吸附固定透性化乳酸菌转化菜油脚料生产共轭亚油酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于农产品废弃物利用技术领域。
【背景技术】
[0002]共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid，CLA)是一种主要从反合动物脂肪和牛奶产品中发现的天然活性物质，是一类含有共轭双键的十八碳二烯酸(亚油酸)异构体混合物，特别是c-9，t-11 CLA和t-10，c-12 CLA，被认为最具有生物活性，其中c_9，t_ll CLA是唯一能被动物细胞吸收进入磷脂层的共轭亚油酸异构体，而t-10，c-12 CLA在抗癌、抗粥脉动样硬化、调节免疫功能方面有重要作用。目前通常采用葵花籽油、红花籽油等价格昂贵的原料为底物生产共轭亚油酸。菜油是我国主要食用油之一，总产量占植物油总产量的1/3以上，其所产生的副产物一一菜油脚料价廉易得，而且含有20%左右的亚油酸，采用菜油脚料作为生成CLA的底物，不仅节约成本，还可以解决菜油脚料带来的环境污染问题。
[0003]乳酸菌所产的亚油酸异构酶可以实现生物合成法转化亚油酸生成CLA。传统生物发酵法具有细胞很难达到高密度，生长周期长，转化率低，易染菌，产物复杂，难于分离提取，菌体无法重复利用等问题。乳酸菌透性化处理可以增强细胞壁和细胞膜的通透性，减弱细胞壁对细胞膜上异构酶的屏蔽作用，使亚油酸异构酶与亚油酸更易结合，提高CLA产量。采用吸附固定化透性乳酸菌直接生物转化则具有转化周期短，转化介质液配制方便，反应体系中干扰物质少，不易染菌，产物较单一，细胞密度高，菌体可以重复利用，产物容易分离等优点，从而达到高效率，低成本的生产目的。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供了一种利用废弃的陶瓷作为载体吸附固定透性化乳酸菌，实现农产品废弃物菜油脚料高效转化生产共轭亚油酸(CLA)的方法。
[0005]本发明是通过以下技术方案实现的。
[0006]本发明包括如下步骤。
[0007](I)吸附固定载体的预处理:将废弃陶瓷敲碎，得到直径为4-6 mm的多孔陶瓷颗粒，清水冲洗后，先用0.1 mo I/L HCl溶液浸泡24-48 }1，再用0.1 mo I/L NaOH溶液浸泡24-48 h，最后用水洗至中性，烘干，灭菌，得到无菌吸附固定多孔陶瓷载体。
[0008](2)制备透性化乳酸菌:从新鲜斜面培养基上挑取1-3环乳酸菌，接种到50-200mL MRS培养基中，35-37°C厌氧培养20-26 h，即为乳酸菌菌悬液，取菌悬液继续在MRS培养基中扩大培养。将菌悬液4°C离心收集菌体细胞，将菌体细胞置于_20°C下冷冻后取出，在室温下融化，反复冻融2-4次，即得透性化乳酸菌。
[0009](3)吸附固定透性化乳酸菌:将步骤(2)的透性化乳酸菌加入含步骤(I)的无菌吸附固定多孔陶瓷载体的反应管中，然后加入无菌生理盐水浸没载体，再加入0.02%-0.05%的硫酸铝钾和0.3% -0.6%的淀粉，透性化乳酸菌细胞浓度达到0.3-0.6 g/mL，4°C条件下吸附固定30-120 min后，4°C离心去上清，即得吸附固定透性化乳酸菌。
[0010](4 )菜油脚料的乳化、酶解处理:将菜油脚料、Tween 80、Span-80按照1:(0.4-0.9): (0.2-0.6)比例混合，45-80°C水浴5_15min，再加入适量去离子水至菜油脚料终浓度为80-100 mg/mL，用混合器混合均匀，110_121°C灭菌20-30 min,即为菜油脚料乳化液；取菜油脚料乳化液，加入PH值8.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，添加爪哇毛霉脂肪酶粉至终浓度为200-350 U/mL，40-60°C，120-150 rpm酶解30-50 min，即得菜油脚料的乳化、酶解液。
[0011](5)吸附固定透性化乳酸菌转化菜油脚料乳化、酶解液:将步骤(4)的菜油脚料的乳化、酶解液和pH为6.0-6.8的0.1 mo I/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液加入步骤(3)的含吸附固定透性化乳酸菌的反应管，使得菜油脚料终浓度为60-80 mg/mL，35-38°C转化19-22h，离心分离后，上清液为转化液，用正己烷将转化液中的共轭亚油酸萃取。吸附固定透性化乳酸菌可重复利用。
[0012]本发明可实现农产品废弃物菜油脚料和废弃陶瓷的资源化利用，具有原料成本低，转化细胞密度高，转化效率高(转化率可达40% -60%,较游离的透性化乳酸菌转化高20%左右)，转化过程不易染菌，干扰物质少，产物易分离，菌体可以重复利用等优点。
【附图说明】
[0013]图1为本发明实施例1中多孔陶瓷表面吸附固定嗜酸乳杆菌的扫描电镜图片。
【具体实施方式】
[0014]下面通过实施例并结合附图对本发明作详细说明。
[0015]实施例1。
[0016](I)吸附固定载体的预处理:将废弃陶瓷敲碎，得到直径为4-6 mm的多孔陶瓷颗粒，清水冲洗后，先用0.1 mo I/L HCl溶液浸泡24 h，再用0.1 mo I/L NaOH溶液浸泡24 h，最后用水洗至中性，烘干，灭菌，得到无菌吸附固定多孔陶瓷载体。
[0017](2)制备透性化乳酸菌:从新鲜斜面培养基上挑取3环嗜酸乳杆菌CGMCC1.1854，接种到150 mL MRS培养基中，37°C厌氧培养20 h，即为乳酸菌菌悬液，取菌悬液继续在MRS培养基中扩大培养。将菌悬液4°C，5000 rpm离心20 min，去除上清液，将菌体细胞置于_20°C下冷冻后取出，在室温下融化，反复冻融2次，即得透性化乳酸菌。
[0018](3)吸附固定透性化乳酸菌:将步骤(2)的透性化乳酸菌加入含步骤(I)的无菌吸附固定多孔陶瓷载体的反应管中，然后加入无菌生理盐水浸没载体，再加入0.03%的硫酸铝钾和0.5%的淀粉，透性化乳酸菌细胞浓度达到0.4 g/mL,放入4°C冰箱吸附固定60 min后，4000 rpm，4°C离心10 min，去除上清液，即得吸附固定透性化乳酸菌，多孔陶瓷表面吸附固定嗜酸乳杆菌的扫描电镜图片见附图1。
[0019](4)菜油脚料的乳化、酶解处理:将菜油脚料、Tween 80、Span-80按照1:0.8:0.4比例混合，60°C水浴5 min，再加入适量去离子水至菜油脚料终浓度为80 mg/mL，用混合器混合均匀，121°C灭菌30 min,即为菜油脚料乳化液；取菜油脚料乳化液，加入pH值8.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，添加爪哇毛霉