一种补料发酵提高β-聚苹果酸产量的方法
【技术领域】
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[0001]本发明属于微生物发酵工程技术领域，具体涉及一种采用补料工艺提高出芽短梗霉发酵生产β-聚苹果酸产量的方法。
【背景技术】
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[0002]高分子材料至今已有四十年的研宄历史，上世纪七十年代开始蓬勃发展，高分子材料的研宄无论是在科学上还是在实用价值上都有着非常重要的意义。随着高分子材料的飞速发展，其重要性日益显著的同时，它的不足之处也出现在人们的面前，大部分人工合成高分子材料在自然界中难以降解。在环境日益恶化的今天，人们开始关注高分子材料因不能分解而造成的环境污染问题。随着环保意识的增强，人们把材料的可降解性能的要求逐渐增加，现在对于我们正在使用或处于研发阶段的产品把是否具备可生物降解性作为重要的评价标准。为了解决上述难题，人们开始研宄并制造了各种可降解材料。
[0003]聚苹果酸(PMLA)是一种水溶性脂肪族聚酯类化合物，主链上带有酯基，可以在水环境下自发或发生酶促反应而降解。因为具有这特殊的立体结构，聚苹果酸具备了一些优良的性质，其中包括:生物相容性、高度的水溶性、生物可吸收性、生物可降解性、可化学衍生性和无免疫原性等，聚苹果酸及其衍生物作为一类新型的生物高分子材料而受到人们的高度重视。
[0004]生物法合成聚苹果酸可以利用可再生的生物资源发酵生产，成本低廉，合成条件温和，产物的分子量相对较高，从发酵液中提取纯化步骤简单，通过甲醇或乙醇反复沉淀就可以得到聚苹果酸钙盐。因此生物法合成具有很大优势，但其开发和应用受到了高成本，低效率的制约，目前还没有一个优化的可以工业化生产的路线，只有少量的天然聚苹果酸和人工合成聚苹果酸可以提供。如果能够提高天然聚苹果酸的产量，降低其生产成本，其应用领域将会得到进一步开发。
【发明内容】
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[0005]本发明的主要目的是提供一种补料工艺生产β -聚苹果酸的新方法，该方法通过流加浓度为500g/L的葡萄糖控制发酵液残糖在4g/L-7g/L，同时流加浓度为lg/L_5g/L的氨基酸溶液，所述氨基酸溶液包括天冬氨酸、组氨酸、亮氨酸、苏氨酸中的至少一种，解决分批发酵中聚苹果酸产率较低的问题，显著提高β-聚苹果酸的产率，降低生产成本。
[0006]本发明提供的技术方案具体如下:
[0007]1.培养基的制备
[0008](I)活化培养基为土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA):土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L, pH自然，121 °C高压蒸汽灭菌20min ；
[0009]种子培养基组成为:蔗糖140g/L、酵母膏3g/L、硫酸铵lg/L 丁二酸2g/L、玉米浆lg/L,K2CO30.4g/L,MgSO4.7Η20 0.1g/L、KH2PO41g/L、ZnSO4.7Η20 0.05g/L，其余为水 pH7.0。
[0010]发酵培养基组成为:蔗糖100_200g/L、硝酸钠6g/L、磷酸二氢钾0.1-0.3g/L、氯化钾0.5、硫酸锰0.05-0.lg/L、蛋白胨35g/L、七水合硫酸镁0.3g/L、碳酸钙20g/L。
[0011]2.CGMCC3336菌种活化:菌种转接到PDA斜面培养基上，25°C活化培养3?5d ;
[0012]3.种子液制备:选取生长良好的斜面种子用无菌生理盐水洗下孢子，制备孢子浓度约16个/ml的孢子悬浮液，按10% (v/v)接种量接种至装有10ml液体种子培养基的500ml三角瓶中，25°C，200rpm条件下培养2?3d，制得种子液。
[0013]4.发酵罐发酵:将所得种子液以10% (v/v)的量接于1L发酵罐中进行发酵培养，在控制PH6.0-7.0及溶解氧浓度60% -70%条件下，在含碳源、氮源、无机盐及微量元素的培养基中培养出芽短梗霉CGMCC N0.3336 ;初糖采用蔗糖，发酵36_48h开始流加补料溶液，通过流加500g/L的葡萄糖溶液使发酵液残糖维持在4-7g/L，同时每隔两小时补加浓度为l_5g/L的氨基酸溶液10mL，所述的氨基酸溶液包括天冬氨酸、亮氨酸、组氨酸、苏氨酸中的至少一种，继续发酵96-120h。
[0014]有益效果:
[0015]通过流加补料溶液提高了聚苹果酸的发酵产率，发酵周期内产物得率，降低了成本，将聚苹果酸产量提高11-20%。
【具体实施方式】
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[0016]下面通过具体的实施方案叙述本发明中聚苹果酸的生产方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
[0017]实施例1:连续发酵生产β -聚苹果酸
[0018]按如下步骤发酵生产β -聚苹果酸:
[0019]1.培养基的制备
[0020](I)活化培养基为:土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA):土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L, pH自然，121 °C高压蒸汽灭菌20min ；
[0021]种子培养基组成为:蔗糖140g/L、酵母膏3g/L、硫酸铵lg/L 丁二酸2g/L、玉米浆 lg/L, K2CO30.4g/L、MgSO4.7H20 0.lg/L, KH2PO41 g/L, ZnSO4.7H20 0.05g/L，其余为水，pH7.0o
[0022]发酵培养基组成为:蔗糖150g/L、硝酸钠6g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、氯化钾0.5、硫酸锰0.75g/L、蛋白胨35g/L、七水合硫酸镁0.3g/L、碳酸钙20g/L。
[0023]2.CGMCC3336菌种活化:菌种转接到PDA斜面培养基上，25°C活化培养4d ；
[0024]3.种子液制备:选取生长良好的斜面种子用无菌生理盐水洗下孢子，制备孢子浓度约16个/ml的孢子悬浮液，按10(% v/v)接种量接种装有10ml液体种子培养基的500ml三角瓶中，25°C，200rpm条件下培养2d，制得种子液。
[0025]4.发酵罐发酵:将所得种子液以10% (v/v)的量接于装有5L发酵液的1L发酵罐中进行发酵培养初始转速400r/min，通气量1.0vvm，罐压在0.01-0.1Mpa，容氧串联搅拌控制DO在65%。初始蔗糖浓度150g/L，发酵周期为120h。发酵液中β _聚苹果酸含量为40.81g/Lo
[0026]实施例2:补料发酵生产β -聚苹果酸
[0027]1.培养基的制备:同实施例1
[0028]2.菌种活化:同实施例1
[0029]3.种子液制备:同实施例1
[0030]4.发酵罐发酵:将所得种子液以10% (v/v)的量接于装有5L发酵液的1L发酵罐中进行发酵培养初始转速400r/min，通气量1.0vvm，罐压在0.01-0.1Mpa，容氧串联搅拌控制DO在65%。
[0031]初始蔗糖浓度150g/L，发酵36h开始流加的补料溶液中葡萄糖浓度为500g/L，维持发酵液残糖在4g/L-7g/L，每隔2小时流加一次浓度为1.7g/L的天冬氨酸溶液，每次流加10ml，继续发酵112h。发酵结束发酵液中聚苹果酸含量为45.33g/L?
[0032]实施例3:补料发酵生产β -聚苹果酸
[0033]1.培养基的制备:同实施例1
[0034]2.菌种活化:同实施例1
[0035]3.种子液制备:同实施例1
[0036]4.发酵罐发酵:将所得种子液以10% (v/v)的量接于装有5L发酵液的1L发酵罐中进行发酵培养初始转速400r/min，通气量1.0vvm，罐压在0.01-0.1Mpa，容氧串联搅拌控制DO在62%。
[0037]初始蔗糖浓度150g/L，发酵40h开始流加的补料溶液，其中流加的葡萄糖溶液浓度为500g/L，维持发酵液残糖在4g/L-7g/L，每隔2小时流加一次浓度为lg/L的组氨酸溶液，每次流加10ml，继续发酵112h。发酵结束发酵液中聚苹果酸含量为45.26g/L?
[0038]实施例4:补料发酵生产β -聚苹果酸
[0039]1.培养基的制备:同实施例1
[0040]2.菌种活化:同实施例1
[0041]3.种子液制备:同实施例1
[0042]4.发酵罐发酵:将所得种子液以10% (v/v)的量接于装有5L发酵液的1L发酵罐中进行发酵培养初始转速400r/min，通气量1.0vvm，罐压在0.01-0.1Mpa，容氧串联搅拌控制DO在62%。
[0043]初始蔗糖浓度150g/L，发酵48h开始流加的补料溶液，其中流加的葡萄糖溶液浓度为500g/L，维持发酵液残糖在4g/L-7g/L，每隔2小时流加一次苏氨酸溶液浓度为2.5g/L，每次流加10ml，继续发酵96h。发酵结束发酵液中聚苹果酸含量为46.03g/L?
[0044]实施例5:补料发酵生产β -聚苹果酸
[0045]1.培养基的制备:同实施例1
[0046]2.菌种活化:同实施例1
[0047]3.种子液制备:同实施例1
[0048]4.发酵罐发酵:将所得种子液以10% (v/v)的量接于装有5L发酵液的1L发酵罐中进行发酵培养初始转速400r/min，通气量1.0vvm，罐压在0.01-0.1Mpa，容氧串联搅拌控制DO在62%。
[0049]初始蔗糖浓度150g/L，发酵48h开始流加的补料溶液，其中流加的葡萄糖溶液浓度为500g/L，维持发酵液残糖在4g/L-7g/L，每隔2小时流加一次浓度为4.35g/L的亮氨酸溶液，每次流加10ml，继续发酵112h。发酵结束发酵液中聚苹果酸含量为46.03g/L?
[0050]实施例6:补料发酵生产β -聚苹果酸
[0051]1.培养基的制备:同实施例1
[0052]2.菌种活化:同实施例1
[0053]3.种子液制备:同实施例1
[0054]4.发酵罐发酵:将所得种子液以10% (v/v)的量接于装有5L发酵液的1L发酵罐中进行发酵培养初始转速400r/min，通气量1.0vvm，罐压在0.01-0.1Mpa，容氧串联搅拌控制DO在62%。
[0055]初始蔗糖浓度150g/L，发酵36h开始流加的补料溶液，其中流加的葡萄糖溶液浓度为500g/L，维持发酵液残糖在4g/L-7g/L，每隔两小时流加一次氨基酸溶液，每次10ml，所述氨基酸溶液含有浓度为4.35g/L的亮氨酸，2.5g/L的苏氨酸，lg/L的组氨酸，1.7g/L的天冬氨酸，继续发酵104h。发酵结束发酵液中聚苹果酸含量为49.78g/Lo
【主权项】
1.一种补料发酵生产β -聚苹果酸的方法，其特征在于，将生产菌种进行种子培养后进入发酵培养阶段，发酵培养36-48小时后开始流加补料溶液继续发酵96-120h，通过流加浓度为500g/L的葡萄糖溶液使发酵液残糖维持在4-7g/L，同时每隔两小时补加浓度为l-5g/L的氨基酸溶液10mL。
2.如权利要求所述的一种补料发酵生产β-聚苹果酸的方法，其特征在于，所述的氨基酸溶液包括天冬氨酸、亮氨酸、组氨酸、苏氨酸中的至少一种。
3.如权利要求所述的一种补料发酵生产β-聚苹果酸的方法，其特征在于，所述生产菌株为出芽短梗霉，编号CGMCC N0.3376。
4.如权利要求所述的一种补料发酵生产β-聚苹果酸的方法，其特征在于，发酵阶段具体如下: 将出芽短梗霉CGMCC N0.3336种子液以体积比10%的量接于1L发酵罐中进行发酵培养，在控制ρΗ6.0-7.0及溶解氧浓度60% -70%条件下，发酵36_48h开始流加补料溶液，通过流加500g/L的葡萄糖溶液使发酵液残糖维持在4-7g/L，同时每隔两小时补加浓度为l-5g/L的氨基酸溶液10mL，所述的氨基酸溶液包括天冬氨酸、亮氨酸、组氨酸、苏氨酸中的至少一种，继续发酵96-120h。
【专利摘要】本发明公布了一种补料发酵生产β-聚苹果酸的方法，属于发酵工程技术领域。所述的补料发酵生产方法将生产菌种进行种子培养后进入发酵培养阶段，发酵培养36-48小时后开始流加补料溶液继续发酵96-120h，通过流加浓度为500g/L的葡萄糖溶液使发酵液残糖维持在4-7g/L，同时每隔两小时补加浓度为1-5g/L的氨基酸溶液10mL。上述方法能够提高天然聚苹果酸的产量，降低其生产成本，使β-聚苹果酸产量提高11-20％。
【IPC分类】C12P7-62, C12R1-645
【公开号】CN104561143
【申请号】CN201410833031
【发明人】乔长晟, 范栩嘉, 郝华璇, 于世云
【申请人】天津北洋百川生物技术有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月29日