一种提高裂殖壶菌油脂中二十二碳六烯酸含量的方法
【专利摘要】本发明涉及一种提高裂殖壶菌油脂中二十二碳六烯酸(DHA)含量的方法，其特征在于，通过选择发酵碳源来降低菌体内的磷酸戊糖途径代谢通量，还可以添加外源调控因子，使菌体内的磷酸戊糖途径代谢通量降低，同时对三羧酸转运体系中的苹果酸酶的活性进行抑制，使裂殖壶菌体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)含量大幅下降，促进DHA的大量合成，使最终所获取菌体的油脂中DHA含量最高可达55.3％。发酵碳源为1,2-丙二醇，或者1,2-丙二醇与乙醇及乙酸盐中任一种或二种的混合物，外源调控因子优选为芝麻酚，在发酵培养基灭菌后，进行过滤除菌后添加；芝麻酚的添加量可为0.5-3.0mM/L。本发明方法简单易行，效果明显，可大幅提高菌体油脂中DHA含量，且易于工业化应用。
【专利说明】一种提高裂殖壶菌油脂中二十二碳六烯酸含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种提高裂殖壶菌油脂中二十二碳六烯酸 (DHA)含量的方法。
【背景技术】
[0002] 二十二碳六烯酸（DHA)属于多不饱和脂肪酸，具有十分重要的生理功能，是人体 自身不能大量合成但又不可缺少的重要营养素。DHA大量存在于人体视网膜及大脑皮层的 神经组织中，有促进脑部及视力发育，提高智力，改善记忆力和视力的作用；此外，它还能阻 止胆固醇在血管壁上沉积，预防或减轻动脉粥样硬化及冠心病的发生。
[0003] 裂殖壶菌（Schizochytrium)是一种优良的生产多不饱和脂肪酸油脂的资源。 目前，利用裂殖壶菌大规模发酵生产多不饱和脂肪酸油脂得到很多科研院所和单位的关 注，并对其生产过程进行了深入的研宄。申请号为201010000055. 4的专利文献公开了 一种海洋真菌裂殖壶菌，其中二十二碳六烯酸甘油三酯占油脂总量的35-40 % ;申请号为 201310571413. 0的专利公开了利用秸杆水解液发酵生产二十二碳六烯酸的方法，最终获得 的DHA可占油脂总重的42. 1-45. 3% ;申请号为201010504635. 7的专利公开了外源添加因 子促进微生物合成二十二碳六烯酸的方法，该方法指出，向可产DHA的微生物培养基中添 加乙酸、柠檬酸和辛伐他汀中的任意一种或几种组合时，微生物体内的DHA含量可有效得 到提高，从初始的35. 51 %最高可提高到45. 00%。
[0004] 上述方法对裂殖壶菌发酵产DHA的工艺技术具有一定的提升，但目前尚未有技术 结合裂殖壶菌体内所特有的DHA合成路径来调控其代谢通路，以期实现裂殖壶菌所产油脂 中DHA含量的进一步提升；而且，进一步促进DHA含量的增加，可有效提升裂殖壶菌所产油 脂的品质，也间接降低了发酵成本，增加了生产效率。
【发明内容】
[0005] 针对现有利用裂殖壶菌发酵产DHA油脂技术的不足，本发明提供了一种提高裂殖 壶菌油脂中二十二碳六烯酸含量的方法，根据裂殖壶菌体内所特有的DHA合成路径的特 点，在裂殖壶菌发酵过程中，通过选择发酵碳源来降低菌体内的磷酸戊糖途径代谢通量，以 提高裂殖壶菌所产油脂中DHA的含量，提升DHA油脂的品质，同时，提高生产效率，并降低生 产成本。
[0006] 为了实现上述目的，本发明提供了一种提高裂殖壶菌油脂中二十二碳六烯酸含量 的方法，该方法选择发酵培养基中的发酵碳源来降低菌体内的磷酸戊糖途径代谢通量，使 裂殖壶菌体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH)含量大幅下降，促进DHA的大量合成；所 述发酵碳源为1，2-丙二醇，1，2-丙二醇与乙醇，1，2-丙二醇与乙酸盐，或1，2-丙二醇、乙 醇与乙酸盐的组合中的任意一种。
[0007] 作为上述技术方案的改进，该方法在发酵培养基中添加外源调控因子，使菌体内 的磷酸戊糖途径代谢通量降低，同时对三羧酸转运体系中的苹果酸酶的活性进行抑制，使 裂殖壶菌体内NADPH含量大幅下降，促进DHA的大量合成。其中，外源调控因子优选为芝麻 酚，在发酵培养基灭菌后，进行过滤除菌后添加；芝麻酚的添加量可为〇. 5-3. OmM/L。
[0008] 本发明的优点在于通过选择发酵碳源，使菌体中的磷酸戊糖途径代谢通量下降， 以及进一步同时选择发酵碳源和添加外源调控因子，使菌体内的磷酸戊糖途径代谢通量降 低，同时对三羧酸转运体系中的苹果酸酶（ME)的活性进行抑制，使裂殖壶菌体内的还原力 NADPH含量大幅下降，致使碳代谢流转向聚酮合酶路径来合成DHA，从而促进DHA的大量合 成，大幅提高裂殖壶菌油脂中DHA的含量，显著提升了 DHA油脂的品质。
【具体实施方式】
[0009] 本发明通过选择发酵碳源，以及进一步添加外源调控因子等方式，使菌体内的磷 酸戊糖途径代谢通量降低，同时对三羧酸转运体系中的苹果酸酶的活性进行抑制，使裂殖 壶菌体内NADPH含量大幅下降，从而促使脂肪酸前体性物质-乙酰辅酶A向聚酮合酶途径 转化。
[0010] 本发明方法的具体实现步骤为：
[0011] (1)将低温冻存的裂殖壶菌种活化培养成裂殖壶菌种子液；
[0012] 活化培养所采用的种子培养基可以采用现有技术提供的各种组分，其优选的组分 (g/L)为：葡萄糖15. 0-30. 0,酵母粉4. 0-8. 0,牛肉膏0-5. 0蛋白胨0-5. 0,玉米浆2. 0-6. 0， MgSO4 · 7H20 0· 2-1. 0, KH2PO4 0· 5-2. 0,海水晶 10. 0-20. 0。
[0013] (2)将裂殖壶菌种子液按照体积百分比4% -10% (优选8% )接入发酵培养基进 行培养；
[0014] 发酵培养基可以采用现有技术提供的各种组分，只是将其中作为发酵碳源的葡萄 糖替换为1，2-丙二醇，或者为1，2-丙二醇与乙醇和/或乙酸盐的混合溶液，乙醇需经过滤 除菌后加入已灭菌后的发酵培养基中，其中，乙酸盐优选乙酸钠。
[0015] 发酵培养基优选的组分（g/L)为：发酵碳源40. 0-60. 0,酵母抽提物6. 0-15. 0,谷 氨酸钠 0-10. 0, MgSO4 · 7H20 0· 2-1. 0, KH2PO4 0· 5-2. 0，（NH4)2SO4 0-5. 0, NaNO3 1. 0-3. 0， Na2SO4 5. 0-12. 0〇
[0016] 当发酵碳源为多种物质混合时，其组份（g/L)为：
[0017] 1，2-丙二醇与乙酸盐：1，2-丙二醇40-60 ;乙酸钠 0-10 ;
[0018] 1，2-丙二醇与乙醇：1，2-丙二醇 40-60 ;乙醇 0-10 ;
[0019] 1，2-丙二醇、乙醇与乙酸盐：1，2-丙二醇40-60 ;乙醇0-10 ;乙酸盐0-10。
[0020] 为进一步提高本发明的技术效果，可以在发酵培养基灭菌后，进行过滤除菌后添 加外源调控因子。
[0021] 外源调控因子可优选芝麻酚，其添加量为0. 5-3. OmM/L。
[0022] (3)结束发酵后，收集湿菌体并真空干燥，直至菌体保持恒重，并称重。
[0023] (4)对干燥的菌体进行破壁，加入有机溶剂（如石油醚和正己烷等）进行萃取，从 而得到富含二十二碳六烯酸的油脂，进行甲酯化后的气相检测分析，可以得到DHA的含量。
[0024] 步骤（3)、（4)均可以采用现有技术，在此不再赘述。
[0025] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施 例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通 技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范 围。
[0026] 实施例1
[0027] (1)在250mL三角瓶中加入50mL种子培养基。接入低温冻存的裂殖壶菌种，在培 养温度25°C，摇床转速200rpm条件下培养2天，将低温冻存的裂殖壶菌种活化成裂殖壶菌 种子液；
[0028] 种子培养基组分（g/L):葡萄糖15.0,酵母粉6.0,牛肉膏3.0,蛋白胨2.0,玉米浆 4. 0, MgSO4 · 7H20 0· 2, KH2PO4 2. 0,海水晶 15. 0。
[0029] (2)在250mL三角瓶中加入50mL发酵培养基，将裂殖壶菌以10%的接种量接入发 酵培养基，26°C恒温培养3天，转速200rpm ;
[0030] 发酵培养基组分（g/L) :1，2-丙二醇40. 0,酵母抽提物6. 0, MgSO4 · 7H20 0. 6， KH2PO4 0. 5, NaNO3 1. 0, Na2SO4 5. 0 ；
[0031] CK (g/L):葡萄糖 40. 0,酵母抽提物 6. 0, MgSO4 · 7Η20 (λ 6, KH2PO4 (λ 5, NaNO3 L 0， Na2SO4 5. 0 ；
[0032] 每种不同的培养基配制3个平行样，121°C，灭菌25min，冷却备用；
[0033] (3)连续培养3天后结束发酵，发酵液进行SOOOg离心15分钟，并用单蒸水洗2-3 次后，再次离心，收集湿菌体并置于真空干燥箱内，在真空度为〇.9Mpa，温度为80°C条件 下，大约烘10小时，直至菌体保持恒重，并称重。
[0034] (4)对真空干燥的菌体进行机械破壁，称取Ig破壁菌粉于试管中，加入30-60沸 程的石油醚进行等体积萃取三次，每次加入石油醚5mL，收集石油醚萃取液，并置于真空干 燥箱内，于80°C，真空度为0. 9Mpa条件下，除去石油醚，从而得到富含二十二碳六烯酸的油 月旨，并进行甲酯化后的气相检测分析。
[0035] 发酵结果如下所示：
[0036] 表1发酵过程中菌体内的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH)活性变化对比
[0037]
【权利要求】
1. 一种提高裂殖壶菌油脂中二十二碳六烯酸含量的方法，该方法选择发酵培养基中的 发酵碳源来降低菌体内的磷酸戊糖途径代谢通量，使裂殖壶菌体内NADPH含量大幅下降， 促进DHA的大量合成；所述发酵碳源为1，2-丙二醇，1，2-丙二醇与乙醇，1，2-丙二醇与乙 酸盐，或1，2-丙二醇、乙醇与乙酸盐的组合中的任意一种。
2. 如权利要求1所述的提高裂殖壶菌油脂中二十二碳六烯酸含量的方法，其特征在 于，该方法在发酵培养基中添加外源调控因子，使菌体内的磷酸戊糖途径代谢通量降低，同 时对三羧酸转运体系中的苹果酸酶的活性进行抑制，使裂殖壶菌体内NADPH含量大幅下 降，促进DHA的大量合成。
3. 如权利要求2所述的一种提高裂殖壶菌油脂中二十二碳六烯酸含量的方法，其特征 在于，外源调控因子为芝麻酚，在发酵培养基灭菌后，进行过滤除菌后添加。
4. 如权利要求3所述的一种提高裂殖壶菌油脂中二十二碳六烯酸含量的方法，其特征 在于，芝麻酚的添加量为0. 5-3. OmM/L。
5. 如权利要求1至4中任一所述的一种提高裂殖壶菌油脂中二十二碳六烯酸含量的方 法，其特征在于，当发酵碳源为1，2_丙二醇与乙酸盐时，其配比为：1，2_丙二醇40g/L-60g/ L ;乙酸钠0-10g/L ;当发酵碳源为1，2-丙二醇与乙醇时，其配比为：1，2-丙二醇40-60g/ L ;乙醇0-10g/L ;当发酵碳源为1，2-丙二醇、乙醇与乙酸盐时，其配比为：1，2-丙二醇 40_60g/L ;乙醇 0-10g/L ;乙酸盐 0-10g/L。
6. 如权利要求1所述的一种提高裂殖壶菌油脂中二十二碳六烯酸含量的方法，其特征 在于，该方法的具体实现步骤为： (1) 将低温冻存的裂殖壶菌种活化培养成裂殖壶菌种子液； (2) 将裂殖壶菌种子液按照体积百分比4% -10%接入发酵培养基进行培养； (3) 结束发酵后，收集湿菌体并真空干燥，直至菌体保持恒重，并称重； (4) 对干燥的菌体进行破壁，然后萃取得到富含二十二碳六烯酸的油脂。
7. 如权利要求6所述的一种提高裂殖壶菌油脂中二十二碳六烯酸含量的方法，其特征 在于，步骤（2)中，在发酵培养基灭菌后，进行过滤除菌后添加外源调控因子。
8. 如权利要求6或7所述的一种提高裂殖壶菌油脂中二十二碳六烯酸含量的方法，其 特征在于，所述发酵碳源中含乙醇时，乙醇经过滤除菌后加入已灭菌后的发酵培养基中；所 述乙酸盐选用乙酸钠。
9. 如权利要求6或7所述的一种提高裂殖壶菌油脂中二十二碳六烯酸含量的方 法，其特征在于，所述步骤（1)中的种子培养基组分（g/L)为：葡萄糖15. 0-30.0,酵 母粉 4. 0-8. 0,牛肉膏 0-5. 0 蛋白胨 0-5. 0,玉米浆 2. 0-6. 0, MgS04 ? 7H20 0? 2-1. 0， KH2P040. 5-2. 0,海水晶 10. 0-20. 0。
10. 如权利要求6或7所述的一种提高裂殖壶菌油脂中二十二碳六烯酸含量的方法， 其特征在于，所述步骤（3)中的发酵培养基组分（g/L)为：发酵碳源40. 0-60.0,酵母抽 提物 6. 0-15. 0,谷氨酸钠 0-10. 0, MgS04 ? 7H200. 2-1. 0, KH2P040. 5-2. 0，（NH4)2S040-5 . 0， NaN03l. 0-3. 0, Na2S045. 0-12. 0〇
【文档编号】C12P7/64GK104480152SQ201410667988
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月20日 优先权日:2014年11月20日
【发明者】余龙江, 陈伟, 朱圆敏, 周蓬蓬, 金文闻, 余金龙 申请人:武汉华士特工业生物技术开发有限公司, 华中科技大学