专利名称：一种通过发酵补料培养分批培养提高酶活力的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过发酵补料培养分批培养提高酶活力的方法。
背景技术：
19世纪末，从丙烯酰氯与氨首次合成了丙烯酰胺。1954年，美国氰氨公司采用丙烯腈硫酸水解工艺进行工业生产。1972年，日本三井东压化学公司首先建立了骨架铜催化丙烯腈水合制丙烯酰胺的工业装置，此后各国相继开发了不同类型的催化剂，采用此项工艺进行工业生产。80年代，日本日东化学工业公司实现了用生物催化剂由丙烯腈制丙烯酰胺的工业生产。微生物法是利用生物技术培养出的细胞体作为酶催化剂，在适宜的条件下
催化丙烯腈合成丙烯酰胺。微生物催化法生产丙烯酰胺的关键是制备高活力的腈水合酶。腈水合酶活力的提高，有利于丙烯腈向丙烯酰胺反应方向进行，降低丙烯酰胺生产成本，提高生产效率，对微生物法生产丙烯酰胺工业的发展有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在是提供一种通过发酵补料培养分批培养提高酶活力的方法，提高发酵获得的腈水合酶的活性，从而促进后续水合生产丙烯酰胺。为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为一种通过发酵补料培养分批培养提高酶活力的方法，其特征在于包括以下步骤
1)种子培养将诺卡氏菌用固体培养基在28°C培养箱中活化90-120 h,挑接菌落于三角瓶中进行种子培养，将三角瓶置于温度设定为28±2°C、转速为150-200 r/min的摇床中培养48 h ；
2)补料分批发酵将5%种子液接种于发酵培养基中进行补料分批发酵培养，发酵条件为发酵培养使用2. 5L的自动控制发酵罐，发酵体积为1.2 L，发酵温度28±2°C，搅拌转速150-200 r/min，通气量为35-40 L/min，pH值和溶解氧由发酵罐控制单元控制，在发酵过程中，向发酵培养基中补加碱液和葡萄糖，满足菌体生长和腈水合酶合成营养的需要，延长菌体生长时间，培养40-50h后发酵结束，测菌体酶活。进一步地，所述的固体培养基成分为葡萄糖20 g/L、磷酸氢二钾0. 5 g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨5 g/L、硫酸镁0. lg/L、味精lg/L、磷酸氢二钾0. 5g/L，尿素7g/L，琼脂20 g/L0进一步地，所述的发酵培养基成分为葡萄糖25 g/L、酵母膏5 g/L、尿素8g/L、味精I. 5 g/L、磷酸二氢钾0. 8/L、磷酸氢二钾0. 8 g/L、硫酸镁I. Og/L、消泡剂150ppm。进一步地，所述的碱液补加工艺为当发酵液的pH小于6时，通过补加碱液使发酵液pH值维持在6. 0-7.0。进一步地,所述的碱液为氢氧化钠或氨水,所述的pH值为6. 5。进一步地，所述的碱液为氨水。进一步地，所述的补糖工艺为在发酵中后期，通过补加150_180g/L的葡萄糖溶液使其浓度保持在6-15g/L。本发明的有益效果采用本发明在发酵过程中，通过向发酵培养基中补加碱液和葡萄糖，满足菌体生长和腈水合酶合成营养的需要，不仅能延长菌体生长时间，而且使诺卡氏菌产酶水平有了较大的提高，该工艺的酶活达到2934. 6U/ml为分批发酵的9. 3倍，补料方式简单易行，便于操作。
具体实施方式
实施例I分批发酵对照试验 (I)固体培养基
葡萄糖20 g/L、磷酸氢二钾0. 5 g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨5 g/L、硫酸镁0. lg/L、味精lg/L、磷酸氢二钾0. 5g/L,尿素7g/L,琼脂20 g/L。
(2)发酵培养基
葡萄糖25 g/L、酵母膏5 8/1、尿素88/1、味精1.5 g/L、磷酸二氢钾0.8/L、磷酸氢二钾
0.8 g/L、硫酸镁 I. Og/L、消泡剂 150ppm。(3)种子培养
将诺卡氏菌用固体培养基在28 °C培养箱中活化90-120 h,挑接菌落于三角瓶中进行种子培养，将三角瓶置于温度设定为28±2°C、转速为150-200 r/min的摇床中培养48h ；
(4)分批发酵培养
腈水合酶发酵制备在2. 5 L自动控制发酵罐中进行，发酵条件为发酵体积为I. 2 L，发酵温度28±2°C，搅拌转速150-200 r/min，通气量为35-40 L/min。(5)发酵结果
发酵进行40h后结束，酶活为314. 56U/ml。实施例2补料分批发酵
(I)(2) (3)步骤同实施例I
(4)补料发酵培养
以5%的接种量接入发酵培养基，发酵培养使用2. OL发酵罐，装液量I. 2L，发酵温度28±2°C，搅拌转速150-200 r/min，通气量为35-40 L/min。当发酵培养基中溶液pH小于
6.5时，补加2%的氨水维持发酵液pH在6. 5，在发酵中后期，补加180g/L的葡萄糖溶液使其浓度保持在6-15g/L。(5)发酵结果
发酵进行50h后结束，与对照分批发酵延长了 10h，补料分批式培养的菌体酶活达到2934. 6 U/ml，为分批发酵的9. 3倍。
权利要求
1.一种通过发酵补料培养分批培养提高酶活力的方法，其特征在于包括以下步骤 1)种子培养将诺卡氏菌用固体培养基在28°C培养箱中活化90-120 h,挑接菌落于三角瓶中进行种子培养，将三角瓶置于温度设定为28±2°C、转速为150-200 r/min的摇床中培养48 h ； 2)补料分批发酵将5%种子液接种于发酵培养基中进行补料分批发酵培养，发酵条件为发酵培养使用2. 5L的自动控制发酵罐，发酵体积为I. 2 L,发酵温度28±2°C，搅拌转速150-200 r/min，通气量为35-40 L/min，pH值和溶解氧由发酵罐控制单元控制，在发酵过程中，向发酵培养基中补加碱液和葡萄糖，满足菌体生长和腈水合酶合成营养的需要，延长菌体生长时间，培养40-50h后发酵结束，测菌体酶活。
2.根据权利要求书I种子培养基，其特征在于固体培养基成分为葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾0.5 g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨5 g/L、硫酸镁0. lg/L、味精lg/L、磷酸氢二钾0. 5g/L，尿素 7g/L，琼脂 20 g/L。
3.根据权利要求书I所述的一种通过发酵补料培养分批培养提高酶活力的方法，其特征在于所述的发酵培养基成分为葡萄糖25 g/L、酵母膏5 8/1、尿素88/1、味精1.5 g/L、磷酸二氢钾0. 8/L、磷酸氢二钾0. 8 g/L、硫酸镁I. Og/L、消泡剂150ppm。
4.根据权利要求书I所述的一种通过发酵补料培养分批培养提高酶活力的方法，其特征在于所述的碱液补加工艺为当发酵液的PH小于6时，通过补加碱液使发酵液pH值维持在 6. 0-7.0。
5.根据权利要求书4所述的一种通过发酵补料培养分批培养提高酶活力的方法，其特征在于所述的碱液为氢氧化钠或氨水，所述的pH值为6. 5。
6.根据权利要求书5所述的一种通过发酵补料培养分批培养提高酶活力的方法，其特征在于所述的碱液为氨水。
7.根据权利要求书I所述的一种通过发酵补料培养分批培养提高酶活力的方法，其特征在于所述的补糖工艺为在发酵中后期，通过补加150-180g/L的葡萄糖溶液使其浓度保持在6-15g/L。
全文摘要
本发明涉及一种通过发酵补料培养分批培养提高酶活力的方法。在发酵过程中，通过向发酵培养基中补加碱液和葡萄糖，满足菌体生长和腈水合酶合成营养的需要，不仅能延长菌体生长时间，而且使诺卡氏菌产酶水平有了较大的提高，该工艺的酶活达到2934.6U/ml为分批发酵的9.3倍，补料方式简单易行，便于操作。
文档编号C12R1/365GK102776168SQ20121025162
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月20日 优先权日2012年7月20日
发明者丁建华, 曹艳, 杨涛, 沈瑞华, 熊光辉, 钱小方, 顾稀平 申请人:江苏南天农科化工有限公司