一种快速深层液态发酵生产乌灵参菌粉的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体设及一种快速利用深层液态发酵技术生产真菌 菌丝体的方法，更确切地说是一种快速深层液态发酵生产乌灵参菌粉的方法。
【背景技术】
[0002] 微生物发酵可分为分批、补料分批、半连续、连续等多种模式。分批发酵的人力、物 力消耗较大，每批发酵都需要进行装料、灭菌、接种、放料、清洗等操作，工序繁琐，发酵周期 较长，生产效率较低;补料分批发酵虽可通过补料补充养分或前体的不足，但是由于有害代 谢产物的不断积累，产物合成最终难免受到阻遏;连续发酵较分批发酵和补料分批发酵生 产强度大大提高，但容易遭受杂菌的污染，菌种易退化，设备投资较大，且发酵产物浓度较 低；半连续发酵过程中，通过放掉部分发酵液再补入新鲜培养基，不仅可W补充养分和前 体，而且代谢有害物被稀释，从而有利于产物的继续合成。
[0003] 半连续发酵工艺的应用可W起到缓解产物抑制和避免代谢副产物积累的作用，改 善了微生物的培养环境，有助于保持菌体活力的稳定，并且对于某些次级代谢产物，其最高 的生产速率仅在某些瞬态条件下才能达到。采用半连续发酵工艺不仅可W使运种瞬态条件 反复出现，而且还可W提高设备的利用率，因此半连续发酵工艺在次级代谢产物的生产方 面有着重要的应用。
[0004] 乌灵参[X^aria nig;ripes(Kl. )Sacc.]属子囊菌亚口（Ascomycotina)、炭角菌目 (Xylariales)、炭角菌科(Xylariaceae)，炭角菌属(Xylaria)。是一传统的药用真菌，学名 黑柄炭角菌，别名乌灵参、鸡纵(丛)蛋，又名震雷子，该菌生长在±栖白蚁废巢中，是一种生 态类型极为特殊的药食两用菌，被世界药用真菌研究、应用领域均视为珍稀、名贵药材，具 有广泛的药用价值。
[0005] 乌灵参，性溫、味甘，具有补气固肾、健脾除湿、镇静安神之功效，主治脾虚少食、产 后及术后失血过多、产后乳少、胃下垂、痛气、屯、惇失眠、小儿惊风及跌打损伤等。
[0006] 传统乌灵参液态发酵工艺多为间隙性的分批发酵工艺，而分批发酵工艺的人力、 物力消耗较大，每批发酵都需要进行装料、灭菌、接种、放料、清洗等操作，工序繁琐，非发酵 周期较长，生产效率较低;而后续的分离工艺传统多用离屯、机进行分离，该方式因受制于离 屯、机分离因子影响，分离过程中菌丝体遭到剪切力破坏，部分有效成分流失到滤液中导致 产品质量和收率下降，分离所得滤液较浑浊，里面含有较多的碎菌丝，导致外排滤液COD偏 高，该滤液若达到污水排放标准，需要经过复杂的污水处理，污水处理系统工作量太大，给 企业带来了严重的经济负担。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是为了解决上述乌灵参菌粉生产的不足，从而设计了一种快速深层 液态发酵生产乌灵参菌粉的绿色新工艺，该工艺采用半连续发酵工艺既能减少了工艺环 节，缩短了非发酵时间，提高了设备利用率，降低了生产成本；同时又采用高效的陶瓷膜过 滤，提高菌丝体的收率，减少进入滤液的菌丝体，降低滤液的COD,降低污水处理量;又不破 坏细胞本身，保证胞内有效成分的全部回收。该发明不但能快速得到高品质的乌灵参的菌 丝体，又提高了分离过程中菌丝体的收率，增加了经济效益;又降低了废水中C0D，减轻了污 水处理系统压力，增加了社会效益。
[0008] 本发明目的主要是通过W下方式实现的：
[0009] -种快速深层液态发酵生产乌灵参菌粉的方法，该方法按照下述步骤进行：
[0010] 1)乌灵参半连续发酵液制备:将乌灵参种子液接种到灭菌后的发酵培养基进行深 层液态发酵得到乌灵参发酵培养液，接种量为10~20% (v/v)，通风比为1:0.1-1 .Ovvm，罐 压0.02~0.05Mpa，在20~30°C下发酵培养2-7天（优选通风比为l:0.5vvm，罐压0.03~ 0.05Mpa，在26~28°C下发酵培养4天)后，放出培养器容积的10-50 % (v/v)的发酵液，补入 等同体积的灭菌后的发酵培养基，继续发酵1-3天;如此不断放料、补料，每次补料继续发酵 1-3天，反复多次，得到乌灵参发酵液，操作周期可W根据次数调整为4-19天;在种子液接种 到灭菌后的发酵培养基之前将乌灵参菌株W常规方法活化后制备得到乌灵参种子液；
[0011] 2)乌灵参发酵液陶瓷膜过滤:将步骤1)中所得的乌灵参发酵液通过微滤膜得到发 酵液的微滤透析液和菌丝体，收集得到菌丝体；
[0012] 3)低溫真空烘干:将步骤2)中所得的菌丝体在真空度为-0.065~-0.095Mpa，70~ 85°C条件下进行干燥。
[0013] 所述的乌灵参种子液是通过W下方法制备得到的：乌灵参种子培养基组成为葡萄 糖1-3%、蛋白腺0.1-1 %、黄豆饼粉0.5-2%、憐酸二氨钟0.1-0.5%、屯水硫酸儀0. Ι? ο. 5 % 、 硫酸锋 0.1-0. 5 % 、 豆油0.01-0 .05 % ; 调节 pH值 5.0-6. 5; 培养条件为:通风比为 1: 0.1-1. Ovvm，罐压0.02~0.05Mpa，培养溫度20~30°C，培养周期2-6天。
[0014] 优选乌灵参种子液是通过W下方法制备得到的：乌灵参种子培养基组成为葡萄糖 2 %、蛋白腺0.5-0.6 %、黄豆饼粉1.5-1.8 %、憐酸二氨钟0.3 %、屯水硫酸儀0.2-0.3 %、硫 酸锋0.25 %、豆油0.02 % ;调节抑值5.5;培养条件为:通风比为1:0.5vvm，罐压0.03Mpa，培 养溫度26~28°C，培养周期4天。
[0015] 所述的乌灵参发酵培养基组成为葡萄糖1-3%、蛋白腺0.1-1 %、黄豆饼粉0.5- 2%、憐酸二氨钟0.1-0.5%、屯水硫酸儀0.1-0.5%、硫酸锋0.1-0.5%、豆油0.01-0.05% ; 调节抑值5.0-6.5。
[0016] 该方法所述的微滤膜为陶瓷膜或有机膜，其孔径在0.05~0.5μπι，操作溫度为50~ 60°C，工作压力:进压为2~4bar，出压为0~化ar。优选微滤膜为陶瓷膜或有机膜，其孔径在 50nm，操作溫度为50~60°C，工作压力：进压为3bar，出压为化ar。
[0017] 本发明适用于任何乌灵参菌种(Xylaria nigripes化1. )Sacc.)，如保藏于中国科 学院微生物研究所，保藏号CGMCC NO. 1038等均可W使用。
[0018] 本发明所采用的乌灵参菌株不限于某个具体生产厂家，市售均可使用。
[0019] 本发明为快速深层液态发酵生产乌灵参菌粉提供了一种新的方法。该方法具有W 下几个突出的优点：
[0020] 1、发酵周期短：传统的分批发酵工艺，每批发酵都需要进行装料、灭菌、接种、放 料、清洗等操作，工序繁琐，非发酵周期长，而采用半连续发酵工艺减少了工艺环节，缩短了 非发酵时间和发酵时间，提高了设备利用率和发酵强度，降低了生产成本。
[0021] 2、提高收率:采用微滤膜孔径0.05~ΙΟμπι，显著提高了菌丝体得率。
[0022] 3、提高产品质量:传统离屯、机分离过程中乌灵参菌丝体遭到剪切力破坏，部分有 效成分流失到滤液中导致菌丝体有效成分降低，该工艺采用微滤膜过滤，操作过程中不会 产生剪切力，有效保证菌丝体有效成分。
[0023] 3、降低滤出液C0D，减轻环保压力：传统邸螺分离由于菌丝体截留率低，部分菌丝 体进入滤液，导致滤液中COD含量增高，本方法分离因子高，对菌丝体截留率大大增加，滤液 澄清，滤液中菌丝体少，得到的透析液COD大大降低，其COD指标可W达到直接排放标准，仅 污水处理每天就为企业减少30吨处理量，大大降低了污水处理费用。
[0024] 4、清洁连续生产，能耗低:本发明方法可连续生产，膜及其配套设备使用寿命长， 装置维护方便，投资少，操作过程无噪声污染，易清洁。
【附图说明】
[0025] 图1为实施例所述传统工艺路线图。
【具体实施方式】
[0026] W下通过具体实施例进一步说明本发明。但实施例的具体细节仅用于解释本发 明，不应理解为对本发明总的技术方案的限定。
[0027] 实施例1
[00%] 1)乌灵参菌株(Xylaria nigripes化1. )Sacc.)由中国科学院微生物研究所提供 并鉴定，保藏编号CGMCC NO. 1038。将培养好的乌灵参菌株种子液种到种子培养基，接种量 是10%，种子培养基组成为葡萄糖2%、蛋白腺0.5%、黄豆饼粉1.5%、憐酸二氨钟0.3%、屯 水硫酸儀0.2 %、硫酸锋0.25%、豆油0.02%;调节pH值5.5。培养条件为：通风比为1: 0.5vvm，罐压0.03Mpa，培养溫度26-28°C，培养4天左右即可得到种子液。将培养好种子液接 种到灭菌后50L发酵培养基，接种量15%，发酵培养基组成为葡萄糖2%、蛋白腺0.6%、黄豆 饼粉