专利名称：一种快速检测小麦籽粒中黄色素含量的方法
一种快速检测小麦籽粒中黄色素含量的方法技术领域
本发明属于小麦品质检测技术领域，具体涉及一种快速检测小麦籽粒中黄色素含量的方法。
背景技术：
小麦籽粒黄色素含量对面条、馒头等食品的外观品质有着重要影响。日本和东南亚国家消费的黄碱面条要求亮黄色，高黄色素含量的面粉有利于提高其外观品质，然而，中国的小麦制品(如面条、馒头等)要求较高白度，需要亮度好、黄色素含量低的面粉，因此，选育高、低黄色素含量的小麦新品种是小麦品质育种的重要目标。
许多研究表明小麦籽粒黄色素含量与面粉、面团黄度的相关系数高达0.8^0.9，与面包和面条颜色的相关系数分别为0.69和0.76。品种间黄色素含量可相差3 4倍，选择潜力较大。虽然环境对黄色素含量有一定影响，但基因型是影响黄色素含量的主要因素，Parker等对150个SSD系分析表明，黄色素含量的遗传力为0.67(Parker G D, Chalmers KJ, Rathjen A J, Langridge P.Mapping loci associated with flour color in wheat.Theor Appl Genet, 1998，97(1-2): 238 - 245);在硬粒小麦中黄色素含量的遗传力更高，Clarke 等研究显示其遗传力为 0.88 0.%(Clarke F R, Clarke J M, McCaig T N, Knox RE, DePauw R M.1nheritance of yellow pigment concentration in seven durum wheatcrosses.Canadian Journal of Plant Science, 2006, 86(1): 133—141.
随着分子生物学和生物信息学技术的快速发展，人们对小麦中控制黄色素含量的基因及功能性标记的研究也更加深入。研究表明，普通小麦中控制黄色素含量的主效QTL 位于 7A 和 7B 染色体上(Parker G D, Chalmers K J, Rathjen A J, Langridge P.Mapping loci associated with flour color in wheat.Theor Appl Genet, 1998,97(1-2): 238 - 245)。He等克隆了普通小麦7A染色体上Psyl (八氢番茄红素合酶，phytoene synthase, Psy)基因Psy-Al的全长序列，并开发了相应的共显性标记YP7A和YP7A-2 ;鉴定并克隆了 7B染色体Psy-BI位点的等位变异，并开发了功能标记YP7B-1、YP7B-2、YP7B-3和YP7B-4。He等开发的功能标记YP7A能有效地区分小麦7A染色体上控制高、低黄色素含量的等位基因Psy-Ala和Psy-Alb (He X Y, He Z H, Ma ff, Appels R,Xia X C.Allelic variants of phytoene synthase I (Psyl) genes in Chinese andCIMMYT wheat cultivars and development of functional markers for flour colour.Mol Breed, 2009，23(4): 553 - 563)，为准确区分高、低黄色素含量的小麦品种(系)及其分布规律提供了可能，但是此法对于大批量的田间育种材料筛选检测来说成本仍较高，同时也要求操作人员具备高水平的分子生物学技术，距离实现高通量检测仍有一定距离。普通的化学检测需要破碎样品，使用的化学试剂正丁醇有特殊怪异的酒气味，不适合大量检测，长时间操作对工作人员呼吸道有一定损害，并且速度也较慢。同时，上述两种方法所使用的化学试剂容易对环境造 成污染。
近红外光谱分析技术的快速发展给大批量育种材料的快速检测带来了可能，近红外光谱分析技术具有分析简便、快速、高效、低成本、无污染及样品的非破坏性和多组分同时测定等优点。它是利用有机物中含有的各种含氢基团(CH、OH、NH、SH等)的倍频与合频谱带在近红外光谱区的特征振动吸收信息，从而快速测定样品中多种化学成分的含量。近红外光谱分析方法在测定小麦中水分含量、蛋白质含量、籽粒硬度、吸水率、湿面筋含量、面团形成时间和面团稳定时间等方面已有研究，但用于小麦籽粒黄色素含量快速检测研究在国内外还未见报道。发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测小麦籽粒中黄色素含量的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案: 一种快速检测小麦籽粒中黄色素含量的方法，包括以下步骤: (1)采集每个样品的近红外光谱数据，并测定其黄色素含量； (2)对光谱数据进行预处理:将光谱数据与化学值一一对应，导入分析软件，应用分析软件采用一阶导数法和标准正态变量转换法对近红外光谱数据进行预处理； (3)建立模型:采用偏最小二乘法和多元线性回归算法对黄色素含量和预处理后的光谱数据进行计算并建立模型； (4)应用模型:将建立好的定标模型导入近红外光谱分析仪模型库中，即可对小麦籽粒黄色素含量进行快速测量。
上述方法中，在步骤(I)之前对样品进行前处理，除去样品中的石头、土块等杂物，自然风干，水分含量控制在12% —13%。
上述方法中，步骤(I)中所述近红外光谱数据为每个样品重复扫描2-100次的平均光谱数据；所述黄色素含量的测定方法为分光光度法。
较好的，步骤(I)中的近红外光谱数据为每个样品重复扫描4次的平均光谱数据；所述分光光度法为紫外-可见分光光度法。
上述方法中，在扫描近红外光谱时，样品杯直径为50—140mm,深度为10—25mm,分辨率为I一5nm，扫描范围950— 1650nm，温度为22— 25°C;用紫外-可见分光光度法测量黄色素含量的方法包括以下步骤:从每个样品中随机取样部分小麦籽粒，用旋风磨把小麦籽粒磨成全麦粉，每Ig的全麦粉用5ml的水饱和正丁醇进行萃取，将萃取液转入2 — IOml的离心管中，在4000— 5000 r/min的离心速率下，离心8 —10 min，得上清液，然后以水饱和正丁醇溶液为空白对照，在436.5nm波长下测定上清液的吸光度并计算黄色素的含量；其中所述全麦粉的制粉筛网直径为0.5—0.8_，所述全麦粉用量为3.0—6.0g，萃取时间为lh，所用比色皿为光路长1.0cm，1.4一3.5ml的半微量紫外石英比色皿。黄色素含量的计算公式为: 黄色素含量(mg/kg)=吸光度*30.1 较好的，所述样品杯直径75mm，深度25mm，所述分辨率为2nm，温度为25°C;所述全麦粉的制粉筛网直径为0.5mm ;全麦粉用量为3.0g ;离心管体积为2ml ;离心速率4000 r/min ；离心时间IOmin ;所用比色皿容量为1.4ml。
上述方法步骤(2)中利用软件The Unscrambler 9.7进行一阶导数处理时选取光滑点数2— 4个。
上述方法步骤(3)中进行线性回归分析时方法选取PLS1，X变量设定为光谱数据，Y变量设定为黄色素含量，经主成分分析法分析，选用自动选择最优主成分个数，并经交叉验证处理。根据主成分分析结果，挑出异常值，再对回归模型进行优化处理，得出可用的模型。
上述方法步骤(4)中应用模型时，先通过预测值对曲线截距和斜率值进行调整，达到与化学值误差最小，并通过线性回归对预测值和化学值进行相关性分析，再将该模型融入到原有其他参数模型中，达到一次扫描分析，可以在得到原有其他参数结果的同时也得到黄色素的含量。所述原有其他模型为原有的测量水分含量、蛋白质含量、籽粒硬度等的模型。
本发明前处理方法简单，能较好的降低对近红外光谱采集的干扰。
本发明采用一阶导数法和标准正态变量转换法对近红外光谱数据进行预处理可提取近红外光谱的特征信息，消除各种噪声和干扰，降低样品表面不均匀和色差等因子影响，提闻1旲型预测的精度和稳定性。
本发明方法操作简单、快速、高效、低成本、无污染，对样品无破坏性，不影响样品的后续使用，适合实验室和生产一线使用，并且可以和多组分同时测定，为小麦育种提供了一种快速筛选高、低黄色素含量小麦品种的新方法。
图1为样品的近红外光谱采集数据； 图2为模型优化后定标集原始值与预测值的拟合图； 图3为样品预测值与原始值相关性图谱。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1 挑选南淮麦区南部的具有广泛代表性一批不同小麦品种的籽粒作为定标集样品，本试验选取不同类型的自育高代品系材料70份。样品名称如表I (表I中为挑出异常值后的样品)。
1、样品前处理:挑出小麦籽粒样品中的石子、土块和杂草等杂质，自然风干，水分含量控制在12 13%。从每个样品中随机取样20g采用旋风磨将小麦籽粒磨成全麦粉(所用制粉筛网直径为0.5_)，用于黄色素含量化学值检测，剩余部分小麦籽粒用于近红外光谱数据采集。
2、样品黄色素含量化学值检测:称取3.0OOg样品全麦粉放入50ml带盖的塑料瓶子内，加入15.0ml水饱和正丁醇溶液，盖紧盖子，放在混旋器上混合，使样品充分湿润，把塑料瓶放在往复震荡器上震荡lh，静置lOmin，将上部分萃取液倒入2ml塑料离心管内，在4000r/min的离心机上离心lOmin，将离心后的上清液倒入1.4ml半微量紫外石英比色皿中，比色皿光程长1.0cm,以水饱和正丁醇溶液为空白对照，用紫外-可见分光光度计在436.5nm下测定上清液的吸光度A，计算黄色素含量，公式为: 黄色素含量(mg/kg)=吸光度*30.1 3、样品近红外光谱采集:用DA7200近红外光谱分析仪采集样品的近红外光谱，将样品置于光谱仪上的旋转样品杯(直径75mm，深度25mm)中，设定采集光谱分辨率为2nm，光谱扫描范围为950— 1650nm,室温25°C，每个样品重复扫描4次，求平均光谱，存入计算机待用。样品的近红外光谱采集数据如图1所示。
4、对光谱数据进行预处理并建立模型:将光谱数据和黄色素含量一一对应导入应用软件The Unscrambler 9.7，在软件中先后利用一阶导数法和标准正态变量转换法对光谱数据进行优化处理，其中在进行一阶导数处理时选取光滑点数3个对光谱数据优化，接着采用偏最小二乘法计算和多元线性回归算法对黄色素含量和光谱数据同时进行处理并建立模型，在回归分析时方法选取PLS1，X变量设定为光谱数据，Y变量设定为黄色素含量化学值，经主成分分析法分析，选用自动选择最优主成分个数，对样品进行了挑选，并经交叉验证处理。根据主成分分析结果，挑出异常值(本试验挑出10个异常值)，再对回归模型进行优化处理，优化后样品的原始值决定系数为0.995，预测值决定系数为0.892，如图2所示为模型优化后样品原始值I与预测值2的拟合图，表示该模型决定系数较高，标准偏差均较小，可以应用，保存该定标模型备用。
5、定标模型验证:将样品随机排列,在The Unscrambler 9.7软件中调用该模型，对样品再进行预测，得到籽粒黄色素含量预测数据，将预测数据与原始值进行相关分析，结果表明预测数据与原始值呈正相关，线性关系如图3所示，决定系数为0.9958，预测数据与原始值差值绝对值小于0.1，预测效果较理想，可以进行该模型应用。
6、定标模型应用:将建立的定标模型导入到DA7200型近红外光谱仪模型库中，与原有的水分含量、蛋白质含量、籽粒硬度等模型合并到一起，即可对小麦籽粒样品进行测试分析。这样，通过一次扫描分析，可以在得到蛋白质含量等多个原有参数结果的同时，也可以得到籽粒黄色素含量的结果，实现简便、快速、高效、高通量、低成本、无污染、不破坏样品和多组分同时测定的目的，达到对小麦育种早期世代的大批量育种材料快速检测筛选的要求。
表1:挑出异常值后用于定标集的60个品种代号及黄色素含量值
权利要求
1.一种快速检测小麦籽粒中黄色素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)采集样品的近红外光谱数据，测定样品的黄色素含量； (2)对光谱数据进行预处理:采用一阶导数法和标准正态变量转换法对近红外光谱数据进行预处理； (3)建立模型:采用偏最小二乘法和多元线性回归算法对黄色素含量和预处理后的光谱数据进行计算并建立模型； (4)应用模型:将建立好的定标模型导入近红外光谱分析仪模型库中，即可对小麦籽粒黄色素含量进行快速测量。
2.如权利要求1所述一种快速检测小麦籽粒中黄色素含量的方法，其特征在于，步骤(2)中利用软件TheUnscrambler 9.7进行一阶导数处理时选取光滑点数2— 4个。
3.如权利要求1所述一种快速检测小麦籽粒中黄色素含量的方法，其特征在于，步骤(3)中进行线性回归分析时方法选取PLS1，X变量设定为光谱数据，Y变量设定为黄色素含量，经主成分分析法分析，选用自动选择最优主成分个数，并经交叉验证处理。
4.如权利要求1所述一种快速检测小麦籽粒中黄色素含量的方法，其特征在于，步骤(4)中应用模型时，先通过预测值对曲线截距和斜率值进行调整，达到与化学值误差最小，再将该模型融入到原有其他参数模型中，所述原有其他模型为原有的测量小麦籽粒水分含量、蛋白质含量、籽粒硬度的模型。
5.如权利要求1所述一种快速检测小麦籽粒中黄色素含量的方法，其特征在于，在步骤(I)之前，除去样品中的杂物，水分含量控制在12% —13%。
6.如权利要求1所述一种快速检测小麦籽粒中黄色素含量的方法，其特征在于，步骤(O中所述近红外光谱数据为每个样品重复扫描2-100次的平均光谱数据；所述黄色素含量的测定方法为分光光度法。
7.如权利要求6所述一种快速检测小麦籽粒中黄色素含量的方法，其特征在于，所述近红外光谱数据为每个样品重复扫描4次的平均光谱数据；所述分光光度法为紫外-可见分光光度法。
8.如权利要求7所述一种快速检测小麦籽粒中黄色素含量的方法，其特征在于，在扫描近红外光谱时，样品杯直径为50— 140mm，深度为10 — 25mm，分辨率为I一5nm，扫描范围950—1650nm,温度为22—25°C;所述紫外-可见分光光度法测量黄色素含量的方法包括以下步骤:每Ig的全麦粉用5ml的水饱和正丁醇进行萃取，将萃取液转入2 — IOml的离心管中，在4000— 5000 r/min的离心速率下，离心8 —10 min，得上清液，然后以水饱和正丁醇溶液为空白对照，在436.5nm波长下测定上清液的吸光度并计算黄色素的含量；其中所述全麦粉的制粉筛网直径为0.5一0.8mm,所述全麦粉用量为3.0一6.0g,萃取时间为Ih,所用比色皿为光路长1.0cm, 1.4—3.5ml的半微量紫外石英比色皿。
9.如权利要求8所述一种快速检测小麦籽粒中黄色素含量的方法，其特征在于，所述样品杯直径75mm，深度25mm，所述分辨率为2nm，温度为25°C ;所述全麦粉的制粉筛网直径为0.5mm,全麦粉用量为3.0g,离心管体积为2ml，离心速率4000 r/min,离心时间lOmin，所述比色皿容量为1.4ml。
10.如权利要求1一9任一所述一种快速检测小麦籽粒中黄色素含量的方法在检测小麦籽粒黄色素含量中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测小麦籽粒中黄色素含量的方法，该方法主要以化学定量检测为基础，利用近红外光谱分析仪和分析软件，对近红外光谱数据先后通过一阶导数和标准正态变量转换法进行预处理，采用偏最小二乘法和多元线性回归算法建立定标模型并进行优化处理，将优化的模型再植入到近红外光谱分析仪中，利用近红外光谱扫描实现快速预测小麦籽粒黄色素含量。该方法实现了对小麦育种早期世代大批量材料的简便、快速、高效、高通量、低成本、无污染、不破坏样品和多组分同时测定的目的，为小麦育种快速筛选高、低黄色素含量小麦新品种(系)提供了一种新方法。
文档编号G01N21/31GK103149174SQ20131008790
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月19日 优先权日2013年3月19日
发明者殷贵鸿, 高艳, 唐建卫, 韩玉林, 黄峰, 王丽娜, 于海飞, 杨光宇, 李新平 申请人:周口市农业科学院