一种大麦籽粒中冰结构蛋白的快速特异性纯化方法
【专利说明】
[0001]技术领域:本发明涉及食品工程技术领域，具体涉及一种大麦籽粒中冰结构蛋白的快速特异性纯化方法。
【背景技术】
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[0002]经冷诱导后，植物体内会发生一系列生理、生化和分子生物学的变化，包括低温诱导蛋白、糖类、渗透调节物质的合成和分泌，膜结构与组成改变和一些新酶的出现等。冰结构蛋白(ISPs)为植物低温诱导蛋白中的一种，具有热滞活性、调节原生质体过冷状态、修饰冰晶形态及抑制重结晶的特性。与鱼类、昆虫ISPs不同，植物ISPs的抗冻特性是低热滞活性和高重结晶抑制活性，使其更适于应用到冷冻食品中，以减少贮藏和运输过程中因温度波动而引起的冷冻食品品质劣变。
[0003]目前ISPs的纯化大部分采用常规的系列柱层析技术进行，只有少量利用“冰手指”(Ice finger)法特异性纯化ISPs的报道。常规的系列柱层析方法适用范围广，但存在工艺繁琐，回收率低且处理周期长、处理量小的缺点。而且在纯化过程中通常选择活性相对高的组分进行下一步纯化处理，因此存在漏检的可能。ISPs的吸附-抑制理论认为ISPs是通过自身吸附到冰晶表面从而抑制冰晶的生长的。“冰手指”法特异性纯化是以ISPs的吸附-抑制理论为基础从粗提物中纯化与冰结合的ISPs的。“冰手指”法能够避免常规柱层析法漏检的缺陷，能够同时获得多种ISPs，但对设备和操作条件的要求较高。而且在纯化过程中一方面要对“冰手指”进行降温，另一方面又要对粗提液体系进行升温处理以弥补“冰手指”传热引起的体系温度的降低，存在能源浪费问题。另外，由于“冰手指”上有效冰吸附表面有限，操作所需时间较长。
[0004]溶液冻结包括降温和结晶两个过程。降温过程中温度低于凝固点但仍未凝固或结晶的液体称为过冷液体。过冷液体是处于亚稳态的，只要有微小扰动形成凝结核就能诱发结晶，瞬间形成大量小冰晶。根据植物ISPs低热滞活性和高重结晶抑制活性的特点，本发明利用ISPs通过自身吸附到冰晶表面从而抑制冰晶的生长的特性，建立了一种利用溶液自身产生的冰晶进行ISPs亲和纯化的新型快速特异性纯化方法，利用该方法能够特异性的从大麦籽粒ISP粗提液中纯化ISPs，具有特异性强，对设备和操作条件要求低，能源节约且处理量大，耗时短的特点。
【发明内容】
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[0005]本发明的目的在于避免现有技术的不足，提供一种大麦籽粒冰结构蛋白的快速特异性纯化方法。本发明，以通过真空渗透离心法从大麦籽粒中分离获得的ISPs粗提物为纯化对象，通过控制溶液降温速率和溶液温度，使溶液自身产生大量冰晶并与ISPs发生亲和吸附，然后经过固液分离即可得到组成相对简单且活性较高的ISPs，从而为进一步拓宽ISPs在各领域的应用提供技术支撑。
[0006]为实现本发明的目的所采用的技术方案是:
[0007](I)溶液除杂及蛋白浓度调节:采用0.22 μπι的微孔滤膜，除去ISPs粗提液中的颗粒性杂质，并调节蛋白浓度为0.1?1.0mg/mL ；
[0008](2)冻结曲线测定:利用热电偶，测定溶液的冻结曲线，确定冰点温度与过冷温度，降温速率为0.5?3°C /min ；
[0009](3)程序降温:采用低温制冷循环系统对溶液进行程序降温，降温速率为0.5?30C /min,降温终点温度为-10?0°C ；
[0010](4)晶核引入及冰晶形成:可以以微晶玻璃作为晶核直投方式加入晶核，也可通过震荡、点触方式诱发产生晶核，使冰晶大量形成；
[0011](5)亲和吸附:将⑷中形成的冰水悬浮液在-10?0°C下以10-100r/min的转速揽拌I?5min ；
[0012](6)固液分离:低温下，使用预冷的砂芯漏斗将(5)中得到的悬浮液进行固液分离，真空抽滤除去冰渣中夹带的蛋白溶液，将获得的冰渣置50mM的磷酸盐缓冲液中，使其融化；
[0013](7)冷冻干燥:将(6)中获得的溶液冷冻干燥即得到冰亲和纯化后的大麦籽粒冰结构蛋白。
[0014]本发明方法的优点:
[0015]1、本发明以蛋白溶液自身产生的冰晶进行ISPs的冰亲和吸附，大大提高了降低了对设备的要求，能够降低冰结构蛋白的成本。
[0016]2、本发明利用溶液在过冷阶段引入晶核能产生大量小冰晶的原理进行ISPs的冰亲和吸附，大大提高了能够亲和ISPs的冰晶的数量和表面积，缩短亲和所需时间，提高纯化效率。
[0017]3、本发明不要任何特殊昂贵的仪器设备，且实验条件简单易实现，完全符合工业化大规模生产的要求。
【附图说明】
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[0018]图1所示为本发明实施例1中大麦籽粒ISPs的快速特异性纯化方法流程图；
[0019]图2所示为本发明实施例1中大麦籽粒ISPs的冻结曲线图；
[0020]图3所示为本发明实施例1中大麦籽粒ISPs快速特异性纯化前后热滞活性对比图；
[0021]图4所示为本发明实施例1中大麦籽粒ISPs快速特异性纯化前后分子量分布对比图。
【具体实施方式】
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[0022]实施例1
[0023](I)溶液除杂及蛋白浓度调节:采用0.22 μπι的微孔滤膜，除去粗提液中的颗粒性杂质，并调节蛋白浓度为0.5mg/mL ；
[0024](2)冻结曲线测定:利用热电偶，测定蛋白溶液的冻结曲线，降温速率约1°C/min ；
[0025](3)程序降温:采用低温制冷循环系统对蛋白溶液进行程序降温，降温速率为10C /min,降温终点温度为-7V ;
[0026](4)晶核引入:通过点触方式诱发产生晶核，使冰晶大量形成；
[0027](5)亲和吸附:将(4)中形成的冰水悬浮液在-7 °C下以50r/min的转速搅拌3min ；
[0028](6)分离:_7°C下，使用预冷的砂芯漏斗将(5)中得到的悬浮液进行固液分离，真空抽滤除去冰渣中夹带的蛋白溶液，将获得的冰渣置50mM的磷酸盐缓冲液中，使其融化；
[0029](7)冷冻干燥:将￠)中获得的溶液冷冻干燥即得到冰亲和纯化后的大麦籽粒冰结构蛋白。
[0030]用差示扫描量热法测定冰亲和纯化后大麦籽粒ISPs提取物的热滞活性，并与原始大麦籽粒提取物的热滞活性进行比较，结果如图3。从图中可以看出，经冰亲和纯化后ISPs溶液活性得到了较大的提高。
[0031]采用Superdex_G75凝胶柱对冰亲和纯化前后蛋白溶液进行洗脱，结果如图4。从图中可以看出，经冰亲和纯化后ISPs溶液的分子量分布发生了改变，证明部分非ISPs被除去。
【主权项】
1.一种大麦籽粒中冰结构蛋白的快速特异性纯化方法，其特征包括以下步骤: (1)粗提液除杂及蛋白浓度调节:采用0.22 μπι的微孔滤膜，除去粗提液中的颗粒性杂质，并调节蛋白浓度为0.1?1.0mg/mL ； (2)冻结曲线测定:利用热电偶，测定并记录(I)中溶液的冻结曲线，确定冰点温度与过冷温度，降温速率为0.5?3°C /min ； (3)程序降温:采用低温制冷循环系统对(I)中溶液进行程序降温，降温速率为0.5-30C /min,降温终点温度为-10?0°C ； (4)晶核引入:以微晶玻璃作为晶核，采用直投方式加入溶液，也可通过震荡、点触方式诱发产生晶核，使冰晶大量形成； (5)亲和吸附:将(4)中形成的冰水悬浮液在恒温下以10?100r/min的转速搅拌I?5min ； (6)分离:低温下，使用预冷的砂芯漏斗将(5)中得到的悬浮液进行固液分离，真空抽滤除去冰渣中夹带的溶液，将获得的冰渣置于50mM的磷酸盐缓冲液中，使其融化； (7)冷冻干燥:将￠)中获得的溶液冷冻干燥即得到冰亲和纯化后的大麦籽粒冰结构蛋白O
【专利摘要】本发明涉及一种大麦籽粒中冰结构蛋白的快速特异性纯化方法。其特征包括以下步骤：(1)溶液除杂及蛋白浓度调节，(2)冻结曲线测定，(3)程序降温，(4)晶核的引入，(5)亲和吸附，(6)分离，(7)冷冻干燥。本发明利用大麦籽粒冰结构蛋白能够特异性亲和到冰晶上的特点，在溶液过冷阶段引入晶核使溶液产生大量小冰晶，达到特异性纯化冰结构蛋白的目的，具有用时短，效率高的特点，建立了一种新的特异性纯化大麦籽粒中冰结构蛋白的方法。
【IPC分类】C07K1-36, C07K1-22, C07K14-415, C07K1-34
【公开号】CN104650199
【申请号】CN201510014453
【发明人】张晖, 丁向丽, 齐希光, 王立, 钱海峰
【申请人】江南大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年1月12日