麦白、麦迪霉素全部组分含量的测定方法

专利名称：麦白、麦迪霉素全部组分含量的测定方法
技术领域：
本发明涉及大环内酯类抗生素药品的麦白、麦迪霉素组分含量的测定方法。
麦迪霉素(Midecamycinum，Medimycin)的主要组分有麦迪霉素A1、A2、A3、A4及柱晶白霉素(Kifasamycin.Leucomycin)A6等，不同产品的各组分相对含量差别很大。日本麦迪霉素(麦迪霉素以下简称麦迪)中的A1高达80%以上，A6只占5%左右;国产品在88年前生产的麦迪中A1与A6含量差不多，A1还不到日本产品的一半，当然效价比日本产品低得多。为了提高质量，在89年版卫生部药品标准中(简称部标)规定将国产麦迪改为麦白霉素(以下简称麦白)，在出厂检验项目中增加A1的含量测定并要求该量不得少于40%，效价不得少于850μ/mg(按干燥品计算);将测量方法从原先施行的归一法改成外标法。1990年9月，卫生部又批准了A1不低于30%，效价不少于820μ/mg(折干)，期限为90年9月1日至91年9月1日的暂行标准。1991年6月全国第四次麦白交流会上，又提出了A1≥35%，效价≥850μ/mg(折干)，于92年3月1日执行的暂行修改标准。质量标准在短期内如此频繁地变动，说明我国对麦白的质量情况还缺乏应有的全面了解。
当前，检测麦白的A1含量与效价互不相关地进行着。麦白界长期认可的A1含量与效价呈正相关的看法已被否定。不少产品A1低于40%，而效价却在900μ/mg以上;另有一些产品A1高出40%，而效价却不到850μ/mg。原因在于麦白是多组分混合物，其效价不但与A1组分密切相关，而且也与其他组分有重要的关系。只有将全部组分都测定出来，才能了解它们各自与效价之间的内在联系。然而测定麦白全部组分含量的方法至今还没有，各组分与效价之间的关系更处在模糊之中。这就是不能正确制订麦白质量标准的关键所在。人们迫切希望在这二方面有所突破。
关于测定麦白、麦迪组分含量的方法通常有归一法、外标法与内标法三种(见《高压液相色谱法》、金恒亮编，原子能出版社1987年版)。
我国最早采用归一法测定麦白、麦迪组分。其原理是假定麦白、麦迪样品全部组分都在232nm出峰，则有关组分在HPLC面积归一化图谱上的相应峰面积Si及占总峰面积的比例ai由仪器打印出来。由于麦白、麦迪的主要组分结构十分相似，次要组分含量甚微，于是近似地认为仪器对各组分的灵敏度相同，这样，i组分的含量为Ci(归)＝Si/∑Si＝ai……①(i为在232nm波长处出峰的组分)这种方法简便、对称量、定容、进样量、仪器稳定性都没有严格要求，而且不需标准品。缺点是所测出的含量很不准确。因为麦白中不在232nm出峰的部分相当多，当这部分被忽略不计后，使Ci偏高不少。例如麦白标准品(341-8801)(以下简称标准品)的aA1约70%，实际CA1＝49.0%，误差极大。第三次全国麦迪交流会否定了这种方法而决定用外标法来测定A1含量。
外标法的原理在于样品溶液在HPLC图谱中，其各组分的含量Ci与它相应的峰面积Si成正比，与溶液的浓度(称量W/容积V)成反比。如配制溶液的量瓶容积相同则计算A1含量的公式是CA1(外)＝(WpVSA1/WVpSA1p)CA1P＝(WpSA1/WSA1p)×49.0%……②式中CA1p为标准品的A1含量，是已知值(例如49.0%)。
符号右下角的“p”表示标准品，不写的为样品。
上述符号的意思以下均相同，不再解释。
外标法测定麦白A1含量比归一法准确，在图谱上只要A1峰良好，即使其他峰形不良，也能进行正常测定。
外标法与部标规定的流动相与定容物相配合测定麦白、麦迪组分、缺点也非常突出①每次测定都要使用已知被测组分含量的标准品;
②HPLC图谱峰形不佳(附

图1和2，分别表示分离度较低和较高情况下的麦白图谱)(a)A1与它前面相邻的峰峰谷很高，分离度差;
(b)A1以外的峰常常裂分。
因此，用外标法可以测定A1含量而不能测定裂分组分的含量;而归一法则完全不能使用。
附图1的主要的测定条件全套SP8810HPLC仪;大连化学物理所生产的色谱柱(简称大连柱)，91050401、C18、10μm、200×4.0mm;以48%乙腈和52%0.1mol/l甲酸铵、PH＝6.0的溶液为流动相;100%甲醇定容;进样浓度1.0mg/ml、进样量10μl;λ＝232nm，AT＝32，Cs＝0.25cm/min，PT＝150;图1a为标准品图谱，1b为东北旺制药厂产品90-7-59图谱。
附图2主要条件流动相中乙腈为43%，0.1mol/l甲酸铵为57%;2a为标准品图谱，2b为东北旺制药厂产品90-10-4图谱;其余同附图1。
③外标法测定误差相当大。原因很多(a)公式②中标准品与样品中任何一方的称量、定容容积、组分峰的峰面积都会对含量的测定产生相当大的影响(正反比关系)。
(b)麦白、麦迪组分繁杂又非常相似。现有条件很难将A1组分与相邻组分完全分开。要达到药典规定的分离度，每次测定所需的时间在1小时以上，而且柱效要相当高。当前，许多单位都是在分离度非常不够的情况下进行着，柱效也不高。这样，电压、流动相、柱效、室温的细微变化就对分离度及测定值有较大的影响。即使是标准品本身，在同一天的测定中多次进样，其峰面积就有不小的改变。
(c)样品与标准品的A1峰及邻近峰总有差别。在分离度不足时，峰与峰的叠加度各不相同，从而导致误差。误差量随着峰形差别与分离度不足度的增减而增减。
(d)称量、样品转移、定容、进样等操作程序很多。除了产生系统误差外，还往往产生不小的偶然误差。
④为了减少测定误差，就要增加仪器的稳定时间，同时标准品和样品都需要多次进样，从而延长测定时间和增加流动相的用量。流动相由毒品甲酸铵与剧毒、昂贵、易挥发的乙腈配制。这就对工作人员的健康和环境造成不利的影响，又提高了测定成本。
(3)内标法测定组分含量不但要使用标准品而且要在样品中加入内标物，比外标法更麻烦。又因麦白组分几乎布满了整个图谱，内标物峰位难于按排，至今未曾见闻过有人进行了这种尝试。
关于测定麦白、麦迪组分含量的流动相与定容物组合方式，已见过的有三种
(1)乙-甲方式即部标方式“以甲酸铵液(0.1mol/l)-乙腈(100∶55)并用10%醋酸液调节、使PH值为5.9～6.1的溶液为流动相，样品用甲醇定容。”这种方式的缺点很多，前面已经说过。这儿不再赘述。
(2)甲-甲方式即以甲醇溶液作流动相，甲醇溶液定容。优点是不使用乙腈，毒性最小，试剂费用最低，但图谱峰形最差，连A1峰都常常裂分，测定准确度最差。
(3)乙-乙方式即以乙腈溶液作流动相，乙腈溶液定容。优点是峰形最好，测定最准确，但所耗乙腈最多，毒性与试剂费用最高。
关于组分含量的表达方式有三种(1)部标法用C(外)表示，这种方式没有去除样品中水份与杂质的影响，反映的是样品中组分含量的实际值，这个值随样品中水份与杂质量的变化而变化。
(2)如果用折干形式表示C(外)(折干)＝C(外)/1-水份……③可去除水份而不能去除杂质的影响，同时增加了水份测定的麻烦，并受其测定准确度的影响。
(3)如果用折纯形式表示C(外)(折纯)＝C(外)/(1-水分-杂质)……④既可去除水份又可去除杂质的影响，反映样品的本质含量。但它必须测定水份与杂质量并受这二者测定准确度的影响。
综上所述，测定麦白、麦迪组分含量的现有三种方法-归一法、外标法、内标法;
现有流动相与定容物的三种组合方式-乙-甲方式、甲-甲方式、乙-乙方式;
现有组分含量的三种表达方式-C(外)、C(外)(折干)、C(外)(折纯)都有重大的缺点。
本发明目的是提供一种既能测定麦白、麦迪的A1含量又能测定其他全部组分含量的准确、低毒、简易、快速而廉价的方法，同时寻找一种表达组分含量既准确又方便的理想方式。
以下结合附图，对本发明内容进行说明。
本发明采用分光光度计分别测定标准品和样品在280、232nm波长处的吸收度比值;采用高效液相色谱仪，以适当比例的甲醇-0.03mol/l醋酸铵液、用20%醋酸液调节PH值为6.0～6.8的溶液为流动相，50%乙腈水定容样品，以使麦白标准品的A1后、A2后能同时检测出来、A1组分的保留时间等于9±2分为度;分别测出标准品和样品在232、280nm处的面积归一化图谱，取得包括标准品A1组分在内的各组分峰面积占相应波长处总峰面积的百分数;进而用改进归一法计算出全部组分的含量。
实施本发明步骤如下步骤1以甲醇-0.03mol/l醋酸铵液、用20%醋酸液调节PH值为6.0～6.8的溶液为流动相。
在2ml量瓶中称入约2mg麦白或麦迪，用50%乙腈水大致定容。
流动相中甲醇、醋酸铵的具体比例及PH值可随不同的色谱柱和仪器酌情调整，以使标准品的A1后、A2后能同时检测出来、A1组分的保留时间RTA1等于9±2分为度。
采用全套SP8810HPLC色谱仪和大连化学物理所生产的色谱柱;以68±2%甲醇和32±2%的0.03mol/l醋酸铵溶液、并以20%醋酸液调节其PH值为6.6～6.8作为流动相;样品以50%乙腈水定容。
步骤2用无水乙醇将麦白标准品和样品制成约0.016mg/ml的溶液，分别用分光光度计测定其吸收度比值A280/A232。
步骤3利用步骤1配制的流动相、标准品和样品液，在HPLC仪上依次进样，每批一次，得到各标准品和样品在232nm波长处的面积归一化图谱。如附图3，它比附图1、2所示的部标法图谱要好得多。
附图3主要条件以68%甲醇和32%0.03mol/l醋酸铵，PH＝6.8的溶液为流动相;以50%乙腈水定容;AT＝32;进样浓度1.0mg/ml;3a为标准品，3b为苏州产品，其余同附图1。
3a的数据如下峰(i)面积%(ai)RT峰面积(Si)10.0973.58506620.2624.413650
30.4244.592208141.475.177665451.2935.9267425616.8476.6887827572.9137.72151834A1 8 αAlP=65.388 8.79 340872992.18110.04113695108.03512.41418861111.0918.0556821全部100.52130913b的数据如下:
峰(i)面积%(ai)RT峰面积(Si)10.0833.570220.1623.131116230.5083.673505040.7854.135412459.5475.16658215635.5316.71244975372.5397.77175055A1842.8068.89295136497.26112.52500633100.77918.0553714全部100.6894772步骤4上步完成后，调正仪器参数，依次进样，得到各标准品和样品分别在280nm波长处的面积归一化图谱如4a、4b。通常每批进样一次。该步可以改日另测，流动相和样品液也可以另配。
附图4主要条件测样品时AT＝4，测标准品时AT＝16，λ＝280nm，4a为标准品，4b为苏州产品，其余同附图3。
4a数据如下峰(i)面积%(bi)RT峰面积(Si)10.0942.57171820.0984.26179130.4085.45745040.9275.961693354.5156.8982483619.1367.96349614710.6289.62194176A4859.99410.47109610391.37413.8325107102.82615.2151635全部100.18270104b数据如下:
峰(i)面积%(bi)RT峰面积(Si)10.1482.56149623.2654.493294132.8825.332908749.8015.869887859.9556.82100440632.1737.85324592710.2449.03103351A4831.5310.37318105全部100.1008890步骤5用改进归一法计算麦白、麦迪中全部组分的含量(1)原理、公式推导
根据麦白、麦迪组分对紫外光的吸收性可以一分为三第一部分以A1、A6为主，在232nm处出峰(附图1～3)，而在280nm处不出峰;第二部分以A3、A4为主则正好相反(附图4);第三部分是水份和杂质，它们在这二个波长处都不出峰。如用C表示组分含量则C232+C280+水份+杂质＝100%＝1.00……⑤将样品配制成适当浓度M的乙醇溶液，根据朗伯比尔定律，对于一束穿过它的单色光，溶液的吸收度A与它的浓度和光路长度L的乘积成正比于是A232＝E232M232L……⑥A280＝E280M280L……⑦其中A、E、M分别表示样品溶液对相应波长光线的吸收度、吸收系数、有吸收的各组分浓度之和(g/ml)。E是个常数，与麦白、麦迪的批号和浓度无关，但与光的波长和温度有关。
根据麦白标准品和样品在232nm处的面积归一化图谱，从上述3个公式及归一化原理可知Ci(改)＝ ((1－水份－杂质)×49.0%×(A280/A232)×ai)/((1－水份－杂质)P(aAlP-49.0％)(A280／A232)P＋49.0%(A280／A232)P)(i为在232nm处出峰的组分)Ci(改)中的“改”表示用改进归一法测定，以下“改”字省略，用分光光度计经多次准确测定得(A280/A232)p＝0.363麦白标准品经特别提纯干燥，(水份)P＝0，(杂质)P＝0，于是Ci＝ (0.17787(1-水份－杂质))/(0.17787+(aAlP-0.49)(A280/A232)) ai……⑨由于Ci＝aiC232……⑩(i为在232nm处出峰的组分)则C232＝ (0.17787(1-水份－杂质))/(0.17787+(aAlP-0.49)(A280/A232)) ……(11)
C280((1－水份－杂质)(aAlP-0.49)(A280/A232))/(0.17787+(aAlP-0.49)(A280／A232)) ……(12)如果标准品和样品在280nm处出峰的各组分归一化百分数用bi表示，则Ci=biC280((1－水份－杂质)(aAlP-0.49)(A280/A232))/(0.17787+(aAlP-0.49)(A280／A232)) bi(i为在280nm处出峰的组分)(2)组分含量的几种表达方式上述带有水份项的公式，俗称“湿”的形式。相应的组分含量用Ci(湿)、C232(湿)、C280(湿)等表示，其中，Ci(湿)与外标法测定值相当。
对A1组分，CA1(湿)＝CA1(外)……(14)如将组分按折干、折纯处理，相应的组分含量用Ci(折干)、C232(折干)、C232(折纯)、C280(折纯)等表示。
C232(折干)＝C232(湿)/1-水份……(15)C280(折干)＝C280(湿)/1-水份……(16)Ci(折干)＝Ci(湿)/1-水份……(17)
(i为在280nm处出峰的组分)
C232(折纯)= (C232(湿))/(1－水份－杂质) = 0.17787/( 0.17787+(aAlP-0.49)A280/A232) ……(20)C280(折纯)＝ (C280(湿) (aAlP-0.49)(A280/A232))/(1-水份－杂质 0.17787＋(aAlP-0.49)A280/A232) ……(21)＝1-C232(折纯)……(22)Ci(折纯)＝ (Ci(湿))/(1－水份－杂质) ……(23)
(i为在280nm处出峰的组分)(3)测定各组分含量中的近似处理①麦白、麦迪中的杂质主要有洗涤时残留的无机物、去离子水中的微小树脂颗粒及尘土等，可由炽灼残渣值来衡量。据估算杂质≌2炽灼残渣值②对合格的麦白、麦迪产品，又不知道水份与杂质量的确切值，则可认为1-水份-杂质≌0.985＝98.5%
也可根据不同的具体情况取值。
(4)对公式的简单分析由于ai、bi、aA1p、A280/A232与标准品和样品的称量、定容、样品转移、进样量都没有关系，随仪器稳定性、分离度与室温的变化也比较小，从而①公式(24)、(25)表明既可以不经严格的称量、定容、控制进样量，又可不经水份与杂质的测定，直接得到各组分的折纯含量。Ci(折纯)表示样品中组分的本质含量，它与水份和杂质量无关，使用起来既准确又简便，是表达麦白、麦迪组分含量的最佳方式;同时也为进一步用折纯效价科学地表达其理论效价准备了条件。
②麦白、麦迪的A280/A232多数在0.20以下，至今已知的最大值为0.363。于是(aA1p-0.49)A280/A232比0.17787小得多。标准品对各组分含量的影响主要来自aA1p。aA1p本身变化不大。所以，标准品对各组分含量测定值的影响比外标法中标准品的相应影响要小得多。甚至于可以在一定的条件下，用aA1p代替当日aA1p进行测定，误差并不大。
水份与炽灼残渣是部标规定本来要测的，本法取其数值，不再另测。水份、残渣的测定，因取样量大，比较准确，而且多数情况下，水份+杂质＜＜1，即使有点误差，无关大局，对组分含量的测定影响不大。计算折纯含量时，连水份与残渣的数据也不需要了。因此，本法既简便又准确，精密度高，复测的次数可以大大减少。
本发明的效果如下1.本法不但可以测定麦白、麦迪的A1，而且可以同时测定其他全部组分的含量。
2.操作简便。对称量、定容、进样量、HPLC仪器稳定性都无严格要求。
3.部标法测定A1需要各50mg标准品和样品，而本发明只需2mg，甚至于在大多数测定中，可以不要标准品。
4.准确度、精密度相当高。对一个样品的A1含量反复测定多少遍，绝对与相对误差大多在2%以内。
5.测定工效比部标法大大提高，8小时内可测定14批。
6.由于流动相中，用低毒的甲醇代替了剧毒的乙腈，使测定每批样品所需的乙腈降到1ml，比部标法节约95%以上;同时用无毒的醋酸铵代替了有毒的甲酸铵，从而大大有利于工作人员的健康，减轻对环境的污染。
7.测定每批样品的全部组分含量试剂费低廉，比部标法节约90%以上。
8.我们进一步找到了一种根据麦白、麦迪组分含量准确、简便、迅速、不再花钱地单靠计算得出其理论效价的新方法。开创了国内外在这方面的先例，使人们对麦白、麦迪的认识升华到了一个新的阶段并能够解释组分与效价间在过去模糊的认识，为制订质量标准、为生产与科研提供样品内在本质方面的更多信息并指明提高质量的正确方向。
这种方法不但在目前可用于对生测效价值以及成品的提取、洗涤质量进行有效的复核，而且为今后快速实现菌种优劣的鉴别，对发酵、提取过程实现监控、使之最佳化创造了条件。
9.找到了一种用折纯方式准确、简便、从本质上反映麦白、麦迪组分含量的理想方法。即使样品未经烘干、未经洗净，含有未知的较多水份与杂质，只要这杂质不影响在232、280nm处的峰形，则测出来的组分折纯含量与折纯效价保持不变。
10.与部标法相比，醋酸铵用量约是甲酸铵用量(mol数)的1/5，进样量只有原来的1/2，从而延长了柱寿。
实施例-测定标准品和苏州样品的各组分含量，步骤如下1.配制待测标样品吸收度比值A280/A232的溶液。
用掏耳小勺分别取待测品1/4～1/3勺于25ml洁净量瓶中，加入分析纯无水乙醇15～20ml晃匀。
2.配制50%乙腈水。
3.配制流动相在1000ml试剂瓶中，依次加入分析纯甲醇680ml和0.03mol/l醋酸铵液320ml，加入20%醋酸液16滴，晃匀，用超声波除气机除气30分钟。置于HPLC仪器旁待用。
4.配制待测的标准品、样品液。
在2ml量瓶中约加入2mg标准品或样品，用50%乙腈水大致定容。置于HPLC仪器旁。
5.起动SP8810HPLC仪，按图3条件设置仪器参数。仪器基本稳定后依次进样。
标准品和苏州样品在232nm波长处的面积归一化图谱见附图3。图谱良好，流动相及仪器参数不必调正。
6.用751分光光度计依次测定样品的吸收度比值A280/A232。数据如下
本步也可以和上步同时进行。
7.第五步完成后，按图4条件接着依次进样，每批一次，便得到标准品和苏州样品在280nm波长处的面积归一化图谱(附图4)。
8.用改进归一法计算各组分含量(1)标准品，(水份)p＝0，(杂质)p＝0，①用当日aA1p计算从图3a知aA1p＝65.388%;从图4a得知bA4p＝59.994%则，C232P＝ (0.17787(1－水份－杂质)P)/(0.17787+(aAlp-0.49)A280/A232)= 0.17787/(0.17787+(0.65388-0.49)×0.363)=0.7494=74.9%CA1p＝C232paA1p＝0.7494×65.388%＝49.00%C280p＝(1-水份-杂质-C232)p＝1-C232p＝1-0.7494＝0.2506＝25.06%CA4p＝bA4PC280p＝59.994%×0.2506＝15.03%
用同样方法可知其他各组分含量。
(2)苏州样品①如实测水份＝2%，残渣＝0.5%则杂质≌2×残渣＝1%＝0.01从图3a知aA1p＝65.388%从图3b知aA1＝42.806%从图4b知bA4＝31.53%这时的麦白为“湿”形式，C232(湿)＝ (0。17787(1－水份－杂质))/(0.17787+(aAlP-0.49)A280/A232)= (0.17787(1-0.02-0.01))/(0.17787+(0.65388-0.49)×0.159)=0.8461=84.61%CA1(湿)＝aA1C232(湿)＝42.806%×0.8461＝36.22%C280＝1-水份-杂质-C232(湿)＝1-0.02-0.01-0.8461＝0.1239＝12.39%CA4(湿)＝bA4C280(湿)＝31.53%×12.39%＝3.907%用同样方法可知其他各组分含量。
②已知本品为合格产品，但又不知道水份与残渣的确切值，这时可认为1-水份-杂质≌0.985于是C232(湿)＝ (0.17787×0.985)/(0.17787+(0.65388-0.49)×0.159) ＝85.91%CA1(湿)＝42.806%×85.91%＝36.78%C280(湿)＝0.985-85.91%＝12.59%CA4(湿)＝31.53%×12.59%＝3.97%用同样方法可知其他各组分的含量。
③将本品按折纯处理
C232(折纯)＝ 0.17787/(0.17787+(0.65388-0.49)×0.159) ＝87.22%CA1(折纯)＝aA1C232(折纯)＝42.806%×87.22%＝37.34%C280(折纯)＝1-C232(折纯)＝12.78%CA4(折纯)＝bA4C280(折纯)＝31.53%×12.78%＝4.03%用同样方法可知其他各组分的含量。
权利要求
1.麦白、麦迪霉素全部组分含量的测定方法，其特征在于采用分光光度计分别测定标准品和样品在280、232nm波长处的吸收度比值；采用高效液相色谱仪，以适当比例的甲醇-0.03 mol/l醋酸铵液、用20%醋酸液调节PH值为6.0～6.8的溶液为流动相，50%乙腈水定容样品，以便麦白标准品的A1后、A2后能同时检则出来、A1组分的保留时间等于9±2分为度；分别测出标准品和样品在232、280nm处的面积归一化图谱，取得包括标准品A1组分在内的各组分的峰面积占相应波长处总峰面积的百分数；进而用改进归一法计算出全部组分的含量。
2.按照权利要求1所说的测定方法，其特征在于采用全套SP8810 HPLC仪和大连化学物理所生产的色谱柱(91050401);以68±2%甲醇和32±2%的0.03mol/l醋酸铵溶液并以20%醋酸液调节其PH值为6.6～6.8作为流动相，样品以50%乙腈水定容。
全文摘要
本发明涉及麦白、麦迪霉素的组分含量测定方法。本发明以适当比例的甲醇-醋酸铵、pH＝6.0～6.8的溶液作流动相，50％乙腈水定容；分别测出标准品、样品在232、280nm波长处的面积归一化图谱；用分光光度计测出它们在280、232nm处的吸收度比值从而准确、低毒、简易、快速、试剂费用低廉地测出其全部组分的含量，并根据这些含量可以进一步计算出它们的理论效价。
文档编号G01N30/02GK1070481SQ9210963
公开日1993年3月31日 申请日期1992年8月22日 优先权日1992年8月22日
发明者张国华 申请人:国营北京市东北旺制药厂