专利名称：利用流加和分段补料的方式发酵生产果聚糖的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵生产果聚糖的方法，特别涉及一种利用流加的方式发酵生产果聚糖(Ievan)的方法。
背景技术：
果聚糖(Ievan)是一种具有广泛用途的胞外多糖，是由果糖残基包在球状结构里组成，以β _2，6糖苷键相连的D-果糖构成的多糖，分子式为(C18H32O16)ntl许多微生物在自然环境中都能产生胞外多聚物(EPS)，果聚糖(Ievan)只不过是被发现的其中一种，这些胞外多聚物多数存在于湍急的小溪中。它们可以保护微生物避免干燥和毒性的侵蚀损害，并且可以储存碳源。果聚糖(Ievan)也可以从商品生产中的细胞碎片中被分离出来。在医药上，果聚糖(Ievan)可用作皮下注射用胆固醇，抗肿瘤、免疫调节剂、抗炎类药物和血浆的替代品。在食品上被用作双呋喃果糖、果糖、低聚果糖，还可用作乳化剂、包封剂、色素和香味剂及脂肪的替代品。Ievan早在100多年前就被发现了，由于它的性质区别于其他多糖，所以引起了人们极大的兴趣。一开始只是用在医学上并且用量很少，因为成本很高，人们致力于大规模生产果聚糖(Ievan)，实现最大经济利益。目前主要是利用运动单胞杆菌和枯草芽孢杆菌发酵生产果聚糖(Ievan)，生长周期较长，一般在24-72个小时，菌种耐受底糖浓度低，转化率低，造成成本较高，给应用推广带来很大阻力。因此，提供一种工艺简单、效果显著的利用流加的方式发酵生产果聚糖(Ievan)的方法，成为该领域技术人员急待着手解决的问题之一。
发明内容
本发明的目的在于克服上述已有技术的不足之处，提供一种高效可行并可降低果聚糖(Ievan)生产成本，减小投资，易于生产应用的利用流加和分段补料的方式发酵生产果聚糖的方法。为实现上述目的本发明所采用的实施方式如下
一种利用流加和分段补料的方式发酵生产果聚糖的方法，其特征在于实施步骤如下
(1)孢子菌悬液的制备将地衣芽孢杆菌TJZKBA10658接种到培养基斜面上，于30°C恒温培养2-4天，加入质量浓度为0. 75%的生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子菌悬液，悬液中孢子含量约为IO5-IO6个，待用；斜面培养基组成包括，单位IL 葡萄糖2g、酵母粉5g、蛋白胨 10g、琼脂15g，用蒸馏水定容至1L，pH值7. 0 ；其中所用菌种地衣芽孢杆菌TJZKBA10658 ；
(2)将上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中，液体种子培养基组成包括，单位IL 蔗糖20-60g、酵母粉4-8g、蛋白胨5-10g，用蒸馏水定容至1L，pH值7. 0 ；将液体种子培养基于121°C、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积百分比5-12%的接种量将孢子菌悬液接入上述冷却的液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于30-40°C、转速为120-200rpm的摇床上培养24小时，得到液体种子；
(3)将上述液体种子用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐培养基组成包括，单位 IL 蔗糖 50-100g、酵母粉 4-8g、蛋白胨 5-10g ;MgS04 0. 1-0. 4g、NaCl 0. 5-2. 0g, K2HPO4 2-4g、KH2PO4 2-4g，MnSO4 0. 2_lg，FeCl2 0. 2_lg，用蒸馏水定容至 3L，pH 值 5. 0-8. 0，将发酵罐培养基于121°C、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积比5-12%的接种量将液体种子接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度30-40°C，溶氧控制在30-40% ；
(4)在发酵10-15个小时后，连续以1.67ml/min的速度勻速流加浓度为30%_50%的蔗糖；或分段补料，每次补300ml浓度为40-60%的蔗糖，间隔3_4个小时补一次，发酵时间为 24-36小时；
(5)发酵结束后，将发酵液6000转/分钟离心15分钟除菌体，取上清液过分子量 6000-8000道尔顿超滤膜，截留液浓缩喷粉，得到果聚糖(Ievan)的产量为200_600g。本发明的有益效果是本发明利用流加的方式发酵生产果聚糖(levan)，可以大大提高底物的利用率，常见的生产果聚糖的方法底物利用率不高，并且产物中大多是小分子果聚糖，但是利用流加和分段补料的方式发酵果聚糖，不但提高了转化率，发酵结束时发酵液中的残糖基本为零，并且得到的基本为大分子levan。本方法不需要复杂的设备，处理方法简单，发酵过程简单易行，大大提高了各种底物的利用率。因此降低了生产成本，利于果聚糖(levan)的开发应用的推广。该方法具有很高的实际应用价值，市场优势非常明显， 且适于工业化生产。
具体实施例方式以下结合实施例，对依据本发明提供的具体实施方式
详述如下 实施例1
(1)孢子菌悬液的制备将地衣芽孢杆菌TJZKBA10658接种到培养基斜面上，于30°C 恒温培养2-4天，加入质量浓度为0. 75%的生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子菌悬液，悬液中孢子含量约为IO5-IO6个，待用；斜面培养基组成包括，单位1L:葡萄糖2g，酵母粉5g，蛋白胨10g，琼脂15g，用蒸馏水定容至1L，pH值7. 0 ；其中所用菌种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) TJZKBA10658 ；
(2)上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中，液体种子培养基组成包括，单位IL 蔗糖60g，酵母粉5g，蛋白胨10g，用蒸馏水定容至1L，pH值7. 0 ；将液体种子培养基于121°C、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积百分比10%的接种量将孢子菌悬液接入上述冷却的液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于35°C、转速为 160rpm的摇床上培养24小时，得到液体种子；
(3)上述液体种子用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐培养基组成包括，单位IL 蔗糖 50g，酵母粉 4g，蛋白胨 IOg5MgSO4 0.2g，NaCl 1.0g,K2HP04 1. 5g, KH2PO4 2. OgjMnSO4 0. 5g，FeCl2 lg，用蒸馏水定容至3L，pH值7. 0，将发酵罐培养基于121°C、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积比10%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度40°C，溶氧控制在30%;
(4)在发酵10个小时后，连续以1.67ml/min的速度勻速流加浓度为30%蔗糖，发酵时间24小时；(5)发酵结束后，将发酵液6000转/分钟离心15分钟除菌体，取上清液过分子量8000 道尔顿超滤膜，截留液浓缩喷粉，得到果聚糖(levan) 263g。实施例2
(1)孢子菌悬液的制备将地衣芽孢杆菌TJZKBA10658接种到培养基斜面上，于30°C 恒温培养2-4天，加入质量浓度为0. 75%的生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子菌悬液，悬液中孢子含量约为IO5-IO6个，待用；斜面培养基组成包括，单位1L:葡萄糖2g，酵母粉5g，蛋白胨10g，琼脂15g，用蒸馏水定容至1L，pH值7.0 ；其中所用菌种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) TJZKBA10658 ；
(2)上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中，液体种子培养基组成包括，单位IL 蔗糖40g，酵母粉4g，蛋白胨6g，用蒸馏水定容至1L，pH值7. 0 ；将液体种子培养基于121°C、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积百分比10%的接种量将孢子菌悬液接入上述冷却的液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于35°C、转速为160rpm 的摇床上培养24小时，得到液体种子；
(3)上述液体种子用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐培养基组成包括，单位IL 蔗糖 100g，酵母粉 5g，蛋白胨 8g ;MgS04 0.3g，NaCl 1. 5g, K2HPO4 2. OgjKH2PO4 3. OgjMnSO4 0. 2g，FeCl2 0. 5g，用蒸馏水定容至3L，pH值6. 5，将发酵罐培养基于121°C、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积比10%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度35 °C，溶氧控制在40%;
(4)在发酵15个小时后，连续以1.67ml/min的速度勻速流加浓度为50%蔗糖，发酵时间36小时；
(5)发酵结束后，将发酵液6000转/分钟离心15分钟除菌体，取上清液过分子量6000 道尔顿超滤膜，截留液浓缩喷粉，得到果聚糖(levan) 585g。实施例3
(1)孢子菌悬液的制备将地衣芽孢杆菌TJZKBA10658接种到培养基斜面上，于30°C 恒温培养2-4天，加入质量浓度为0. 75%的生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子菌悬液，悬液中孢子含量约为IO5-IO6个，待用；斜面培养基组成包括，单位1L:葡萄糖2g，酵母粉5g，蛋白胨10g，琼脂15g，用蒸馏水定容至1L，pH值7. 0 ；其中所用菌种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) TJZKBA10658 ；
(2)上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中，液体种子培养基组成包括，单位IL 蔗糖60g，酵母粉7g，蛋白胨7g，用蒸馏水定容至1L，pH值7. 0 ；将液体种子培养基于121°C、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积百分比10%的接种量将孢子菌悬液接入上述冷却的液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于35°C、转速为160rpm 的摇床上培养24小时，得到液体种子；
(3)上述液体种子用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐培养基组成包括，单位IL 蔗糖 40g，酵母粉 6g，蛋白胨 8g，MgSO4 0. 15g，NaCl 0. 5g, K2HPO4 2. 0g, KH2PO4 2. 5g, MnSO4 lg，FeCl2 0. 2g，用蒸馏水定容至3L，pH值8. 0，将发酵罐培养基于121°C、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积比8%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度 37 °C，溶氧控制在30%;
(4)在发酵13个小时后，开始分段补料，每3个小时补一次，每次补300ml浓度为40%的蔗糖溶液，共补4次，发酵25个小时结束；
(5)发酵结束后，将发酵液6000转/分钟离心15分钟除菌体，取上清液过分子量8000 道尔顿超滤膜，截留液浓缩喷粉，得到果聚糖(Ievan) 283 g。实施例4
(1)孢子菌悬液的制备将地衣芽孢杆菌TJZKBA10658接种到培养基斜面上，于30°C 恒温培养2-4天，加入质量浓度为0. 75%的生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子菌悬液，悬液中孢子含量约为IO5-IO6个，待用；斜面培养基组成包括，单位1L:葡萄糖2g，酵母粉5g，蛋白胨10g，琼脂15g，用蒸馏水定容至1L，pH值7. 0 ；其中所用菌种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) TJZKBA10658 ；
(2)上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中，液体种子培养基组成包括，单位1L:蔗糖50g，酵母粉8g，蛋白胨5g，用蒸馏水定容至lL，pH值7.0 ；将液体种子培养基于121°C、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积百分比10%的接种量将孢子菌悬液接入上述冷却的液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于35°C、转速为160rpm 的摇床上培养24小时，得到液体种子；
(3)上述液体种子用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐培养基组成包括，单位IL 蔗糖 50g，酵母粉 8g，蛋白胨 IOg ;MgS04 0.2g，NaCl 1.0g,K2HP04 3. OgjKH2PO4 3. OgjMnSO4 0. 4g、FeCl2 0. 6g，用蒸馏水定容至3L，pH值7. 5，将发酵罐培养基于121°C、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积比12%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度40°C，溶氧控制在40%，发酵时间30小时；
(4)在发酵11个小时后，开始分段补料，每3个小时补一次，每次补300ml浓度为35% 的蔗糖溶液，共补5次，发酵25个小时结束；
(5)发酵结束后，将发酵液6000转/分钟离心15分钟除菌体，取上清液过分子量6000 道尔顿超滤膜，截留液浓缩喷粉，得到果聚糖(Ievan) 365 g。本发明克服了目前现有技术的底糖浓度高，底物利用率低等不足之处，在一定程度上的资源浪费提供了一种高效可行并可降低果聚糖(Ievan)生产成本，减小投资，易于生产应用的利用流加和分段补料的方式发酵生产果聚糖的方法。上述参照实施例对利用流加和分段补料的方式发酵生产果聚糖(Ievan)的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可根据所限定范围例举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
权利要求
1. 一种利用流加和分段补料的方式发酵生产果聚糖的方法，其特征在于实施步骤如下(1)孢子菌悬液的制备将地衣芽孢杆菌TJZKBA10658接种到培养基斜面上，于30°C恒温培养2-4天，加入质量浓度为0. 75%的生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子菌悬液，悬液中孢子含量约为IO5-IO6个，待用；斜面培养基组成包括，单位IL 葡萄糖2g、酵母粉5g、蛋白胨 10g、琼脂15g，用蒸馏水定容至1L，pH值7. 0 ；其中所用菌种地衣芽孢杆菌TJZKBA10658 ；(2)将上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中，液体种子培养基组成包括，单位IL 蔗糖20-60g、酵母粉4-8g、蛋白胨5-10g，用蒸馏水定容至1L，pH值7. 0 ；将液体种子培养基于121°C、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积百分比5-12%的接种量将孢子菌悬液接入上述冷却的液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于 30-40°C、转速为120-200rpm的摇床上培养24小时，得到液体种子；(3)将上述液体种子用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐培养基组成包括，单位 IL 蔗糖 50-100g、酵母粉 4-8g、蛋白胨 5-10g ;MgS04 0. 1-0. 4g、NaCl 0. 5-2. 0g, K2HPO4 2-4g、KH2PO4 2-4g，MnSO4 0. 2_lg，FeCl2 0. 2_lg，用蒸馏水定容至 3L，pH 值 5. 0-8. 0，将发酵罐培养基于121°C、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积比5-12%的接种量将液体种子接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度30-40°C，溶氧控制在30-40% ；(4)在发酵10-15个小时后，连续以1.67ml/min的速度勻速流加浓度为30%_50%的蔗糖；或分段补料，每次补300ml浓度为40-60%的蔗糖，间隔3_4个小时补一次，发酵时间为 24-36小时；(5)发酵结束后，将发酵液6000转/分钟离心15分钟除菌体，取上清液过分子量 6000-8000道尔顿超滤膜，截留液浓缩喷粉，得到果聚糖Ievan的产量为200_600g。
全文摘要
本发明涉及一种利用流加和分段补料的方式发酵生产果聚糖的方法，实施步骤如下(1)孢子菌悬液的制备；(2)将上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中，得到液体种子；(3)将上述液体种子用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，按照体积比5-12%的接种量将液体种子接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度30-40℃，溶氧控制在30-40%；(4)在发酵10-15个小时后，连续以1.67ml/min的速度匀速流加浓度为30%-50%的蔗糖；或分段补料，发酵时间为24-36小时；(5)发酵结束后，将发酵液6000转/分钟离心15分钟除菌体，取上清液过分子量6000-8000道尔顿超滤膜，截留液浓缩喷粉，得到果聚糖(levan)的产量为200-600g。本发明工艺简单，成本低，效果非常显著。
文档编号C12R1/10GK102329830SQ20111017043
公开日2012年1月25日 申请日期2011年6月23日 优先权日2011年6月23日
发明者刘云, 刘晓鸥, 国华, 墨玉欣, 孙溪, 徐勇虎, 李睿颖, 王晓琼, 王永乐, 胡娅君, 范婷, 韩慧 申请人:天津实发中科百奥工业生物技术有限公司