专利名称：蛋白类杀藻化合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种杀藻化合物，尤其是涉及一种蛋白类杀藻化合物及其制备方法。
背景技术：
赤潮的频繁发生在造成海洋生态系统巨大破坏的同时，也给各国经济带来巨大损失。由于物理和化学方法治理赤潮存在难以大面积施用及易造成二次污染等原因，利用生物相互之间的生态作用来治理赤潮已成为当前研究热点。近年来，围绕海洋细菌在赤潮生消过程中的作用，科学家做了大量关于菌藻关系的研究。研究表明，海洋细菌同赤潮藻类之间存在错综复杂关系一方面表现为互利共生， 细菌吸收藻类产生的有机物质，并为藻类的生长提供营养盐和必要的生长因子，从而调节藻类的生长；另一方面表现为特异性抑制甚至杀灭，细菌可以通过直接或间接的作用抑制藻类的生长，甚至裂解藻细胞，从而表现为杀藻效应。藻菌共培养的研究结果表明，杀藻细菌的作用方式可以归结为两种一是细菌同藻细胞直接接触、导致藻细胞死亡的直接杀藻作用；二是细菌不同藻细胞直接接触，而通过释放某种化学物质导致藻细胞死亡的间接杀藻作用。对于需要同目标藻直接接触才能表现杀藻作用的细菌，目前尚未见有关对其杀藻物质的研究报道，有可能是一些胞外酶如纤维素酶、蛋白酶、酯酶等，细菌通过释放胞外酶， 破坏藻细胞细胞壁、细胞膜，从而杀死藻细胞([1]杨小茹.海洋高效杀藻菌及其活性物质的研究[M],厦门厦门大学出版社，2008 ;[2]Su JQ, Yang XR, Zheng TL. Isolation and characterizationof a marine algicidal bacterium against a toxic algae. Harmful Algae,2007，6(6) :799-810)。对于不需要同目标藻直接接触而表现杀藻作用的细菌，目前所发现的杀藻细菌多数属于该类，其一般是通过分泌溶解性杀藻物质杀死藻细胞，这些胞外活性物质包括胞外酶、表面活性剂、抗生素等([3]苏建强.海洋高效杀藻菌及其活性物质的研究[M].厦门 厦门大学出版社，2006)。如 Lee 等([4]Lee, S. 0. ，Kato, J. ，Takiguchi，N. ，Kuroda, A. ， Ikeda, T.， Mitsutani, A. , Ohtake, H. Involvement of an extracellular protease in algicidal activity of the marine bacteriumPseudoalteromonas sp. strain A28[J]. Applied and Environmental Microbiology,2000,66 (10) :4334-4339)从 PseudoalteromonasA25 菌株培养滤液中分离到一种能杀死骨条藻(Skeletonemacostatum)的胞外蛋白酶，该蛋白水解酶为单体蛋白，分子量约为50kD，N末端的氨基酸序列经测定为 Ala-Thr-Pro-Asn-Asp-Pro ；Amaro等分离到的杀藻细菌的培养液表现出多种胞外酶活性和杀藻活性，表明其可能是通过胞外酶来杀死藻细胞。随着对海洋认识的提高，现代生物技术的飞速发展，研究中深度与广度的结合，使得近年来海洋活性蛋白多肽的实际应用体系得到良好建构与改进。由于来源丰富、结构新颖、活性独特，因此逐步实现了海洋蛋白在工业养殖业、医药卫生、环境保护等领域中的应
至今为止，大多数筛选到的杀藻细菌是通过分泌特异的具有杀藻活性的物质来起杀藻作用的。已经报道的杀藻活性物质包括色素、多肽、氨基酸、抗生素、含氮化合物等其他尚未定性的杀藻化合物。通过筛选高效、专一、能够生物降解的杀藻活性物质成为开发杀藻剂用于赤潮治理的一个新思路。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛋白类杀藻化合物及其制备方法。所述蛋白类杀藻化合物是从一株海洋细菌假单胞交替菌DHQ25(Pseudoalteromonassp. DHQ25)分离获得，所述假单胞交替菌 DHQ25 (Pseudoalteromonas sp. DHQ25)已于2010年8月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :M2010210，中国典型培养物保藏中心的地址为中国武汉武汉大学。所述假单胞交替菌DHQ25是由来自长江口海水样品中筛选得到。所述蛋白类杀藻化合物的制备方法包括以下步骤1)将假单胞交替菌DHQ25活化后，接种于液体培养基中培养，将培养液离心，取上清过滤后，进行无菌检验，得到假单胞交替菌DHQ25的无菌培养滤液，再进行超滤处理，收集超滤液；在步骤1)中，所述液体培养基可采用2216E液体培养基；所述培养的条件可为25°C ISOrpm培养24h ；所述培养液离心，可采用SOOOg离心IOmin ；所述过滤，可采用 0. 22 μ m微孔滤膜过滤；所述无菌培养滤液的pH值可为8. 1 8. 4。2)超滤后上清液经分离纯化，收集其中的8个组分，各组分冻干成粉，分别对各组分进行杀藻活性检测，取具有杀藻活性的3个组分，记为P5、P6和P7，检测各组分中的蛋白条带数，其中P7经SDS-PAGE检测，显示出一条带，再将P7的冻干粉重溶，透析除盐，进HPLC 重新分离纯化；在步骤2)中，所述分离纯化，可采用Varian C18-HPLC分离纯化，以20mmol L_1pH 8. OTris-HCl为洗脱剂；所述对各组分进行杀藻活性检测，可以20mmol I^pH 8. OTris-HCl 为空白对照；所述P7的冻干粉重溶，可以20mmol I^pH 8. OTris-HCl为溶解液，所述透析除盐，可用 20mmol L_1pH 8. OTris-HCl 为透析液。3)P7再进行分离纯化，共分离出两个峰，记为P71和P72，冻干处理，重新溶解，透析除盐，进行杀藻检测，其中P71具有杀藻活性，经SDS-PAGE还原和非还原处理后都显示是 P71 一条带，P71经原位PAGE鉴定是单条带的纯蛋白；在步骤3)中，所述分离纯化，可采用Agilent C18-HPLC分离纯化，以20mmol L^pH 8. OTris-HCl为洗脱剂；所述重新溶解，可用20mmol L、H 8. OTris-HCl重新溶解，控制浓度10mg/L ；所述透析除盐，可用20mmol I^pH 8. OTris-HCl为透析液；所述杀藻检测， 可以ZOmm0Ir1PH 8. OTris-HCl为空白对照；所述蛋白是一个的单链蛋白，分子量大小为 14. 5kD，说明P71里不存在同分异构体，其所在的峰是一个纯峰。4)P71经ESI-MS/MS鉴定分析，得知分子式为C61tlH971N2tl9O181 S2，其氨基酸序列如下
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MetAlaSerGlnLysArgProSerGlnArgHisGlySerLysTyrLeu
151015
AlaThrAlaSerThrMetAspHisAlaArgHisGlyPheLeuProArg
202530
HisArgAspThrGlylieLeuAspSerlieGlyArgPhePheSerGly
354045
AspArgGlyAlaProLysArgGlySerGlyLysAspSerHisThrArg
505560
ThrThrHisTyrGlySerLeuProGlnLysSerGlnArgThrGlnAsp
65707580
GluAsnProValValHisPhePheLysAsnlieValThrProArgThr
859095
ProProProSerGlnGlyLysGlyArgGlyLeuSerLeuSerArgPhe
100105110
SerTrpGlyGlyArgAspSerArgSerGlySerProlieAlaArgArg
115120125
本发明应用活体荧光染色剂荧光素双醋1浚酯FDA对活体塔:玛亚历山大藻
行染色，进行杀藻活性试验，以杀藻效率为导向进行杀藻活性物质的提取纯化和制备。方法是塔玛亚历山大藻于三角瓶中培养至指数期，然后分装到12孔细胞培养板中，每孔分装 4mL均勻藻细胞悬液，适应生长1 2d，进行杀藻活性试验。根据以下公式计算杀藻效率 杀藻率(％ ) = (Nc-Nt)/Ne X 100 (Ne表示加入2216E藻细胞培养基对照组的活藻细胞数， Nt表示加入无菌培养滤液对照组或不同处理方式无菌培养滤液实验组的活藻细胞数)。本发明通过超滤和反相高效液相两种手段从海洋细菌DHQ25中分离纯化得到一种蛋白类杀藻化合物，利用电喷雾质谱、ESI-MS/MS质谱等鉴定，经Mascot检索发现其一级结构与髓磷脂碱性蛋白(MBP)有最高的匹配度，这也是首次发现蛋白类化合物对塔玛亚历山大藻具有杀藻活性。本发明联合运用超滤体系和高效液相色谱分离体系(依次用Varian C18-HPLC高效液相和Agilent C18-HPLC高效液相)来进行制备。
图1为Varian C18-HPLC高效液相图。在图1中，A为液相谱图，横坐标为时间 (min)，纵坐标为OD值(280nm) (mAU)；各谱峰从左至右依次为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8 ； B为P7和超滤液的SDS-PAGE图，其中，“原”表示超滤液。图2为Agilent C18-HPLC高效液相图。在图2中，横坐标为时间(min)，纵坐标为 OD值O80nm) (mAU)；其中2个谱峰为P7再进行分离纯化所得，记为P71和P72。图3为P71SDS-PAGE电泳图谱。在图3中，M表示标准分子量，1表示还原处理后 P71，2表示非还原处理后P71。图4为P71的原位PAGE电泳图谱。在图4中，箭头指向为P71。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明。1)海洋细菌DHQ25活化后，接种于2216E液体培养基中，25°C 180rpm培养Mh，培养液8000g离心lOmin，上清经0. 22 μ m微孔滤膜过滤后，平板涂布进行无菌检验，可得到 DHQ25无菌培养滤液，其pH值为8. 1 8. 4。对该无菌培养滤液进行超滤处理，收集超滤液 4°C保存。所有操作均在4°C下进行。2)超滤后上清液经 Varian C18-HPLC 分离纯化(以 20mmol L^pH 8. OTris-HCl 为洗脱剂)，收集其中的8个组分(对应于图IA中的谱峰Pl，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8)，各组分冻干成粉，分别对各组分进行杀藻活性检测，发现P5、P6和P7有杀藻活性(以20mmol I^pH 8. OTris-HCl为空白对照)，其余各峰未检测到活性或活性较低。SDS-PAGE检测各峰中的蛋白条带数，P7显示出一条带(如图1B)，而原位PAGE表征后发现P7含有两个条带， P7的冻干粉重溶(以20mmol I^pH 8. OTris-HCl为溶解液)，透析除盐(用20mmol I^pH 8. OTris-HCl为透析液)，进HPLC重新分离纯化。3)P7 再经 Agilent C18-HPLC 进行分离纯化(以 20mmol L_1pH 8. OTris-HCl 为洗脱剂)，共分离出2个峰(参见图2)，收集这两个峰，冻干处理，并用20mmol L^pH 8. OTris-HCl重新溶解(控制浓度10mg/L)，透析除盐(用20mmol L^pH 8. OTris-HCl为透析液)，进行杀藻检测(共培养一天后检测，以20mmol L^1pH 8. OTris-HCl为空白对照)。 其中P71具有杀藻活性，经还原和非还原处理后都显示是P71 —条带(参见图幻，说明该蛋白是一个的单链蛋白，分子量大小为14. 5kD ；P71经原位PAGE鉴定是单条带的纯蛋白，说明 P71里不存在同分异构体，其所在的峰是一个纯峰(如图4)。4)P71 经 ESI--MS/MS鉴定分析，得知分子式为C61tlH971^19IO181S2:，氨基酸序列^
MetAlaSerGlnLysArgProSerGlnArgHisGlySerLysTyrLeu
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AlaThrAlaSerThrMetAspHisAlaArgHisGlyPheLeuProArg
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HisArgAspThrGlylieLeuAspSerlieGlyArgPhePheSerGly
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ProProProSerGlnGlyLysGlyArgGlyLeuSerLeuSerArgPhe
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SerTrpGlyGlyArgAspSerArgSerGlySerProlieAlaArgArg
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以下给出具体实施例。
1.菌种、藻种
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菌种DHQ25来源于厦门大学资源与环境微生物研究所于2003年赤潮973项目 MC2003-2航次从长江口及其毗邻海域海水样品中(包括表层、中层和底层)分离，是一株具有杀藻作用的弧菌。藻种Alexandrium tamarense (AT)无菌株，藻种购自暨南大学水生生物研究所， 经本申请人无菌藻技术除菌得到的塔玛亚历山大藻无菌株。藻类所用培养液为f/2培养液。藻类置于室内三角瓶中培养，温度为20士 1°C，光照条件为1 光照，1 黑暗。2.培养基培养基Q216E)蛋白胨(P印tone) 5g，酵母提取物WeastExtract) lg，磷酸高铁 0. Ig,琼脂粉IOg (固体培养基)，pH7. 6 7. 8，陈海水定容到1L。实施例1 荧光素双醋酸酯FDA的藻细胞染色与杀藻效率计算将荧光素双醋酸酯FDA溶于丙酮中，配成浓度为5mg/mL的溶液，置于4°C冰箱中避光保存。染色时，取200yL样品(不同处理均勻藻细胞培养液)于1.5mL离心管中；加入荧光素双醋酸酯FDA 4 μ L，使其终浓度为100 μ g/mL，室温静置染色5min后，放入冰盒避光待镜检；染色样品混勻后，取20 μ L于藻细胞计数板，用荧光显微镜在蓝光激发光下G95nm) 和可见光下分别进行观察计数，发出亮绿色荧光的细胞为活细胞，计数3次，取平均值。根据以下公式计算杀藻效率杀藻率(％) = (Nc-Nt)/NeX 100其中Nc表示加入2216E对照组的活藻细胞数，Nt表示加无菌培养滤液对照组或不同处理方式无菌培养滤液实验组的活藻细胞数。实施例2 蛋白类活性物质杀藻谱的研究P71杀藻谱(参见表1)表现出一定的特质(共培养一天后检测，以20mmol L^pH 8. OTris-HCl为空白对照)，它在Dinoflagellata和Bacillariophyta中起作用较大，而在另外两个属中，则没有检测到杀藻活性。表1P71杀藻谱
藻种名称无菌处理P71杀藻率(％)盐生杜氏藻无菌—微小原甲藻无菌—自养小球藻无菌—海洋卡盾藻无菌—青岛大扁藻无菌26.8±11.5小球藻无菌—威氏海链藻无菌—东海原甲藻无菌10.4±9.5热带骨条藻无菌—中肋骨条藻无菌—链状亚历山大藻无菌14.9±12.6微小亚历山大藻无菌24.8±10.3三角褐指藻无菌43.8±6.3塔玛亚历山大藻无菌36.3±4.0塔玛亚历山大藻02有菌30.4±7.2球形棕囊藻无菌—叉鞭金藻无菌—球等鞭金藻无菌—实施例3 活性蛋白浓度依赖性分析当P71稀释2倍时，活性迅速降至5 %，基本无活性，这个数据显示该蛋白的活性具有明显的浓度依赖性特性(共培养一天后检测，以20mmol IZ1pH 8. OTris-HCl为空白对照)。表2浓度依赖性分析
浓度梯度(xl2uM)杀藻率(％)2°46Γ1—Γ2—2"3—2"4—以下给出假单胞交替菌DHQ25的筛选方法1)将从长江口海域海水样品中(包括表层、中层和底层)分离获得的13株能够杀灭有毒赤潮藻Alexandrium tamarense的细菌作为出发菌株，培养14 18h到稳定期， 离心获得培养上清液；采用的培养基0216E)的配方为蛋白胨(Peptone) 5g，酵母提取物 (Yeast Extract) lg，磷酸高铁0. Ig,琼脂粉IOg (固体培养基)，pH7. 6-7. 8，陈海水定容到1L。2)取步骤1)所得的部分培养上清液孵化后进行杀藻活性检测，得到6株具有杀藻活性的细菌，分别记为HH2、DHY3、DHYl 1、DHY20、DHY36、DHQ^ ；所述孵化的条件为在100 110°C 下孵化 30 40min。进行杀藻活性检测的藻株Alexandrium tamarense (AT)购自暨南大学水生生物研究所，经本申请人无菌藻技术除菌得到的塔玛亚历山大藻无菌株(参见中国专利 CN1887353)。藻类所用培养液为f/2培养液。藻类置于室内三角瓶中培养，温度为20士 1°C， 光照条件为1 !光照，12h黑暗。3)取步骤1)所得的另一部分培养上清液经超滤，取超滤后的上清液进行杀藻活性检测，得到6株具有杀藻活性的细菌，分别记为HH5、DHY3、DHY^、DHQ5、DHQ19、DHQ25 ；所述超滤采用超滤离心管5000g下超滤离心1.证，所述超滤离心管选用3kD超滤离心管(参见表3)。4)挑选出具有杀藻活性的细菌DHQ25，即为假单胞交替菌 DHQ25(Pseudoalteromonassp. DHQ25)。DHQ25在超滤处理后保留了杀藻活性，在100°C高温处理后失去了杀藻活性，而超滤液在蛋白质特征反应(茚三酮试剂反应)中呈阳性特性，显示是蛋白/多肽/氨基酸类物质，表明DHQ25是一株能产胞外杀藻活性蛋白的海洋细菌。表 权利要求
1.蛋白类杀藻化合物，其特征在于是从假单胞交替菌DHQ25(Pseud0alter0m0nasSp. DHQ25)分离获得，所述假单胞交替菌DHQ25(Pseudoalteromonas sp. DHQ25)已于2010年8 月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :M2010210。
2.如权利要求1所述的蛋白类杀藻化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)将假单胞交替菌DHQ25活化后，接种于液体培养基中培养，将培养液离心，取上清过滤后，进行无菌检验，得到假单胞交替菌DHQ25的无菌培养滤液，再进行超滤处理，收集超滤液；2)超滤后上清液经分离纯化，收集其中的8个组分，各组分冻干成粉，分别对各组分进行杀藻活性检测，取具有杀藻活性的3个组分，记为P5、P6和P7，检测各组分中的蛋白条带数，其中P7经SDS-PAGE检测，显示出一条带，再将P7的冻干粉重溶，透析除盐，进HPLC重新分离纯化；3)P7再进行分离纯化，共分离出两个峰，记为P71和P72，冻干处理，重新溶解，透析除盐，进行杀藻检测，其中P71具有杀藻活性，经SDS-PAGE还原和非还原处理后都显示是P71 一条带，P71经原位PAGE鉴定是单条带的纯蛋白；4)P71经ESI-MS/MS鉴定分析，得知分子式为C61tlH971^19O181S2，其氨基酸序列如下 Met Ala Ser Gln Lys Arg Pro Ser Gln Arg His Gly Ser Lys Tyr Leu 151015Ala Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg His Gly Phe Leu Pro Arg202530His Arg Asp Thr Gly lie Leu Asp Ser lie Gly Arg Phe Phe Ser Gly354045Asp Arg Gly Ala Pro Lys Arg Gly Ser Gly Lys Asp Ser His Thr Arg505560Thr Thr His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser Gln Arg Thr Gln Asp 65707580Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn lie Val Thr Pro Arg Thr859095Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly Arg Gly Leu Ser Leu Ser Arg Phe100105110Ser Trp Gly Gly Arg Asp Ser Arg Ser Gly Ser Pro lie Ala Arg Arg 115120125。
3.如权利要求2所述的蛋白类杀藻化合物的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述液体培养基采用2216E液体培养基。
4.如权利要求2所述的蛋白类杀藻化合物的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述培养的条件为25°C 180rpm培养Mh。
5.如权利要求2所述的蛋白类杀藻化合物的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述培养液离心，是采用8000g离心lOmin。
6.如权利要求2所述的蛋白类杀藻化合物的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述过滤，是采用0. 22 μ m微孔滤膜过滤；所述无菌培养滤液的PH值为8. 1 8. 4。
7.如权利要求2所述的蛋白类杀藻化合物的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述分离纯化，是采用Varian C18-HPLC分离纯化，以20mmol Γ1 ρΗ 8. OTris-HCl为洗脱剂；所述对各组分进行杀藻活性检测，是以20mmol Γ1 ρΗ 8. OTris-HCl为空白对照。
8.如权利要求2所述的蛋白类杀藻化合物的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述 Ρ7的冻干粉重溶，是以20mmol L—1 ρΗ 8. OTris-HCl为溶解液，所述透析除盐，是用20mmol L^pH 8. OTris-HCl 为透析液。
9.如权利要求2所述的蛋白类杀藻化合物的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述分离纯化，是采用Agilent C18-HPLC分离纯化，以20mmol厂1 pH 8. OTris-HCl为洗脱剂。
10.如权利要求2所述的蛋白类杀藻化合物的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述重新溶解，用20mmol厂1 pH 8. OTris-HCl重新溶解，控制浓度10mg/L ；所述透析除盐，用 20mmol Γ1 ρΗ 8. OTris-HCl 为透析液；所述杀藻检测，以 20mmol Γ1 ρΗ 8. OTris-HCl 为空白对照；所述蛋白是一个的单链蛋白，分子量大小为14. 5kD。
全文摘要
蛋白类杀藻化合物及其制备方法，涉及一种杀藻化合物。所述化合物从假单胞交替菌DHQ25分离获得。将DHQ25活化后培养离心，取上清过滤后无菌检验得DHQ25的无菌培养滤液，收集超滤液；超滤后上清液经分离纯化，收集其中的8个组分，各组分冻干成粉，杀藻活性检测，取具有杀藻活性的3个组分P5、P6和P7，检测蛋白条带数，P7显示出一条带，再将P7的冻干粉处理，共分离出两个峰，记为P71和P72，再处理后杀藻检测，P71具有杀藻活性，经处理后显示P71一条带，经原位PAGE鉴定是单条带的纯蛋白；P71经ESI-MS/MS鉴定分析，得知分子式为C610H971N209O181S2。
文档编号C07K14/21GK102167732SQ20101058288
公开日2011年8月31日 申请日期2010年12月10日 优先权日2010年12月10日
发明者吕静琳, 王宾香, 郑天凌 申请人:厦门大学