物没有特别限制，但可以例如是下述生色底物。这些生色底物的吸光度通常位于400nm或更长处。另一方面，上述磺酸化合物和硝基化合物通常在400nm或更长处不具有吸光度，以便即使当使用这些生色底物时也不需要担心在测定中产生误差。
更具体地，所述生色底物可以是例如N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-二(二甲基氨基)二苯胺钠盐(后文称作DA-64)、Trinder’s试剂与4-氨基安替比林的组合、N，N，N’，N’N”，N”-六(3-磺丙基)-4，4’，4”-三氨基三苯甲烷六钠盐(后文称作TPM-PS)、N，N，N’，N’N”，N”-六(2-羟基-3-磺丙基)-4，4’，4”-三氨基三苯甲烷六钠盐(后文称作TPM-OS)、10-(羧甲基氨基羰基)3，7-二(二甲基氨基)酚噻嗪钠盐(后文称作DA-67)、10-(甲基氨基羰基)3，7-二(二甲基氨基)酚噻嗪(后文称作MCDP)、10-(羧基氨基甲基-4-苯氨基羰基)3，7-二(二甲基氨基)酚噻嗪钠盐(后文称作MMX)等。在上述底物中，例如优选基于三氨基三苯甲烷的生色底物。
Trinder’s试剂可例如是苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺或萘胺衍生物。与Trinder’s试剂组合的化合物可不仅是上述4-氨基安替比林，也可以例如是氨基安替比林的衍生物、香草醛二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉酮腙(methyl benzothiazolinone hydrazone，MBTH)、磺酸化的甲基苯并噻唑啉酮腙(sulfonated methylbenzothiazolinone hydrazone，SMBTH)等。
在本发明中，优选FAOD是催化由下式(1)所示反应的FAOD。
(1)在式(1)中，R1代表一个羟基基团或者一个在糖化之前衍生自糖的残基(即糖残基)。所述糖残基(R1)当所述糖在糖化之前是醛糖时是醛糖残基，所述糖残基(R1)当所述糖在糖化之前是酮糖时是酮糖残基。例如当所述糖在糖化之前是葡萄糖时，其在糖化后通过Amadori重排而具有果糖结构。在这种情况下，所述糖残基(R1)成为一个葡萄糖残基(一个醛糖残基)。这个糖残基(R1)可以例如由-[CH(OH)]n-CH2OH表示，其中n是0-6之间的一个整数。
在式(1)中，R2没有特别限制。然而，当例如所述底物是一种糖化氨基酸、糖化肽或糖化蛋白时，在α-氨基基团被糖化的情况与除了α-氨基基团之外的一个氨基基团被糖化的情况之间存在不同之处。
在式(1)中，当α-氨基基团被糖化时，R2是由下式(2)表示的一个氨基酸残基或肽残基。
-CHR3-CO-R4(2)在式(2)中，R3代表一个氨基酸侧链基团。R4代表一个羟基基团、氨基酸残基或肽残基，而且可以由下式(3)表示。在式(3)中，n是0或更大的整数，R3表示如上述的氨基酸侧链基团。
-(NH-CHR3-CO)n-OH (3)
在上式(1)中，当除了α-氨基基团之外的一个氨基基团被糖化时(即一个氨基酸侧链基团被糖化)，R2可以由下式(4)表示。
-R5-CH(NH-R6)-CO-R7(4)在上式(4)中，R5表示氨基酸侧链基团中除了糖化的氨基基团之外的部分。例如当所述糖化的氨基酸是赖氨酸时，R5如下所示。
-CH2-CH2-CH2-CH2-再例如，当所述糖化的氨基酸是精氨酸时，R5如下所示。
-CH2-CH2-CH2-NH-CH(NH2)-在上式(4)中，R6表示氢、一个氨基酸残基或一个肽残基，而且可以例如由下式(5)表示。在式(5)中，n是0或更大的一个整数，R3表示如上述的一个氨基酸侧链基团。
-(CO-CHR3-NH)n-H (5)在上式(4)中，R7表示一个羟基基团、氨基酸残基或肽残基，而且可以例如由下式(6)表示。在式(6)中，n是0或更大的一个整数，R3表示如上述的一个氨基酸侧链基团。
-(NH-CHR3-CO)n-OH (6)在下文中通过具体的实施例对本发明的测定糖化蛋白的方法进行描述。应注意本发明非限于以下实施方案。
(第一个实施方案)本发明的测定糖化蛋白的方法将参考实施例加以描述，所述实施例中分析物是血细胞中的一种糖化蛋白。
首先，将全血进行溶血，或者以常规的方式如离心从全血中分离血细胞级分然后溶血，以制备溶血的样品。产生溶血的方法没有特殊限制，可例如是使用表面活性物质的方法、使用超声波的方法、利用不同渗透压的方法等。在这些方法中，优选使用表面活性物质的方法。
进行溶血的表面活性物质没有特别限制，例如包括非离子表面活性物质如聚氧乙烯-p-t-辛基苯基醚(例如Triton系列表面活性物质)、聚氧乙烯山梨聚糖烷基酯(例如Tween系列表面活性物质)、聚氧乙烯烷基酯(例如Brij系列表面活性物质)等。特别例如是商品名为Triton X-100、商品名为Tween-20、商品名为Brij35等的表面活性物质。用表面活性物质进行处理的条件通常如下当被处理的溶液中血细胞的浓度为1-10vol％时，加入表面活性物质以使得其在溶液中的浓度在0.1-1wt％范围内，在室温搅拌大约5秒至1分钟。
在利用渗透压不同的情况下，可例如通过加入体积为全血的2-100倍的纯水而进行溶血。
接下来，将溶血的样品在存在磺酸化合物的情况下用蛋白酶处理，以降解糖化蛋白，由此制备糖化蛋白降解产物。用蛋白酶处理糖化蛋白的原因如上所述。考虑到在随后的程序中所用的FAOD如前所述不太可能作用于蛋白质和长多肽链，因此将这些蛋白质和长多肽链降解以便FAOD可更易于作用于糖化蛋白。由于如上述在存在磺酸化合物的情况下蛋白酶处理可在短时间内降解糖化蛋白并具有高度降解效力，因此即使短时间的蛋白酶处理也可使得FAOD足够地作用于糖化部分。为进一步促进降解，所述处理可以在如下文所述存在磺酸化合物和硝基化合物的情况下进行。
蛋白酶处理通常在一种缓冲液中进行。缓冲液的类型没有特别限制，可例如是tris盐酸缓冲液、EPPS缓冲液、PIPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、ADA缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、甘氨酰胺缓冲液、CHES缓冲液等。其pH范围优选为5-12，更优选为6-10，特别优选为7-9。
作为蛋白酶，例如蛋白酶K、枯草蛋白酶、胰蛋白酶、氨肽酶等可如上述使用。加入的蛋白酶的比率如下例如当被处理的溶液中血细胞浓度为0.1-10vol％时，加入蛋白酶以便其在溶液中的比率优选在0.1-100g/L范围内，更优选在0.3-50g/L范围内，特别优选在0.5-20g/L范围内。
在被降解的糖化蛋白是糖化血红蛋白的情况下，优选使用选择性降解糖化血红蛋白的蛋白酶，例如上述菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、衍生自猪胰腺的胰蛋白酶、金属蛋白酶及衍生自枯草芽孢杆菌的蛋白酶。加入的蛋白酶比率如下例如当被处理的溶液中血细胞浓度为0.1-10vol％时，加入蛋白酶以便其在溶液中的比率优选在0.1-50g/L范围内，更优选在0.3-30g/L范围内，特别优选在1-20g/L范围内。更具体地，当所述蛋白酶是金属蛋白酶时，优选将其加入血细胞浓度为0.3-5vol％的溶液中，以便其在该溶液中的比率在0.1-30g/L范围内，更优选在0.3-20g/L范围，特别优选在1-10g/L范围内。
加入的磺酸化合物的比率如下例如当用蛋白酶处理的溶液中血细胞浓度为1vol％时，加入所述磺酸化合物以便其在该溶液中的浓度优选在0.0001-100mmol/L范围，更优选在0.0003-60mmol/L范围，特别优选在0.001-30mmol/L范围内。更具体地，当所述磺酸化合物是SLS及在用蛋白酶处理的溶液中血细胞浓度为1vol％时，优选加入所述磺酸化合物，以便其在该溶液中的浓度在0.1-100mmol/L范围，更优选在0.2-60mmol/L范围，特别优选在0.5-30mmol/L范围。
尽管可以其本身的形式使用磺酸化合物，但为了操作的简便性及处理效力，优选使用溶解于一种溶剂中的磺酸化合物溶液。这个溶液的浓度可以适当地依赖于所述磺酸化合物的种类等加以确定，例如在1-1000mmol/L范围。作为溶剂，可以使用蒸馏水、生理盐水、缓冲液等，所述缓冲液可以是例如上述列出的任何缓冲液。附带提及的是上述磺酸化合物可以是一种化合物或者两或多种化合物的组合。
在存在磺酸化合物的情况下进行蛋白酶处理的条件没有特别限制，可例如下所示温度范围是10℃-37℃，处理时间为30秒至60分钟。温度优选在20℃-37℃，处理时间优选在30秒-10分钟，更优选温度在25℃-37℃，处理时间在30秒-5分钟。
以这种方式在存在磺酸化合物的情况下对样品进行蛋白酶处理可进一步促进样品中糖化蛋白的降解，以便可以在短时间内及高降解效力地获得糖化蛋白的降解产物。
另外，通过在不仅存在磺酸化合物而且还存在硝基化合物的情况下进行这种蛋白酶处理，可进一步促进蛋白酶的降解作用。
加入的硝基化合物的比率没有特别限制，可以根据例如加入的磺酸化合物的量、蛋白酶的量而适当确定。当用蛋白酶处理的溶液中血细胞浓度为1vol％时，加入硝基化合物以便例如其在该溶液中的浓度优选在0.01-25mmol/L范围，更优选在0.05-10mmol/L范围。
接下来，用FAOD处理通过蛋白酶处理获得的降解产物。这种FAOD处理催化上式(1)所示反应。
优选FAOD处理在与上述蛋白酶处理中相同的缓冲液中进行。FAOD处理的条件根据所用的FAOD的种类、作为分析物的糖化蛋白的种类和浓度等而适当确定。
更具体地，所述条件如下反应溶液中FAOD的浓度为50-50000U/L，反应溶液中血细胞的浓度为0.01-1vol％，反应温度为15℃-37℃，反应时间为1-60分钟，pH为6-9。另外，缓冲液的种类没有特别限制，例如可以使用与在蛋白酶处理中相似的缓冲液。
随后，将POD和生色底物加入在上述FAOD处理中产生的过氧化氢中，以使得底物生色，并测定生色程度。当POD作用于过氧化氢时，过氧化氢被还原及生色底物被氧化由此生色。由于底物通过氧化而生色程度与产生的过氧化氢的量相关，因此过氧化氢的量可以通过测定生色程度而确定。
所述生色底物可以是如上述那些底物，特别优选是N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-二(二甲基氨基)二苯胺钠盐。
生色反应通常在缓冲液中进行。反应条件根据产生的过氧化氢的浓度等适当确定。所述条件通常如下反应溶液中POD的浓度为10-20000IU/L，生色底物浓度为0.001-1mmol/L，反应温度为20℃-37℃，反应时间为1-5分钟，pH为6-9。另外，所述缓冲液的种类没有特别限制，例如可以使用与蛋白酶处理及FAOD处理中相同的缓冲液。
在生色反应中，例如当使用生色底物时，过氧化氢的量可以通过用分光光度计测定反应溶液中生色程度而确定。然后，使用过氧化氢的这个浓度和校准曲线等，可以确定样品中糖化蛋白的量。
过氧化氢的量不仅可以通过上述使用POD等的酶促方法确定，也可以通过例如电方法确定。
通过采用本发明的这种测定方法，可以如上述快速进行测定。另外，当缩短蛋白酶处理时，常规的方法的测定精确性降低，而本发明的测定方法可以实现甚至在短时间内非常精确地进行测定。
实施例以下将描述一些实施例及比较例。
实施例1和比较例1在实施例1中，将糖化蛋白在存在一种磺酸化合物的情况下用蛋白酶处理，由此使用生色底物TPM-PS测定其降解产物的糖化程度。在此使用的样品和试剂及方法如下所述。在下述第一种试剂中所述磺酸化合物是SLS(由Nacalai Tesque公司生产)。
(进行测定的样品的制备)将冻干的血红蛋白溶解于纯水中，由此制备血红蛋白浓度为50g/L及HbA1c浓度为6.5％的一种血红蛋白溶液(HbA1c低)及血红蛋白浓度为50g/L及HbA1c浓度为11.5％的一种血红蛋白溶液(HbA1c高)。然后，将60μL每种血红蛋白溶液与240μL纯水混合以制备HbA1c浓度为6.5％的一种样品(后文称为“低样品”)及HbA1c浓度为11.5％的一种样品(后文称为“高样品”)。
(第一种试剂)磺酸化合物 6.4mM表面活性物质(聚氧乙烯(9)十二烷基醚)1.85g/LCHES-CHES·Na缓冲液(pH9.4) 40mMMOPS-MOPS·Na缓冲液(pH9.4) 15mM(第二种试剂)金属蛋白酶(由ARKRAY公司生产) 2.0MU/LCaCl22.5mMNaCl 50mMMOPS-MOPS·Na缓冲液(pH6.5) 1.0mM(第三种试剂)FAOD(由ARKRAY公司生产) 18KU/LPOD(由Kikkomaan公司生产) 67KU/LTPM-PS(由DOJINDO LABORATORIES生产) 0.25mMTris-HCl缓冲液(pH7.0) 300mM(方法)针对低样品和高样品进行测定。首先，在向0.14μL进行测定的样品中加入8.26μL第一种试剂之后，进一步混合入75.6μL第二种试剂并在37℃保持5分钟。然后，将18.9μL第三种试剂混合入该混合物中，在37℃温育以开始生色反应。用商品名为JCA-BM8(由JEOL公司生产)的仪器测定在加入第三种试剂后2.5分钟反应溶液的吸光度。测定波长设定为571nm作为主波长，805nm为次波长。另一方面，在比较例中，与上述实施例1相似地测定吸光度，只是不加入第一种试剂中的磺酸化合物。当第一种试剂与第二种试剂混合进样品中时，在1μL样品中加入的磺酸化合物的量为0.378μmol。
表1

如表1所示，在实施例1中，高样品的吸光度和低样品的吸光度分别高于比较例的吸光度。这是由于在存在磺酸化合物的情况下通过蛋白酶处理，促进糖化血红蛋白的降解，以便FAOD可更易于作用于糖化部分。换而言之，根据实施例1，加速降解使得与比较例相比FAOD更易于作用于糖化部分，由此改良了测定的精确性。
另外，在实施例1中，高样品与低样品的吸光度之间的差异高于比较例中的这种差异。高样品与低样品的血红蛋白浓度相同，但高样品中HbA1c浓度高于低样品中HbA1c浓度。换而言之，由于血红蛋白的较高的糖化量，因此与HbA1c成比例，高样品理论上吸光度高于低样品吸光度。然而，在比较例中，由于蛋白酶处理是在没有磺酸化合物的情况下进行的，因此糖化血红蛋白难以降解。因此，尽管高样品和低样品具有不同的HbA1c浓度，但其吸光度的差异只有7.1mAbs。另一方面，在蛋白酶处理是在存在磺酸化合物的情况下进行的实施例中，高样品和低样品之间的吸光度的差异比比较例中的这种差异要高出2-3倍。就上述同样原因而言，还显示出实施例1的方法改良了测定的敏感性和精确性。
实施例2在实施例2中，糖化血红蛋白在存在磺酸化合物的情况下用蛋白酶处理，由此使用生色底物DA-64测定其降解产物的糖化程度。在此所用的样品和试剂及方法如下所述。
(第一种试剂)磺酸化合物(SLS由Nacalai Tesque公司生产)6.4mM表面活性物质(聚氧乙烯(9)十二烷基醚) 1.85g/LCHES-CHES·Na缓冲液(pH9.4) 40mMMOPS-MOPS·Na缓冲液(pH9.4) 15mM(第二种试剂)硝基化合物0.9mM或1.8mM金属蛋白酶(由ARKRAY公司生产) 2.0MU/LCaCl22.5MmNaCl 50mMMOPS-MOPS·Na缓冲液(pH6.5) 1.0mM作为硝基化合物，单独地使用2，4-DNA(由Wako Pure ChemicalIndustries Ltd.生产)，p-NA(由Wako Pure Chemical Industries Ltd.生产)，p-NP(由Wako Pure Chemical Industries Ltd.生产)，NaNO2(由NacalaiTesque公司生产)和2，4-DNH(由Wako Pure Chemical Industries Ltd.生产)。在加入两种硝基化合物的情况下，总浓度为1.8mM(每种化合物浓度为0.9mM)。
(第三种试剂)FAOD(由ARKRAY公司生产) 18KU/LPOD(由Kikkoman公司生产) 67KU/LDA-64(由Wako Pure Chemical Industries Ltd.生产) 70μMTris-HCl缓冲液(pH7.0)300mM
(方法)对在上述实施例1中制备的低样品和高样品进行测定。在将8.26μL第一种试剂加入0.14μL测定样品中之后，将75.6μL第二种试剂进一步混合入其中，在37℃保持5分钟。然后，将18.9μL第三种试剂混合入该混合物中，在37℃温育以进行生色反应。在5分钟之后用商品名为JCA-BM8(由JEOL.Ltd.生产)的仪器测定吸光度。测定波长设定为751nm作为主波长，805nm作为次波长。另一方面，在比较例2中，与上述实施例相似地测定吸光度，不同之处为不加入第一种试剂中的磺酸化合物和第二种试剂中的硝基化合物。结果示于下表2。在表2中，“高-低(mAbs)”是通过从高样品中减去低样品中的吸光度而获得的数值。
表2

如表2所示，与实施例相似，在实施例2中高样品的吸光度和低样品的吸光度分别高于比较例中吸光度。另外，高样品中吸光度和低样品中吸光度的差异高于比较例2中这种差异。这些结果示出，与实施例1相似，在存在磺酸化合物和硝基化合物的情况下，促进了糖化血红蛋白的降解，由此改良了测定的敏感性和精确度。
工业实用性如上所述，根据本发明的测定方法，通过在存在磺酸化合物的情况下进行蛋白酶处理，可以在短时间内降解蛋白质等，由此可以快速测定糖化蛋白等。这使得可以实现仍旧具有较高精确性的测定，并由此本发明的测定方法可用于如上述各种临床医学测试中。
权利要求
1.一种产生蛋白质降解产物的方法，包括在存在磺酸化合物的情况下用蛋白酶处理蛋白质。
2.权利要求1的方法，其中将所述蛋白质在存在所述磺酸化合物并存在硝基化合物的情况下用所述蛋白酶进行处理。
3.权利要求1的方法，其中所述磺酸化合物是选自如下一组的至少一种化合物十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠盐、十二烷基硫酸锂、4-氨基偶氮苯-4’-磺酸钠盐、4-氨基-4’-硝基茋-2，2’-二磺酸二钠盐、4，4’-二叠氮茋-2，2’-二磺酸二钠盐、N-环己基-2-氨基乙磺酸、N-环己基-3-氨基丙烷磺酸、N-环己基-2-羟基-3-氨基丙烷磺酸、哌嗪-1，4-二(2-乙磺酸)和红菲绕啉磺酸。
4.权利要求2的方法，其中硝基化合物是选自如下一组的至少一种化合物2，4-二硝基苯酚、2，5-二硝基苯酚、2，6-二硝基苯酚、4，6-二硝基-2-甲基苯酚、2-氨基-4-硝基苯酚、2-氨基-5-硝基苯酚、2-氨基-4-硝基苯酚、对硝基苯酚、2，4-二硝基苯胺、对硝基苯胺、亚硝酸钠、亚硝酸钾、4-氨基-4’-硝基茋-2，2’-二磺酸二钠盐和硝基苯。
5.权利要求1的方法，其中所述蛋白酶是金属蛋白酶。
6.权利要求1的方法，其中所述蛋白质是糖化蛋白。
7.一种测定糖化蛋白的方法，其中通过用蛋白酶处理含有糖化蛋白的样品以降解所述糖化蛋白，使通过降解获得的糖化蛋白降解产物的糖化部分与一种果糖基氨基酸氧化酶彼此反应，并对该氧化还原反应进行测定，从而确定所述糖化蛋白的量，所述方法包括在存在磺酸化合物的情况下进行所述蛋白酶处理。
8.权利要求7的方法，其中所述蛋白酶处理是在存在所述磺酸化合物并存在硝基化合物的情况下进行。
9.权利要求7的方法，其中所述磺酸化合物是选自如下一组的至少一种化合物十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠盐、十二烷基硫酸锂、4-氨基偶氮苯-4’-磺酸钠盐、4-氨基-4’-硝基茋-2，2’-二磺酸二钠盐、4，4’-二叠氮茋-2，2’-二磺酸二钠盐、N-环己基-2-氨基乙磺酸、N-环己基-3-氨基丙烷磺酸、N-环己基-2-羟基-3-氨基丙烷磺酸、哌嗪-1，4-二(2-乙磺酸)和红菲绕啉磺酸。
10.权利要求7的方法，其中所述硝基化合物是选自如下一组的至少一种化合物2，4-二硝基苯酚、2，5-二硝基苯酚、2，6-二硝基苯酚、4，6-二硝基-2-甲基苯酚、2-氨基-4-硝基苯酚、2-氨基-5-硝基苯酚、2-氨基-4-硝基苯酚、对硝基苯酚、2，4-二硝基苯胺、对硝基苯胺、亚硝酸钠、亚硝酸钾、4-氨基-4’-硝基茋-2，2’-二磺酸二钠盐和硝基苯。
11.权利要求7的方法，其中所述蛋白酶是金属蛋白酶。
12.权利要求7的方法，其中所述氧化还原反应是通过确定由糖化蛋白降解产物的糖化部分与果糖基氨基酸氧化酶反应产生的过氧化氢的量而测定的。
13.权利要求12的方法，其中过氧化氢的量是通过使用一种氧化酶还原所产生的过氧化氢并氧化通过氧化而生色的底物，及测定底物生色程度而确定的。
14.权利要求13的方法，其中所述生色程度是通过测定在用于检测该底物的波长处的吸光度而测定的。
全文摘要
本发明涉及一种使用氧化还原反应分析样品中糖化蛋白的方法，其中可以获得高度可靠的测定值。将一种含有糖化蛋白的样品在存在磺酸化合物的情况下用蛋白酶进行处理，由此降解糖化蛋白。将所得的糖化蛋白降解产物的糖化部分与果糖基氨基酸氧化酶反应，测定这个氧化还原反应，从而确定糖化蛋白的量。可以使用十二烷基硫酸钠作为该磺酸化合物。
文档编号C12Q1/37GK1668760SQ0381702
公开日2005年9月14日 申请日期2003年4月28日 优先权日2002年7月17日
发明者米原聪, 石丸香, 平井香 申请人:爱科来株式会社