专利名称:生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生产方法
技术领域：
本发明涉及利用寇氏隐甲藻[Crypthecodiniumcohnii (Se 1 igo) Javornicky]生产二十二碳六烯酸(DHA)油脂技术领域：
，具体地说是一种生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生产方法。
背景技术：
近年来，多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids, PUFAs)对人类健康的重要作用已愈来愈受到人们的重视。其中，二十二碳六烯酸因其在人体和动物体内的重要生理功能而倍受人们的青睐。研究表明，DHA是人体某些组织中细胞膜的基本组分；对婴幼儿视觉系统和神经系统的发育起着重要作用；还具有降低胆固醇作用，抗凝血功效以及抑制癌功效，防止老年性痴呆症等，并且它是幼鱼生长所必需的一种脂肪酸。利用寇氏隐甲藻生产二十二碳六烯酸(DHA)油脂已形成工业化生产，二十二碳六烯酸的生产工艺在不断改进。其中现在公开报道海洋微藻生产二十二碳六烯酸(DHA)油脂中藻细胞破壁方法有两类。一类是物理方法破壁机械破壁如采用均质机或胶体磨等机械进行磨檫和挤压使细胞壁破裂、干燥法等。采用机械破壁方法细胞破壁不完全，用有机溶剂萃取收得率为总油60-70%。采用干燥法耗时耗能，且加热及通气方法干燥后提取油脂过氧化值较高，毛油品质较差，冷冻干燥成本较高，干燥后用有机溶剂萃取精炼后得率仅为毛油30-50%。
公开日为1995年4月5日、公开号为CN1101034A的专利申请公开的利用海洋微藻生产二十二碳六烯酸(DHA)油脂的方法是采用冷冻干燥或加热及通气方法干燥后进行提取。另一类是化学方法破壁；采用化学试剂破坏细胞壁结构，然后用有机溶剂萃取得到毛油。
公开日为 2007年6月27日，公开号为CN1986822A的专利申请公开的用寇氏隐甲藻发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法是采用加破壁剂如十二烷基硫酸钠等，其用量为浓缩发酵液重量的 0.1-0.6%。这种方法得到油脂中会有化学试剂残留，影响油的品质。且毛油质量较差，精炼后得率仅为毛油30-50%。
发明内容
本发明的目的是研制一种将酶法破壁用于寇氏隐甲藻[Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky]发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法，它大大地提高了二十二碳六烯酸(简称DHA)的收得率和毛油的品质。
本发明生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生产方法，包括以寇氏隐甲藻 [Crypthecodinium cohnii (Seligo)Javornicky]为出发菌株，在液体培养基中连续培养寇氏隐甲藻得到海藻细胞，然后通过生物酶法破壁从海藻细胞中提取二十二碳六烯酸油脂。
本发明所用的寇氏隐甲藻菌种名称是Crypthecodinium cohnii (Seligo) Javornicky。可以从包括ATCC(美国典型培养物收集中心)的保藏培养机构获得。
生物酶分为主体酶和辅助酶；
主体酶为碱性蛋白酶(2709)、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶，可以使用其中的一种或几种，若为几种，其比例可按任意比例配合使用。其用量为发酵液重量的0. 12-0.5%，若为浓缩发酵液，其用量按浓缩前发酵液重量计算；
辅助酶为胰蛋白酶、靡蛋白酶，纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶，可以使用其中的一种或多种，若为多种，其比例可按任意比例配合使用。其用量为发酵液重量的0-0. 025%，若为浓缩发酵液，主体酶和辅助酶用量按浓缩前发酵液重量计算；
在使用时，单独用主体酶或主体酶和辅助酶并用都可达到破壁。
本发明生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生产方法在发酵液或过滤浓缩发酵液中加入主体酶，用量为发酵液重量的0. 12-0. 5%若为浓缩发酵液，其用量按浓缩前发酵液重量计算；辅助酶，用量为发酵液重量的0-0. 025%，若为浓缩发酵液，主体酶和辅助酶用量按浓缩前发酵液重量计算，升温50-70°C，保温搅拌3-9小时，加入95%的乙醇，乙醇用量为发酵液浓缩发酵液的30% -150%，加入有机溶剂量为发酵液或浓缩发酵液重量的1. 5-4. 5倍，进行萃取得到二十二碳六烯酸毛油。将二十二碳六烯酸毛油经水化、碱炼、 脱色、脱臭后得到二十二碳六烯酸精炼油。
其中所述的有机溶剂为正己烷或氯仿等。
本发明所述的浓缩发酵液中主体酶和辅助酶的加入量，是以过滤浓缩发酵液前的发酵液量来计算的。
本发明生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生产方法的优点是藻细胞破壁完全，破壁率为95%以上，不需要经过干燥，可以防止二十二碳六烯酸毛油的氧化，使萃取油脂过氧化值极低，POV值在0.5以下，收得率为总油的90%以上，精炼得率为毛油的70%以上。 具体实施方式
实施例一
一种生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生产方法采用寇氏隐甲藻斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养和三级发酵培养，得到发酵液。在发酵液IOOkg中加入碱性蛋白酶O709) 0. 2kg,升温50-70°C，保温搅拌3_9小时，加入95%的乙醇30kg，加入正己烷150kg，进行萃取得到二十二碳六烯酸毛油3kg。将二十二碳六烯酸毛油经水化、碱炼、脱色、脱臭后得到二十二碳六烯酸精炼油2. 34kg。
实施例二
一种生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生产方法采用寇氏隐甲藻斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养和三级发酵培养，得到发酵液。在发酵液IOOkg中加入中性蛋白酶0. 35kg，升温50-70°C，保温搅拌3_9小时，加入95%的乙醇30kg，加入正己烷150kg，进行萃取得到二十二碳六烯酸毛油3kg。将二十二碳六烯酸毛油经水化、碱炼、脱色、脱臭后得到二十二碳六烯酸精炼油2. 34kg。
实施例三
一种生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生产方法采用寇氏隐甲藻斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养和三级发酵培养，得到发酵液。在发酵液IOOkg中加入木瓜蛋白酶0. 45kg，升温50-70°C，保温搅拌3_9小时，加入95%的乙醇30kg，加入正已烷150kg，进行萃取得到二十二碳六烯酸毛油3kg。将二十二碳六烯酸毛油经水化、碱炼、脱色、脱臭后得到二十二碳六烯酸精炼油2. 34kg。
4[0021]实施例四
一种生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生产方法采用寇氏隐甲藻斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养和三级发酵培养，得到发酵液。在发酵液IOOkg中加入碱性蛋白酶(2709)0. 12kg，加入糜蛋白酶0.001kg，升温50-70°C，保温搅拌3-9小时，加入95%的乙醇30kg，加入正已烷150kg，进行萃取得到二十二碳六烯酸毛油3kg。将二十二碳六烯酸毛油经水化、碱炼、脱色、脱臭后得到二十二碳六烯酸精炼油2. 34kg。
实施例五
一种生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生产方法采用寇氏隐甲藻斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养和三级发酵培养，得到发酵液。在发酵液IOOkg中加入中性蛋白酶0. Wkg，加入胰蛋白酶o.(^kg、靡蛋白酶共 0. 01kg，升温50-70°C，保温搅拌3-9小时，加入95%的乙醇60kg，加入氯仿200kg，进行萃取得到二十二碳六烯酸毛油3. ^g。将二十二碳六烯酸毛油经水化、碱炼、脱色、脱臭后得到二十二碳六烯酸精炼油3. 04kg。
实施例六
一种生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生产方法采用寇氏隐甲藻斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养和三级发酵培养，得到发酵液，在离心浓缩发酵液IOOkg(发酵液离心前为400kg)中加入碱性蛋白酶 0709)0. mcg，按纤维素酶葡聚糖酶木聚糖酶为1 3 1的比例加入纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶共0. OMkg，升温50-70°C，保温搅拌3-9小时，加入95%的乙醇90kg，加入正已烷250kg，进行萃取得到二十二碳六烯酸毛油16. Okgo将二十二碳六烯酸毛油经水化、 碱炼、脱色、脱臭后得到二十二碳六烯酸精炼油12kg。
实施例七
一种生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生产方法采用寇氏隐甲藻斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养和三级发酵培养， 得到发酵液，在离心浓缩发酵液IOOkg(发酵液离心前为400kg)中均等地加入中性蛋白酶和木瓜蛋白酶共OJkg，按胰蛋白酶靡蛋白酶纤维素酶为2 3 5的比例加入胰蛋白酶、靡蛋白酶、纤维素酶共0. OWkg，升温50-70°C，保温搅拌3-9小时，加入95%的乙醇 120kg，加入氯仿300kg，进行萃取得到二十二碳六烯酸毛油12.8kg。将二十二碳六烯酸毛油经水化、碱炼、脱色、脱臭后得到二十二碳六烯酸精炼油9. 2kgo
实施例八
一种生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生产方法采用寇氏隐甲藻斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养和三级发酵培养， 得到发酵液，在离心浓缩发酵液IOOkg (发酵液离心前为450kg)中均等地加入碱性蛋白酶 O709)和木瓜蛋白酶共OJkg，按胰蛋白酶靡蛋白酶纤维素酶葡聚糖酶为1 :4:1 的比例加入胰蛋白酶、靡蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶共0. 02kg，升温50-70°C，保温搅拌 3-9小时，加入95 %的乙醇13^g，加入正已烷350kg，进行萃取得到二十二碳六烯酸毛油 14kg。将二十二碳六烯酸毛油经水化、碱炼、脱色、脱臭后得到二十二碳六烯酸精炼油10kg。
实施例九[0032] 一种生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生产方法采用寇氏隐甲藻斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养和三级发酵培养，得到发酵液。在发酵液IOOkg中加入中性蛋白酶0. ^g，按胰蛋白酶靡蛋白酶纤维素酶 葡聚糖酶木聚糖酶为1 :2:1:1: 1的比例加入胰蛋白酶、靡蛋白酶，纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶共0. 025kg,升温50-70°C，保温搅拌3-9小时，加入95%的乙醇150kg，加入氯仿450kg，进行萃取得到二十二碳六烯酸毛油3. 5kgo将二十二碳六烯酸毛油经水化、 碱炼、脱色、脱臭后得到二十二碳六烯酸精炼油2. 6kgo
权利要求
1. 一种生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生产方法，其特征在于包括以寇氏隐甲藻[Crypthecodinium cohnii (Seligo) Javornicky]为出发菌株，在液体培养基中连续培养寇氏隐甲藻得到海藻细胞，然后通过生物酶法破壁从海藻细胞中提取二十二碳六烯酸油脂；所述生物酶法是在发酵液或过滤浓缩发酵液中加入主体酶和辅助酶，升温50-70°C， 保温搅拌3-9小时，加入95%的乙醇，乙醇用量为发酵液的30% -150%，加入有机溶剂进行萃取得到二十二碳六烯酸毛油；将二十二碳六烯酸毛油经水化、碱炼、脱色、脱臭后得到二十二碳六烯酸精炼油；所述主体酶为碱性蛋白酶2709、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一种或几种，若为几种，其比例可按任意比例配合使用；辅助酶为胰蛋白酶、靡蛋白酶，纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶中的一种或多种，若为多种，其比例按任意比例配合使用；所述主体酶用量为发酵液重量的0. 12-0. 5%;辅助酶用量为发酵液重量的0-0. 025%，若为浓缩发酵液，所述主体酶和辅助酶用量均按浓缩前发酵液重量计算。
专利摘要
一种生物酶法破壁用于二十二碳六烯酸油脂生产方法，包括以寇氏隐甲藻[Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky]为出发菌株，在液体培养基中连续培养寇氏隐甲藻得到海藻细胞，然后通过生物酶法破壁从海藻细胞中提取二十二碳六烯酸油脂。其优点是藻细胞破壁完全，破壁率为95％以上，不需要经过干燥，可以防止二十二碳六烯酸毛油的氧化，使萃取油脂过氧化值极低，POV值在0.5以下，收得率为总油的90％以上，精炼得率为毛油的70％以上。
文档编号C12R1/89GKCN101307341 B发布类型授权 专利申请号CN 200810047859
公开日2012年1月4日 申请日期2008年5月29日
发明者过群 申请人:罗盖特生物营养品(武汉)有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (3), 非专利引用 (2),